全 文 ：·研究原著· 文章编号:1000-2790(2003)19-1745-03
当归酰天芥菜定对 L1210 ,HepG2和 HCC细胞的抑制作用
王跃虎 ,王建华 (西北农林科技大学动物科技学院 ,陕西 杨凌 712100)
收稿日期:2003-01-09; 修回日期:2003-04-03
基金项目:中国杨凌农业高技术产业示范区科研专项经费资助项目
(1999KG13)
通讯作者:王建华.Tel.(029)7092595 Email.jhw ang1948@sina.com
作者简介:王跃虎(1970-),男(汉族),云南省威信县人.硕士生(导师
王建华),兽医师.现中科院昆明植物研究所攻读博士学位.Tel.
13002960291 Email.yuehu_w ang @sina.com
Inhibitory effects of angeloyl-heliotri-
dine on L1210 , HepG2 and HCC cells
WANG Yue-Hu , WANG Jian-Hua
College of Animal Science and Technology , Nor thwest Sci-Tech
University of Agriculture and Fo restry , Yangling 712100 , China
【Abstract】AIM:To study the anti-tumor activity and its mech-
anism of angeloyl-hel iotridine(AH).METHODS:The inhibitory
effects of AH on L1210 cells were analyzed by drawing up their
diagram of growing curves.Growth inhibition of L1210 , HepG2
and HCC cells was measured by microculture tetrazolium
(MTT)assay.The cell cycle of L1210 cells was tested by flow
cytometry(FCM).RESULTS:The slopes of growing curves
and the maximums of growing density of L1210 cells exposed to
AH decreased.When exposed to AH 80 mg·L-1 , the inhibitory
rate of L1210 cells was 18.18% and exposed to AH 320 mg·
L-1 , the inhibitory rates of HepG2 and HCC cells were 12.28%
and 10.24% respectively.FCM indicated that L1210 cells in G2-
Mphase increased significantly (P <0.01)following 24-hour
exposure to AH 80 mg·L-1.CONCLUSION:AH exerts some
inhibitory effects on L1210 cells and blocks L1210 cells in G2-M
phase of cell cycle.AH has relatively weak inhibitory effects on
HepG2 and HCC cells.
【Keywords】 angeloyl-heliotridine;L1210 cells;HepG2 cells;
HCC cells;MTT assay;FCM;cell cycle
【摘 要】目的:研究当归酰天芥菜定(AH)的抗肿瘤活性及
机制.方法:通过细胞生长曲线的绘制 , 分析AH 对 L1210细胞
的抑制作用;通过 M TT 比色法 , 测定 AH 对 L 1210 , HepG2 和
HCC细胞的抑制率;通过流式细胞术(FCM)检测 AH 对 L1210
细胞周期的影响.结果:在 AH 作用下 , L1210细胞生长曲线斜
率和最大生长密度降低.AH 80 mg·L -1对 L1210细胞的抑制
率为 18.18%;AH 320 mg·L-1对 HepG2 和 HCC 细胞抑制率
分别为 12.28%和 10.24%.FCM 检测表明 , AH 80 mg·L-1
作用 24 h 后 , L 1210细胞的 G2-M 期细胞明显增加(P <0.01).
结论:AH 对 L1210细胞有一定的抑制作用 , 对 HepG 2 和 HCC
细胞抑制作用较差.AH 对 L1210细胞的抑制作用发生在细胞
周期的 G2-M 期.
【关键词】当归酰天芥菜定;L1210细胞;HepG2 细胞;HCC 细
胞;M TT 法;流式细胞术;细胞周期
【中图号】R285.5 【文献标识码】A
0 引言
菊科狗舌草属植物狗舌草(Tephroseris kirilowii
Turcz.Holub.)在民间被用于治疗白血病[ 1] .陈进
军[ 2]研究发现 ,狗舌草 600 mL·L-1乙醇提取物对
L1210细胞有抑制作用 ,并推断该作用可能来自狗舌草
中含有的生物碱等成分.为了进一步弄清狗舌草的
有效成分 ,我们对狗舌草的生物碱成分进行了分离和
鉴定(其结果即将刊登于西北农林科技大学学报),并
研究了狗舌草中主要生物碱当归酰天芥菜定(An-
geloyl-heliotridine , AH)对白血病 L1210及肝癌 HepG2
和 HCC细胞的作用 ,现报告如下.
1 材料和方法
1.1 材料 植物材料狗舌草于 1999-08采自陕西省
陇县关山牧场 ,经西北农林科技大学生命科学学院植
物研究所高级实验师杨金祥予以鉴定.经过溶剂萃
取 、硅胶柱层析和制备性薄层层析从狗舌草中分离得
到 AH;薄层层析(TLC)和气相色谱-质谱联用(GC-
MS)检测 , AH 为纯净的单体化合物;质谱(MS)、红
外光谱(IR)及核磁共振碳谱(13C NMR)对 AH 的结
构进行了确认(Fig 1).L1210 ,HepG2 和 HCC 细胞由
第四军医大学实验动物中心提供.酶联免疫检测仪 ,
DG5031型 ,国营华东电子管厂;流式细胞仪 , Epics
ELITE ESP 型 ,Coulter公司.MTT 和 DMSO ,Sigma
产品;RPM I 1640培养基 ,Gibco 产品;其余试剂为国
产分析纯.
图 1 当归酰天芥菜定(AH)的结构
Fig 1 Structure o f angeloyl-heliotridine(AH)
1745第四军医大学学报(J Fourth M il Med Univ)2003;24(19)
1.2 方法
1.2.1 生长曲线绘制 取对数生长期的 L1210细胞
调密度至 6×106·L-1 ,接种于培养瓶内 ,50 mL·L-1
CO2 , 37℃培养.24 h 后加入用生理盐水稀释的 AH ,
使其终浓度分别为 40 , 80 , 160和320 mg·L-1 ,另设
一个生理盐水对照组.重复1次.从加药之日起连续
记数 7 d ,绘制出生长曲线.
1.2.2 MTT 法测抑制率 将 L1210细胞调密度至 1
×106·L-1 , 96 孔培养板每孔加入细胞 120 μL ;
HepG2 细胞调密度至 5×108·L-1 ,每孔加入 200 μL;
HCC细胞调密度至 5×107·L-1 ,每孔加入 200 μL.
培养 24 h 后 ,加入 AH ,使其终浓度分别为 80 , 160
和320 mg·L-1 ,每种细胞 、每个浓度平行处理 3 孔 ,
另设生理盐水对照组及只加培养液不加细胞的调零
孔.培养 2 d后 ,加入 5 g·L -1 MTT ,每孔 20 μL ,再
培养 4 h后 ,小心抽出培养液 ,加入200μL DMSO ,振
荡 ,10 min 后 , 490 nm 酶联免疫仪比色 ,经调零孔调
零 ,测吸光度(A)值.抑制率(%)=[(对照组 A 值-
实验组 A 值)/对照组 A 值] ×100%.
1.2.3 流式细胞术(FCM)检测细胞周期 取对数
生长期的 L1210细胞 5×105 个 ,用培养液配为 9 mL ,
培养 24 h后 ,加入 1 mL AH ,AH 终浓度为 80 mg·
L-1 ,继续培养.24 h后 ,将细胞离心 ,PBS 洗涤 2次 ,
700 mL·L-1冷乙醇固定 , 4℃冰箱过夜.送检前用
PBS洗 2次 ,DNA prep kit 染色 20 min ,流式细胞仪
检测.每个样品计数2×105 个细胞 ,经Phoenix Mul-
ticycle 3.11软件处理.
统计学处理:以上各方法所得数据 ,在判断试验
组和对照组差异是否显著时 ,采用 t 检验进行处理.
2 结果
AH各浓度组的生长曲线均在生理盐水组右下
方 ,斜率和最大生长密度降低 ,显示了 AH 对 L1210细
胞的抑制作用(Fig 2).利用 MT T 法测得生理盐水
对照组及 AH 各浓度组的 A 值和抑制率(Tab 1),对
L1210细胞 ,AH 80 , 160及 320 mg·L-1与生理盐水对
照组的 A 值差异极显著(P <0.01),其抑制率分别
为18.18%, 26.02%和 18.18%;对 HepG2 及 HCC
细胞 ,AH 80 mg·L-1和 160 mg·L-1与对照组无显著
差异 ,320 mg·L-1与对照组差异极显著(P<0.01),
该浓度对 HepG2和 HCC细胞抑制率分别为 12.28%
和 10.24%.AH 80 mg·L-1作用 24 h后 , L1210细胞
与对照组相比 , G2-M 期细胞增多(P <0.01),出现
G2-M 周期阻滞(Fig 3 , 4).
图 2 加入AH 后 L1210细胞生长曲线
Fig 2 Grow ing curves of L1210 cells exposed to AH
表 1 AH 对肿瘤细胞的抑制率
Tab 1 Grow th inhibition(GI)of tumor cells exposed to AH
(n =3 , x±s , %)
G roup L1210 HepG2 HCC
Control 0.319±0.037 1.140±0.042 0.840±0.046
80 mg·L-1 A 0.261±0.015a 1.125±0.032 0.818±0.067
G I 18.18 1.32 2.62
160 mg·L-1 A 0.236±0.004a 1.146±0.043 0.810±0.024
G I 26.02 / 3.57
320 mg·L-1 A 0.261±0.027a 0.907±0.055a 0.754±0.020a
G I 18.18 12.28 10.24
aP<0.01 vs contro l.
图 3 对照组 L1210细胞的细胞周期
Fig 3 Cell cycle of L1210 in control
3 讨论
从以上结果可看出 ,AH 对 L1210细胞有一定的抑
制作用 ,80 mg·L-1浓度可产生作用.AH 对 HepG2
和 HCC细胞抑制作用较差 ,只在浓度 320 mg·L-1
1746 第四军医大学学报(J Four th M il Med Univ)2003;24(19)
图 4 AH 80 mg·L-1组 L1210细胞的细胞周期
Fig 4 Cell cycle o f L1210 exposed to AH 80 mg·L-1
时才有作用.实验证实了 AH 是狗舌草抗白血病细
胞的有效成分之一.
在细胞生长周期中 ,存在着两个调节细胞周期正
常进行的关键点 ,即 G1-S 和G2-M 期 ,肿瘤细胞抑制
剂通常在这两个时期对肿瘤细胞发挥抑制作用 ,如杀
尔威辛(Salvicine)对 K562细胞[ 3] 、Cyclin D1反义核
酸对 A375 细胞[ 4] 、木黄酮(Genistein)对人垂体腺瘤
细胞[ 5] 及全反式维甲酸(All-t rans retinoic acid)对
SMMC-7721细胞[ 6] 和 QBC939 细胞[ 7]的抑制作用
发生在 G1-S 期 ,而姜黄素(Curcumin)可将 SMMC-
7721细胞和人口腔鳞癌细胞阻断在 S/G2-M 期[ 8] ,
逆转录酶抑制剂(AZT)阻断 HO-8910细胞于 G2-M
期[ 9] .本研究发现 ,AH 对 L1210细胞生长周期的阻滞
发生在 G2-M 期 ,这可能是其抑制 L1210细胞生长的
作用机制.
从结构上讲 , AH 属于双稠吡咯啶生物碱
(Py rrolizidine alkaloids , PAs),部分 PAs具有抗肿瘤
活性和肝脏毒性.当 PAs具有大环双酯结构和烯丙
醇酯结构时 ,毒性较大 ,而 AH 不具有这样的结构 ,预
计其毒性较小 ,确切情况尚须研究证实.
【参考文献】
[ 1] The National W rit ing Group of Chinese Herbal M edicine Compila-
tion.National Chinese herba l medicine com pi lation [ M] .Beijing:
Renmin Weisheng Chubanshe (People s Medical Publishing
House), 1973:557.
[ 2] Chen JJ.Studies on pharmacological effect s and toxicity of ext rac-
tion f rom Tephroseris kirilow ii Turcz.Holub.against L1210 cell line
[ D] .Xi an:Northw est Sci-Tech Universi ty of Ag riculture and
Forest ry , 2001.
[ 3] Qing C , Zhang JS , Ding J.In vi tro cytotoxicity of Salvicine , a
novel di terpenoid quinone [ J] .Acta Pharmacol S in , 1999;20
(4):297-302.
[ 4] Wang XL , Tian ML , Wang M , Zhu HM , Yang XJ , Wang YL ,
Song TB.Anti sense oligonucleot ide inhibit s the grow th of human
melanoma cells and influences it s cycle [ J] .J X i an Jiaotong Univ
(Med S ci), 2002;23(4):342-343.
[ 5] C hi SM , Zhou SS , Liu YL , Gu JW , Wang FZ.Inhibitory role of
genistein in proliferat ion of human pituitary adenoma cells [ J] .Di-
si Ju nyi Daxue X uebao(J Four th Mi l Med U niv), 2001;22(3):
197-200.
[ 6] Wu T , Dou KF , Li KZ.Ef fect s of all-t rans retinoic w ith pheny-
lacete nat rium on human HCC cell line [ J] .Di-si Junyi Da xue
X uebao(J Four th Mil Med Univ), 2002;23(9):783-785.
[ 7] Wu T , Dou KF , Li KZ.All-t rnas ret inoic acid-induced apoptosis in
human cholangiocarcinoma cell line [ J] .Di-si Junyi Daxue X uebao
(J Fourth Mi l Med U niv), 2002;23(14):1284-1286.
[ 8] Xue Y , Xia T , Zhao JB, Wu SH , Zhang ZH , Wang ZR.Curcumin
inhibits human hepatocarcinoma cell line SMMC-7721 [ J] .Di-si
Junyi Daxue Xuebao(J Fourth Mi l Med Univ), 2000;21(5):84
-86.
[ 9] Li HM , Xin XY , Du H , Wang J , Wang DT .AZT inhibi ts telom-
erase activity of tumor cells [ J] .Di-si Junyi Da xue X uebao (J
Fou rth Mi l Med U niv), 2001;22(2):122-124.
编辑 许昌泰
《第二军医大学学报》征订启事
·第二届国家期刊奖百种重点期刊 ·中国基础医学类核心期刊
·中国科学引文数据库统计源期刊 ·中国综合性医药卫生类核心期刊
·中国学术期刊综合评价数据库统计源期刊 ·中国科技论文统计源期刊
·美国《化学文摘》(CA)等国内外权威数据库收录期刊 ·俄罗斯《文摘杂志》(AJ)源期刊
《第二军医大学学报》是由第二军医大学主办的国内外公开发行的综合性医药卫生类学术期刊 ,主要报道基础医学 、临床医
学 、预防医学 、军事医学 、药学和祖国医学等领域达到国内领先及国际水平的最新科研成果 、新理论 、新技术和新经验 , 读者对象
主要为从事医药卫生工作的中高级科研 、医疗 、教学 、管理人员和高等医药院校的师生。
《第二军医大学学报》为月刊 ,国际标准大 16 开本 , 80克铜版纸彩色双胶印刷 , 正文 116 页 。国内统一刊号:CN31-1001/ R ,
国际标准刊号:ISSN 0258-879X。请及时向当地邮局订阅(邮发代号 4-373), 漏订者可来函本刊编辑部办理邮购 ,免收邮寄费(邮
局汇款 ,请勿电汇)。每期定价 10 元 , 全年共 120 元 ,合订本 140 元。
地址:上海翔殷路 800 号 《第二军医大学学报》编辑部 邮编:200433
联系人:商素芳 电话:(021)25074344 , 25074340 转 824 分机
Http:// dejydxxb.periodicals.net.cn E-mail:bxue@smmu.edu.cn
1747第四军医大学学报(J Fourth M il Med Univ)2003;24(19)