全 文 ：·技术与方法·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(12):70-74
肿 瘤 坏 死 因 子（Tumour necrosis factor，TNF），
又叫恶病质因子（Cachectin）［1］。TNF 按其结构分
两型 ：TNF-α 和 TNF-β。TNF-α 参与的多种致病机
制，包括内皮细胞的激活、细胞因子的诱导、白细
胞的聚集、破骨细胞的活化与软骨的破坏等［2］导
致炎症反应持续发生、软骨与骨的渐进性破坏［2-4］。
黏附分子是一类介导细胞与细胞间或细胞与基质间
相互作用的分子。白细胞表面黏附分子（E-Selectin）、
白 细 胞 细 胞 间 黏 附 分 子 -1（Intercellular adhesion
molecule-1，ICAM-1）和血管细胞黏附分子 -1（Vas-
cular celladhesion molecule-1，VCAM-1）属于免疫球
蛋白超家族成员。研究认为，VCAM-1 和 ICAM-1 在
介导的炎症发生过程中起到了极其重要的作用［5，6］，
其中在病变形成早期和进展期，黏附分子促进内皮
收稿日期 ：2015-04-20
基金项目 ：广东省引进创新科研团队计划资助（201101Y0104990178）
作者简介 ：陈坤，女，硕士研究生 ；研究方向 ：单抗生物药研发 ；E-mail ：chenkun@hecpharm.com
通讯作者 ：杨彬，男，硕士研究生，职称 ：研究方向 ：生物制药，单抗生物药研发 ；E-mail ：yangbin@hecpharm.com
基于 HUVEC 细胞表面 ELAM-1 表达的抗 TNF-α 抗体
活性检测方法
陈坤  徐军  谢灿  周冬梅  杨彬  孙文正
（广东东阳光药业有限公司，东莞 523867）
摘 要 ： 旨在建立抗 TNF-α 单克隆抗体生物学活性测定的方法。肿瘤坏死因子 TNF-α 能刺激人脐静脉内皮细胞 HUVEC 表
达黏附分子 ELAM-1，通过抗 TNF-α 抗体中和 TNF-α 来抑制这种表达，从而建立该抗体的生物学活性检测方法，并进行验证。结
果表明，建立抗体活性检测方法，验证方法的特异性较好、回收率为 92.1%-102.1%，方法重复 12 次，RSD 为 7.66%。在 50%-
150% 的线性良好，相关系数为 0.99。该活性检测方法适于抗体体外活性的检测。
关键词 ： 单克隆抗体 ；HUVEC 细胞 ；ELAM-1 ；肿瘤坏死因子 TNF-α
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.12.010
A Method for the Activity Assay of Anti-TNF-α Antibodies Expressed
by ELAM-1 in HUVEC Surface
Chen Kun Xu Jun Xie Can Zhou Dongmei Yang Bin Suen Wenzheng
（Sunshine Lake Pharma Co.，Ltd，Dongguan 523867）
Abstract: This study is to develop a method to assay the biologic activity of anti-TNF-α（tumor necrosis factor-alpha）monoclonal
antibodies. TNF-α stimulates the expression of adhesion molecules E-Selectin（ELAM-1）in human umbilical vein endothelial cells（HUVEC）,
whereas anti-TNF-αantibodies suppress the expression of ELAM-1 in HUVEC cells through neutralizing TNF-α. Based on this principle,
we developed and validated a method for the bioactivity assay of the antibodies. The result showed that the assay method was established
successfully, and the specificity of the method was validated to be feasible. The recovery rate was 92.1%-102.1%, and the RSD was ≦ 7.66%
while repeated 12 times. The linear range in 50% to 150% was fine, and the correlation coefficient was 0.99. Conclusively, this method is well
suited as an activity assay of antibodies in vitro.
Key words: monoclonal antibody ；HUVEC cell ；ELAM-1 ；TNF-α
2015,31(12) 71陈坤等：基于HUVEC 细胞表面 ELAM-1 表达的抗 TNF-α抗体活性检测方法
黏附、迁移并与其他细胞作用，在整个病变过程中
起到了关键性的作用［7.8］。
近些年来，针对 TNF-α 的药物研究倍受关注，
其中中和 TNF-α 的抗体生物药成为研究热点。生物
药结构复杂，理化分析不能完全诠释它的功能与活
性，所以在研究生产中，建立简单准确的活性分析
方法十分必要。针对 TNF-α 抗体的常用活性分析方
法为 TNF-α 诱导 L929 细胞毒性实验，鉴于单抗生
物药的特殊性，单一检测方法不够科学，采用多种
体外活性试验方法评价生物药的生物活性显得越来
越重要。虽然，国内外有不少文献资料［5-10］报道可
以用 HUVEC 细胞检测抗 TNF-α 抗体活性，但还没
有文章对该检测方法有详细、系统的描述。本研究
采用 TNF-α 刺激 HUVEC 细胞产生白细胞黏附因子
（ELAM-1），通过抗体抑制细胞表面 ELAM-1 的表达，
建立抗 TNF-α 抗体的活性检测方法，对其进行系统
验证，以期研究该方法的可行性。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试剂 抗 TNF-α 单克隆抗体（美国雅培）、
HUVEC 细 胞（ATCC CRL-1730）、F-12K 培 养
液（GIBCO 21127022）、 内 皮 细 胞 生 长 因 子、 吐
温 -20 和 肝 素 均 来 自 SIGMA ；胎 牛 血 清、 青 霉 素
和链霉素溶液、胰蛋白酶溶液、DPBS 溶液均采自
HYCLONE ；TNF-α 冻 干 粉（GIBCO PHC3011）、 戊
二醛、鼠抗人 ELAM-1 和 HRP 标记的羊抗鼠 IgG 采
自 Abcam 公 司 ；TMB 反 应 液（AB000802） 来 自 广
州怡雅 ；PBS 粉末来自博士德。
1.1.2 仪器 超净工作台（苏净安泰）、倒置显微
镜（OLYMPUS IX71）、 二 氧 化 碳 培 养 箱（Thermo
150i）、酶标仪（Molecular Devices MD M2E）、洗板
机（Thermo）。
1.2 方法
1.2.1 细胞 Elisa 法检测 ELAM-1 的方法建立 取对
数生长期的 HUVEC 细胞，消化重悬计数并种植于
96 孔板中，100 μL/ 孔，每孔 2 500 个细胞，37℃，
5% CO2 培 养 箱 中 培 育 贴 壁。 加 TNF-α 溶 液，200
μL/ 孔，37℃，5%CO2 培养箱孵育刺激，加戊二醛
溶液固定细胞；PBS 洗板后，加入 3%BSA 37℃封闭；
PBS 洗板 3 次，加稀释的鼠抗人 ELAM-1 单抗（一抗）
50 μL/ 孔，37℃ 孵 育 ；PBST 洗 板 3 次， 加 稀 释 的
HRP 标记的羊抗鼠 IgG（二抗），每孔 100 μL，37℃
孵 育 ；PBST 洗 板 3 次， 加 TMB 溶 液 100 μL/ 孔，
37℃显色 ；最后用 1 mol/L 硫酸终止反应，酶标仪
450 nm 读取光密度值。
1.2.2 TNF-α 刺激细胞浓度摸索实验 将 TNF-α 干
粉溶于 1 mL 全培养液中，配制 90 ng/mL 的 TNF-α
溶液。将上述的 TNF-α 溶液进行梯度倍比稀释，得
系 列 浓 度 的 TNF-α 溶 液 ：0.35、0.70、1.40、2.81、
5.62、11.25、22.50、45.00 和 90.00 ng/mL， 各 浓 度
设定 3 个复孔，设置细胞阴性对照孔，细胞 Elisa 法
检测 ELAM-1 的表达量。
1.2.3 抗 TNF-α 抗体活性测定方法建立 用一定浓
度 TNF-α 和系列浓度抗体的混合溶液共同孵育贴
壁后的 HUVEC 细胞，200 μL/ 孔。抗体标准溶液为
640 ng/mL，将其倍比稀释，浓度范围为 ：2.5、5、
10、20、40、80、160、320 和 640 ng/mL。设置细胞
对照、TNF-α 阳性对照、抗体对照及空白对照。各
浓度均设 3 个复孔，依照 1.2.1 步骤通过细胞 Elisa
法检测 450 nm 处的光密度值。数值以四参数拟合
回归方程 Y=（A-D）/［1+（x/C）B］+D 计算抗体与
ELAM-1 之间的剂量关系，得出抗体的生物学活性
IC50 值。
1.2.4 抗 TNF-α 抗体活性测定的验证
1.2.4.1 方法特异性 分别配制系列浓度抗 TNF-α
抗体标准溶液和非抗 TNF-α 抗体样品溶液，并将抗
TNF-α 抗 体 70℃ 高 温 变 性 处 理 5 min、30 min、60
min。分别按 1.2.3 方法检测各条件下溶液的 IC50 值。
1.2.4.2 线 性 及 准 确 度 配 制 浓 度 为 320 ng/mL
（50%）、480 ng/mL（75%）、640 ng/mL（100%）、
800 ng/mL（125%）、960 ng/mL（150%）的抗 TNF-α
抗体溶液，再按 1.2.3 实验方法分别倍比稀释并检测
ELAM-1 的值。每浓度水平溶液平行测定 3 条曲线，
并将理论水平相对实际水平作直线拟合，得出线性
方程。
1.2.4.3 精密度和中间精密度 平行配制 6 份 640
ng/mL 的抗 TNF-α 抗体标准溶液，按 1.2.3 的抗体
检测方法检测各份溶液的 IC50 值，计算得出抗体的
活性。按抗体检测 IC50 与 100% 浓度抗体 IC50 比值
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.1272
得出相对活性。另一实验人员同样平行配制 6 份抗
TNF-α 抗体标准溶液，检测各份的 IC50 值，并同样
计算出相对活性值。
2 结果
2.1 细胞Elisa法检测ELAM-1方法建立
逐一摸索细胞 Elisa 法检测 ELAM-1 的条件 ：细
胞种植密度 2 500 个 / 孔，细胞培育 24 h 贴壁后进
入对数期。由表 1 可知，5 h 时 ELAM-1 表达量基本
稳定，此时信噪比最佳，故选择 TNF-α 孵育时间为
5 h。1% 戊二醛固定 30 min、3%BSA 封闭 1 h，一抗、
二抗最佳稀释比例分别为 1∶1 500、1∶4 000（图
1），孵育时间依次为 2 h 和 1 h，TMB 显色 20 min，
测定 450 nm 的光密度值。
表 1 TNFα 不同孵育时间的 ELAM-1 检测结果
孵育
时间
TNFα 刺激 ELAM-1
OD450 nm 值（S1）
无 TNFα 刺激对照
OD450 nm 值（S2）
S/N 值
（S1/S2）
2 h 0.209 0.155 1.34
4 h 0.435 0.183 2.37
5 h 0.614 0.194 3.16
8 h 0.613 0.195 3.14
2.2 TNF-α对HUVEC细胞刺激浓度的确定
根据 1.2.2 实验摸索 TNF-α 的刺激浓度，结果
如图 2 所示，随着 TNF-α 溶液浓度加大，细胞表面
ELAM-1 的表达量也呈现明显增大。当其浓度达到
22.5 ng/mL 时，ELAM-1 的量基本达到平台，表明
此条件下细胞表达达到饱和，因此在随后的实验中
TNF-α 刺激浓度被选择为 22.5 ng/mL。
0.11
0.1 1 10 100ᣇփ⎃ᓖng·mL-1
ᣇփ1:1500〰䟺ᣇփ1:2000〰䟺
1000 10000
0.21
0.31
0.41
O
D
45
0
nm
٬
0.13
0.18
0.23
0.28
1e-5 1e-4 0.001 0.01 0.1 1 10 100 1000ᣇփ⎃ᓖng·mL-1OD 450 nm٬
ᣇփ1:4000〰䟺ᣇփ1:5000〰䟺ᣇփ1:3000〰䟺
A
B
图 1 细胞 Elisa 实验一抗（A）和二抗的稀释优化实验（B）
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3O
D
45
0
nm
٬
0.2
0.1
0
0 20 40 60 80 100⎃ᓖng·mL-1
图 2 不同浓度的 TNF-α 刺激细胞的 ELAM-1 表达
2.3 抗TNF-a抗体中和活性实验建立
根 据 2.1、2.2 的 结 果， 确 定 了 TNF-α 浓 度 及
刺激孵育细胞的时间，同时也确定了一抗、二抗的
稀释比例，由此建立了检测 ELAM-1 的实验方法。
选择抗体初始浓度为 640 ng/mL，以 3 倍稀释使终
浓度为 ：2.5、5、10、20、40、80、160、320 和 640
ng/mL，检测结果（图 3）表明 ELAM-1 表达量与抗
体浓度呈现一定的剂量关系。报告检测结果的绝对
IC50 值（38.5 ng/mL）体现抗体对 TNF-α 中和效力。
0.52
O
D
45
0
nm
٬ 0.42
0.32
0.22
1 10 100 1000⎃ᓖng·mL-1
图 3 细胞 Elisa 法检测抗体活性的剂效曲线
2.4 抗体生物学活性方法验证
2.4.1 方法专属性验证 方法的专属性结果（表 2）
2015,31(12) 73陈坤等：基于HUVEC 细胞表面 ELAM-1 表达的抗 TNF-α抗体活性检测方法
表明，此方法只针对抗 TNF-α 抗体的活性检测，对
于非抗 TNF-α 抗体（阴性对照品为贝伐单抗）在
TNF-α 对照和贝伐抗体对照的孔中，OD 值没有任何
变化，其结果曲线图也无明显剂效关系。此外，我
们考察了高温破坏对于该类抗体活性的影响，如表
2 所示抗体在 70℃的高温下，时间越久，活性降低
越多，当加热时间增至 30 min 时，抗体几乎完全聚
合变性而失活。
表 2 抗体活性检测专属性
样品名称 0 min 5 min 30 min 60 min 阴性对照品
空白 OD 值 0.192 0.178 0.233 0.253 0.203
抗 TNF-α 抗体对照
（OD 值）
0.203 0.195 0.206 0.221 0.211
TNF-α 对照（OD 值） 0.979 0.913 0.913 0.924 0.213
IC50 值（ng/mL） 44.4 237 > 640 > 640 --
2.4.2 方法线性测定 如表 3 所示，实际水平即测
定的相对活性，理论水平即配制浓度的相对比例。
将 5 个实际水平平均值对理论水平做直线拟合，该
方法在 50%-150% 之间呈现良好的线性关系。线性
拟合方程为 y=1.054 6x-0.076 2，R2=0.992 5。
份抗 TNF-α 抗体溶液，按抗体活性检测方法测吸光
度值并计算 IC50 值，得出生物活性（表 4）。结果表
明，6 次平行的 RSD% 为 9.25%。另一实验员同样
方法另行配制检测 6 份抗体溶液，得出生物活性，
12 份的 RSD 为 7.66%。
表 4 抗体活性检测精密度结果
样品名称 IC50 浓度 生物活性 活性均值 RSD% 值
1 47.2 99.9%
100.8% 7.66%
2 42.4 111.2%
3 42.2 111.8%
4 47.9 98.5%
5 49.7 94.9%
6 53.6 88.0%
7 48.2 101.3%
8 48.9 102.8%
9 49.5 104.1%
10 42.8 90.0%
12 50.6 106.4%
3 讨论
该实验方法在国内外关于 HUVEC 细胞表面粘
附分子研究的基础上，利用抗 TNF-a 抗体可以抑制
TNF-a 刺激 HUVEC 细胞表达 ELAM-1 来检测抗体
的生物学活性。该方法的建立基于 Thorne 等首次阐
明细胞因子（TNF-a 和 IL-1β）增加单核细胞 - 冠状
120
140
y=1.0546x-0.0762
R2=0.9925
160ᇎ䱵≤ᒣ⍫ᙗ 80100
20
40
60
0
0 20 40 60 80 100 120 140 160⴨ሩ⍫ᙗ%
图 3 抗体活性检测线性曲线
2.4.3 抗体活性方法准确度检测 将各浓度水平
50%、75%、100%、125% 和 150% 平行测定 3 条曲线，
根据吸光度均值和对应浓度进行四参数拟合得到生
物活性的实验测得值、理论值并计算回收率。单个
回收率在 81%-110% 之间，而 15 个检测结果的平
均回收率为 96.76%。所有结果的 95% 置信区间在
92%-101%。
2.4.4 抗体活性检测方法精密度检测 平行配制 6
表 3 抗体活性检测之准确度
理论浓
度水平
单个回
收率
平均实
际水平
平均回
收率
95% 置信
区间
50% 82.52% 42.84%
96.76% 92.1%-101.5%
81.12%
94.64%
75% 97.52% 74.80%
109.83%
93.28%
100% 102.27% 100.00%
100.77%
97.12%
125% 90.43% 118.98%
94.41%
101.35%
150% 96.63% 152.58%
99.01%
110.58%
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.1274
动脉平滑肌细胞黏附是通过 ELAM-1、VCAM-1 和
ICAM-1 机制。抗 TNF-α 药物抑制介导内皮细胞表面
粘附分子的表达是控制细胞在血管壁积聚的关键调
控点［5，10］。相比常规的细胞毒性实验，该法结合了
酶联免疫的高度灵敏性及准确性特点，为实验提供
了更准确的结果。
人脐静脉内皮细胞 HUVEC 经 TNF-α 处理后，
细胞表面 ELAM-1 的表达有明显增高，且细胞在孵
育 5 h 时 ELAM-1 表达量达到稳定。实验中还发现
细胞在正常生长条件下也会表达该黏附分子，只是
量比较少，这一发现也与文献报道相符。对于细胞
表达 ELAM-1 因子的检测，采用 Elisa 法，本实验一
抗的选择在于保证实验结果准确性，信噪比更高的
情况下方法更稳定，故以 1∶1 500 稀释一抗。实验
中二抗则以 1∶4 000 稀释比例得到最佳的剂量曲线。
在专属性实验中，抗体经高温破坏，活性明显
降低。猜测与抗体在高温下迅速聚合有关，经 SEC
（分子排阻色谱柱）分析实验发现，经 70℃处理超
过 5 min 或更长时间时，抗体多聚体含量显著提高，
这与推测相符。由此说明，多聚体的产生对生物抗
体药物的活性会有明显的影响。在方法准确度及线
性实验的验证中，我们发现抗体浓度为 50% 时，单
个点的回收率低于平均回收率，这可能与该法的缺
陷有关，当抗体活性接近 50%，即到达线性的最低
点时，结果呈现不稳定性。由 ELAM-1 因子的表达
检测抗体活性，我们尝试以一定浓度 TNF-α 作用细
胞，发现黏附分子 ICAM-1、VCAM-1 均有一定量的
表达，而且，它们在孵育相同时间时，各自的表达
量有一定的差别，据此方法条件摸索出各因子最佳
表达时间，并对其分别检测即可达到检测抗体活性
的更多方法。
4 结论
本实验室通过建立细胞 - 酶联免疫法检测抗
TNF-a 抗体的活性，克服了常规单一方法检测活性
的局限性，开拓了该类抗体体外活性检测的新思路。
通过对该法进行完整的验证，表明该法检测抗体活
性具有一定的科学性、准确性更能反映抗体活性的
真实性。此外，该方法的建立也为通过其他两个因
子（ICAM-1 和 VCAM-1）检测抗体活性提供了思路，
可以依此建立更全面反映药物体外活性的检测手段，
保证药物研发生产中更好地控制产品质量。
参 考 文 献
［1］Spriggs DR, Zaheer T, Zhong W, et al. Tumor necrosis factor and
interleukin6 mRNA expression in neonatal Lewvis rat Schwann
cells［J］. Marcel Dekker Ink, 1991, 72（1）：33-34.
［2］Meldrum DR. Tumor necrosis factor in the heart［J］. Am J Physiol,
1998, 274（3 Pt2）：R577-R595.
［3］Cheng B, Hyeju N, Jaehoo L, et al. Daidzein suppresses tumor
necrosis factor-α induced migration and invasion by inhibiting
hedgehog/glil signaling in human breast cancer cells［J］. J Agric
Food Chem, 2014, 62（17）：3759-3767.
［4］Wen T, Wang Z, Meng X, et al. Synthesis of novel tylophorine
derivatives and evaluation of their anti-inflammatory activity［J］
ACS Med Chem Lett, 2014, 5（9）：1027-1031.
［5］Winn R, Vedder N, Ramamoorthy C, et al. Endothelial and leukocyte
adhesion molecules in inflammation and disease［J］. Blood
Coagulation and Fibrinolysis, 1998, 9（2）：S17-S22.
［6］Tracey D, Klareskog L, Sasso EH, et al. Tumor necrosis factor
antagonist mechanisms of action ：a comprehensive review［J］.
Pharmacol Ther, 2008, 117 ：244-279.
［7］Muler WA, Randolph GJ. Migration of leukocytes across endothelium
and beyond ：Molecules involved in the transmigiration and fate of
monocytes［J］. J Leukoc Biol, 1999, 66 ：698-704.
［8］Dwivedi RC, Dhindsa N, Krokhin OV. The effects of infliximab
therapy on the serum proteome of rheumatoid arthritis patients［J］.
Arthritis Res Ther, 2009, 11（2）：R32. 1186-2637.
［9］Thorne SA, Abbot SE, Stevens CR, et al. Modified low density
lipoprotein and cytokines mediate monocyte adhesion to smooth
muscle cells［J］. Atherosclerosis, 1997, 127（2）：167-176.
［10］Fotis L, Agrogiannis G, Vlachos IS, et al. Intercellular adhesion
molecule（ICAM）-1 and vascular cell adhesion molecule（VC-
AM）-1 at the early stages of atherosclerosis in a rat model［J］. In
Vivo, 2012, 26（2）：243-250.
（责任编辑 狄艳红）