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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第6期
刀鲚（C. ectenes）隶属于鲱形目（Clupeiforms）
鳀科（Engraulidae）鲚属（Coilia），是一种小型的
洄游鳀科鱼类，主要分布在我国长江中下游及沿海
河口流域，因其肉味鲜美有“长江三鲜”之首的美
誉。由于长江流域自 20 世纪 70 年代以来受过度捕
捞、水利工程修建、生活和工业污水的排放以及水
运发展等因素的影响，刀鲚的生殖洄游通路被阻断，
生活水环境被污染，长江刀鲚的产量和种群数量极
具减少，难再形成渔汛。
刀鲚的研究早期集中在渔业资源［1，2］、年龄、
生长［3］、胚胎发育和洄游［4］方面，后期开展了一系
列同工酶［5］、线粒体基因（Dloop［6］、cytb［7］、16S
rRNA［8］）、RAPD-PCR［9，10］和 ISSR-PCR［10］技术对
鳀科鱼类进行的遗传多样性和分类研究。目前刀鲚
收稿日期 ：2013-09-27
基金项目 ：上海市科委重点科技公关项目（11391901300），科技部与上海市共同重大任务科研专项（12dz1909302）
作者简介 ：邓平平，男，助理工程师，研究方向 ：水产养殖和育种工作 ；E-mail ：kokou365@sohu.com
磁珠富集法分离刀鲚微卫星标记
邓平平  施永海  张根玉  张之文  张海明  陆根海  刘永士 
（上海市水产研究所，上海 200433）
摘 要： 利用磁珠富集法分离微卫星序列，以开发长江刀鲚微卫星分子标记。将长江刀鲚基因组DNA经限制内切酶Mse I酶切，
回收 400-1 000 bp 片段，安装接头，构建长江刀鲚全基因组 PCR 文库。用生物素标记的微卫星探针（CA）12 与其杂交，磁珠富集
含有微卫星序列的 DNA 片段。将洗脱所得片段进行 PCR 扩增，然后进行克隆。经过菌落 PCR 检验后挑选出 118 个阳性克隆进行测序，
其中 97 条含有微卫星序列。用设计合成 59 对微卫星引物对 30 尾养殖长江刀鲚进行引物的多态性筛选，得到 9 对多态性引物。
关键词 ： 刀鲚 磁珠富集 微卫星 多态性
Isolation of Microsatellite in C. ectenes by Magnetic Beads
Deng Pingping Shi Yonghai Zhang Genyu Zhang Zhiwen Zhang Haiming Lu Genhai Liu Yongshi
（Shanghai Fisheries Research Institute，Shanghai 200433）
Abstract:  It was a study to develop microsatellite markers with the method of microsatellite enrichment by magnetic beads. Genomic
DNA of C. ectenes was digested with restriction enzyme Mse I. The fragments of 400-1 000 bp were recycled and ligated with relevant adaptors,
then the “complete genome PCR library” was constructed. The PCR products were hybridized by a biotin-labeled Oligo probe（CA）12, the
microsatellites were enriched with magnetic beads. The eluted fragments from magnetic beads were amplified and cloned into pMD18-T vector.
118 positive clones were screened with PCR method from 170 clones. After sequenced, 97 microsatellite sequences were found, 59 pairs of SSR
primers were designed, and 9 pairs of primers were polymorphism within 30 cultured Chang Jiang C. ectenes.
Key words:  C. ectenes Enrichment by magnetic beads Microsatellite Polymorphism
微卫星标记的开发和运用报道不多，仅限于 Ma［11］
和 Chen［12］对此做过研究。本研究运用磁珠富集的
方法筛选新的刀鲚微卫星分子标记，以期为刀鲚养
殖品系的优化、遗传多样性的检测及遗传图谱构建
提供更有效的研究工具。
1 材料与方法
1.1 材料
30 尾长江刀鲚来自上海市水产研究所苗种技术
中心养殖品种。
1.2 方法
1.2.1 基因组 DNA 的提取 取长江刀鲚肌肉于无水
乙醇中固定，-20℃保存。长江刀鲚基因组 DNA 提
取采用传统的苯酚 / 氯仿法［13］，将获得的 DNA 溶
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第6期146
于灭菌的无菌水中，使用前需琼脂糖检测及紫外分
光光度计定量，4℃下保存备用。
1.2.2 长江刀鲚基因组文库的构建
1.2.2.1 基因组 DNA 的酶切、回收及连接 在 37℃
水浴锅中使用限制性内切酶 Mse I 将 100 μg 长江刀
鲚基因组 DNA 酶切 4 h，1% 琼脂糖电泳后，切割
回收 400-1 000 bp 大小的基因片段。取 4 μL 酶切
产 物，1 μL 接 头 MA ：5-GATGAGTCCTGAGTAA-3
（MA1 和 MA2 混合产物），5 μL Solution Ⅱ和 10 μL
Solution Ⅰ在 16℃连接过夜。
1.2.2.2 扩增接头连接的 DNA 片段 以酶切连接好
的产物为模板，以 MA：5-GATGAGTCCTGAGTAA-3
为 引 物 进 行 扩 增，PCR 反 应 条 件 为 ：94℃ 变 性 5
min；94℃ 30 s，53℃ 1 min，72℃ 1 min，循环 20 次；
72℃延伸 5 min。取 5 μL PCR 产物进行琼脂糖电泳
检测，判断扩增产物的分布范围以及产量。
1.2.3 微卫星序列的富集
1.2.3.1 杂交 根据预试验的摸索建立 100 μL 的反
应 体 系，1 μL（100 μmol/L） 探 针（ 为 BSSR-l ：5-
bio-CACACACACACACACACACACACA-3）、21 μL
20×SSC、0.7 μL 10% SDS、67.3 μL 灭菌 ddH2O。混
合均匀后，95℃反应 5 min，58℃放置 15 min。在杂
交中同时进行磁珠的平衡处理。
1.2.3.2 磁珠的处理 将磁珠溶液轻摇均匀，吸出
100 μL 移至 1.5 mL 离心管中，并加入 1 mL TEN100，
混匀清洗磁珠 2 min 后置于磁性分离架上约 1 min，
轻轻吸出透明液体，重复以上步骤至少两次，直至
磁珠顺滑再加入 40 μL TEN100，同时加入变性的质粒
DNA 以封闭磁珠表面。
1.2.3.3 磁珠吸附富集 将杂交产物与平衡封闭处
理后的磁珠进行混合，加入 300 μL TEN100，室温放
置 30 min，并轻摇混匀。
1.2.3.4 洗涤与洗脱 将磁珠富集的产物进行 3 次
松弛性洗涤（使用 TEN1000 进行洗涤），再进行 3 次
严谨性洗涤（使用 0.2×SSC+0.1% SDS 洗涤）。向洗
涤好的磁珠中加入 50 μL TE 缓冲液，混匀并 95℃
加热 10 min，在磁力架上迅速分离透明液体作为第
一次洗脱液。再向磁珠中加入 12 μL 0.15 mol/L 的
NaOH，轻柔混匀，用磁力架分离透明液体，并加入
1.8 μL 1 mmol/L 的 HCl，加入 36.2 μL TE 使体积补足
为 50 μL，作为第二次洗脱液。先后分别回收二次洗
脱产物以作备用。
1.2.3.5 洗脱产物的扩增及回收 分别以两次洗脱
产物为模板，MA 为引物，PCR 程序为 ：94℃变性 5
min；94℃ 30 s，53℃ 1 min，72℃ 1 min，30 个循环；
并在 72℃延伸 5 min。将两种 PCR 产物在 1% 琼脂
糖中电泳，切下片段大小在 400-1 000 bp 的胶段，
回收切割片段并在 1% 琼脂糖中电泳检测回收效率。
1.2.3.6 连 接 与 转 化 建 立 10 μL 连 接 反 应 体
系，1 μL pMD18-T（50 ng/μL）、 插 入 片 段 2 μL、
Solution Ⅰ 5 μL、2 μL ddH2O 在 16℃ 水 浴 连 接 4 h
以制备充足质粒。在 CaCl2 制备的感受态大肠杆菌
DH5α 转化下，最终得到长江刀鲚微卫星文库。用
载体通用引物 M13（-47 与 -48）和 SSR01 对每个菌
落进行 3 次 PCR，挑选出阳性克隆送出测序。
1.2.4 微卫星序列引物设计及多态性引物筛选 运
用常规引物设计技巧［14］对测出含有微卫星片段的
序列利用 Primer Premier 5.0 设计 59 对引物，并对采
取的 30 尾长江刀鲚样品进行引物多样性的筛选。
2 结果
2.1 酶切及其产物连接后PCR扩增
以长江刀鲚基因组 DNA 为底物进行 Mse I 酶
切，将酶切产物与接头连接，检测其 PCR 产物可见
一片分布比较均匀的片段，片段的大小主要集中在
300-1 000 bp（图 1）。
750
bp
M 1 2 3
M ：DNA Marker ；1 ：未经 Mse I 酶切产物 ；2，3 ：经 Mse I 酶切产物
图 1 基因组酶切电泳图
2.2 菌落PCR检验重组率
在 CaCl2 制备的感受态大肠杆菌 DH5α 转化下，
得到长江刀鲚基因组文库共 800 个克隆，挑选了其
中的 170 个菌落进行菌落 PCR 检验，得到阳性克隆
118 个（阳性克隆率约为 69.41%）。
2014年第6期 147邓平平等 ：磁珠富集法分离刀鲚微卫星标记
2.3 测序结果
对挑选出的 118 个阳性克隆进行测序，有 97
个（82.81%）克隆含有微卫星片段，这 97 个含有
微卫星的克隆中含有微卫星位点共计 271 个，其中
以 AC/TG 为重复基元的微卫星序列最多为 221 个
（81.55%），AG/CT 次之为 48 个（17.71%）。重复次
数在 10-20 间的 68 个（25.09%），最高重复次数为
55 次。其中完美型微卫星 156 个，非完美型 44 个，
复合完美型 12 个（表 1）。从测序结果发现，除了
出现对应探针 CA 重复基元外，还获得了 GA、TC、
GAG、AAC 和 ACGC 重复基元。已在 GenBank 登录
92 条（ 登 录 号 ：KF62219、KF682220、KF690275-
表 1 长江刀鲚微卫星的不同类型所占比例
完美型 非完美型 复合完美型
重复次数
5-10 11-20 21-30 31-40 41-50 ＞ 50
微卫星个数 156 44 12 73 60 22 4 1 3
比例（%） 73.58 20.75 5.66 44.90 36.81 13.50 2.45 0.60 1.84
KF690364）。
2.4 引物设计与筛选
在所测得的 97 条含有微卫星序列中，排除了不
符合引物设计条件［14］的序列，利用引物设计软件
Primer premier 5.0 共设计 59 对引物，并以上海水产
研究所养殖的 30 尾长江刀鲚基因组 DNA 为模板分
别进行 PCR 扩增，其中有 9 对引物对本次采样表现
出多态性，能够作为长江刀鲚微卫星分子标记。利
用温度梯度 PCR 方法，摸索出这 9 对引物的最佳退
火温度，具体信息列于表 2。
表 2 9 对 SSR 引物对长江刀鲚多态性检测结果
引物编号 重复基元 前项引物（5-3） 后项引物（5-3） 产物（bp） 退火温度（℃） 等位基因数
D01 （AC）13 CGGAGACAGAGCTTCCACACAGATG ACCGTTTTCCGTCCACAATAGCC 268 52 3
P06 （TC）13 CAGGCAATGTATTATTCAAAGG TGACTGGAATCAGGCAGCACTT 230 56 5
P10 （AC）5AT（AC）5 TCCGCCTCACCTGGCAACCTTTA CAGCCAGCAAAATAGACAGGAGA 262 54 3
P36 （AC）22 CACAAAGGGCAGAAGCAAACACACA GTCTCAGTTGTAACAGTATTGGA 181 56 5
P40 （CA）13 CTTCATACAGTATTAGGACCAGA ACTTCAGTCTGCTTTGGAATGTG 193 52 4
P49 （CA）17 CAATGAGGTACGTTATTCACAGAAC TGCAGACCAGATCTACTGAGGCTCC 174 54 5
P55 （AC）16 TGGGACAGTACCAGAGGGGACAAGA TATCGGTGTTATCAATTATGGATTC 205 56 2
P56 （AC）13 GTACACTCACTTAACCTGTGCTTCA ATTTTCCCCTCCATTAGAAGACATC 192 56 3
P57 （AC）14 CGTAGTATTCAATGGCGTTGTTC GTACTGCTACACCTCCCTTTCAC 230 56 4
3 讨论
3.1 开发微卫星分子标记的途径
随着分子标记技术的发展，微卫星分子标记在
群体结构、遗传学分析、基因鉴定、生物多态性分
析等方面逐渐展现出它的优势，而它的开发一度成
为分子生物学领域的研究热点［15］。目前微开发卫
星分子标记主要有 2 种途径 ：一种是对已经公布的
序列数据作相应的处理或者直接借用，如对 EMBL、
GenBank 和 DDBJ［16］等 DNA 序列数据库检索出的
微卫星片段进行引物设计和筛选获得微卫星分子标
记，以及借用相邻品种已经开发出的微卫星分子标
记。这种方法虽然简单且资金投入少，但是可检索
的资源相对有限，特别是对于一些尚未开展相关研
究的品种此法难易实施。另一种是先构建一个全基
因文库，然后通过杂交筛选出需要的微卫星序列。
因杂交的方式和探针的类别不同分为非放射性或放
射性标记探针的 Southern 杂交与寡核苷酸探针的磁
珠富集法。由于磁珠富集法具有效率高、人力和资
金投入少以及耗时少等明显优势而被科研工作者普
遍采用。本研究通过磁珠富集法得到长江刀鲚基因
组文库共 800 个克隆，挑选了其中的 170 个菌落进
行菌落 PCR 检验，得到阳性克隆 118 个，阳性克隆
率约为 69.41%。这比用经典的构建和筛选小插入片
段基因组文库的方法［17，18］分离含微卫星序列的阳
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第6期148
性克隆率（1%-3%）要高出很多。
3.2 运用磁珠富集法需要注意的关键环节
虽然运用磁珠富集法筛选微卫星序列有诸多优
势，但整个过程环节却不少，特别是关键环节的把握。
如探针与连接产物的杂交、磁珠的平衡以及洗涤与
洗脱，这些都关系到磁珠富集含有微卫星序列的效
率。本试验严控以上几个关键点，使阳性克隆率达
到 69.41%，这优于大部分同类试验［19-24］，但比薛
华柏［25］对小黄李的研究低。另外，由于磁珠富集
环节较多，各环节间又相互依存，特别是相邻环节
更要注意检测分析结果，以便更稳更快地开展试验。
在酶切回收以及洗脱产物的扩增回收过程中，由于
其他原因本试验没有采用低熔点胶而是采用常规琼
脂糖胶，从最终的结果看还是可行的，但回收的效
率不是很高。
3.3 多态性引物筛选时样本的选取问题
通过磁珠富集法获得了 97 条微卫星序列并以此
设计了 59 对引物，以人工繁殖的 30 尾长江刀鲚为
模板进行引物的行多态性筛选，最终只获得了 9 对
多态性引物，且有 6 对引物表现出单态性，有 10 对
引物没有扩增出产物，另外 24 对引物扩增的效果不
理想。出现单态性引物偏多可能有两方面的原因 ：
一是设计合成的引物对长江刀鲚这个品种只表现单
态性，二是本试验所使用的样本是人工繁育群体，
可能存在一定的近亲繁殖现象［26］。
4 结论
经过磁珠富集后，得到 118 个阳性克隆，其中
97 个阳性克隆含有微卫星序列。在获得含有微卫
星序列的基础上设计合成 59 对引物，并对 30 尾养
殖长江刀鲚进行引物的多态性筛选，最终得到 9 对
多态性引物，为长江刀鲚的多样性分析提供一定的
帮助。
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（责任编辑 马鑫）