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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第9期
收稿日期 : 2012-02-27
基金项目 : 贵州省社发攻关项目（黔科合 S 系 [2007]1038）, 贵阳医学院研究生创新计划专项基金
作者简介 : 龙高群 , 女 , 硕士 , 研究方向 : 医学昆虫分子生物学 ; E-mail: longgaoqun@126.com
通讯作者 : 张春林 , 男 , 硕士 , 教授 , 研究方向 : 医学昆虫分子生物学 ; E-mail: zcl@gmc.edu.cn
德国小蠊（Blattella germanica）属节肢动物门、
昆虫纲、有翅亚纲、蜚蠊目、蜚蠊科，其体内外均
能携带多种病原体，如痢疾杆菌、沙门氏副伤寒甲、
乙杆菌、变形杆菌及蛔虫、钩虫、蛲虫、兰氏贾弟
鞭毛虫等，机械式的传播疾病，而且还是主要昆虫
过敏原之一，其体壁及分泌物等是重要的过敏原，
可引起变态反应［1］，使过敏体质的人出现皮疹、哮
喘和打喷嚏等症状［2］。
有报道指出，以重组变应原用于免疫治疗，可
以显著降低患者的IgE结合能力，具有很好的疗效［3］。
Jone 等［4］通过研究也肯定了蟑螂重组变应原的诊断
和免疫治疗上的作用。在疫苗研究方面，Zhou 等［5］
研制的表达 Bla g 1 的 DNA 疫苗和 Yang 等［6］研制
的表达 Bla g 2 的质粒 DNA 遗传性疫苗均对蟑螂过
敏患者具有保护和治疗功效。在重组疫苗优化方面，
Kagen 等［7］对重组疫苗进行了优化，研究出了一种
新的更安全的方法，可以保持人类疫苗中变应原的
稳定性。由此可见，获得编码德国小蠊变应原 Bla g
德国小蠊变应原 Bla g 8的克隆表达及进化分析
龙高群 张春林
（贵阳医学院生物教研室，贵阳 550004）
摘 要： 通过 5-RACE获得德国小蠊变应原 Bla g 8基因的全长 cDNA序列，进行生物信息学分析，构建原核表达载体，诱
导重组蛋白表达，建立系统进化树，为进一步研究奠定基础。通过 5-RACE技术，PCR扩增获取编码德国小蠊变应原 Bla g 8蛋白
的全长 cDNA序列；采用生物信息学方法分析预测 Bla g 8蛋白的信号肽、疏水性、跨膜区、二级结构、三级结构；建立系统进化树；
构建原核表达载体 pET32a-B8，IPTG诱导重组蛋白表达，并用 His-tag抗体Western blotting验证。结果显示，获得编码德国小蠊变
应原 Bla g 8的全长 cDNA序列，其完整阅读框含 618个碱基，编码 205个氨基酸。序列分析显示该蛋白，肌球蛋白轻链，具有 EF
手蛋白保守功能域。IPTG诱导获得重组蛋白。获得德国小蠊 Bla g 8的完整 cDNA序列，成功构建重组原核表达质粒 pET32a-B8，
并表达出融合蛋白。
关键词： 德国小蠊 变应原 序列分析 原核表达
Molecular Cloning and Expression of Bla g 8 Gene from
Blattella germanica
Long Gaoqun Zhang Chunlin
（Department of Biology，Guiyang Medical College，Guiyang 550004）
Abstract: It was to clone the Bla g 8 gene of Blattella germanica，analyze its sequence，express recombinant protein of the Blattella
germanica Bla g 8，predict the protein structure. Base on a fragment sequence of the Bla g 8 from NCBI，obtained full-length Bla g 8 sequence
by RACE. Constructed the recombinant plasmid pET32a（+）-B8，expressed His-B8 fusion protein in E. coli BL21（DE3） by IPTG
induction，and identified by SDS-PAGE and Western blotting. Results showed the Blattella germanica Bla g 8 gene includ an reading fragme
of 618 bp code for 205 amino acid residues. It was found the full-length of Bla g 8 gene from Blattella germanica，construct the recombinant
plasmid pET32a（+）-B8，expressed His-GAPDH fusion protein.
Key words: Blattella germanica Allergen Sequence analysis Prokaryotic express
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第9期174
8 的完整 cDNA 序列就显得尤为重要，是进一步获
取重组蛋白和研制疫苗的基础。
目前，国际免疫学会联合会（International Union
of Immunological Societies，IUIS）官方公布的德国小
蠊相关的变应原，主要有 Bla g 1、Bla g 2、Bla g 4、
Bla g 5、Bla g 6、Bla g 7 和 Bla g 8。除 Bla g 8 外，其
他几种变应原的基因克隆与蛋白表达、致敏性鉴定
皆已完成［8-10］。而关于 Bla g 8 的研究，除 GenBank
公布的部分序列（登录号 ：ABD47458）和 IUIS 公
布的 Bla g 8 为德国小蠊变应原外，Bla g 8 的相关
研究均未见报道，且该序列并不完整，其 5端有
缺失。
蟑螂是昆虫中引发变态反应性疾病的主要类
型之一。1998 年，WHO 发布的关于免疫治疗的指
导文件中强调变应原的质量对变态反应性疾病的诊
断和治疗至关重要，用于免疫治疗的变应原应该是
纯品而不宜为粗制浸液［11］。目前，在我国临床上
使用的蟑螂粗浸液，由于难以达到质量标准化，且
含有大量非特异性抗原，所以整个蟑螂虫体的粗浸
液用于变态反应性疾病的诊断和脱敏治疗存在许多
不足［12］，而蟑螂重组变应原很好地解决了这些问
题［9］。因此，获得编码德国小蠊变应原 Bla g 8 的完
整 cDNA 序列就显得尤为重要。
本研究以德国小蠊变应原 Bla g 8 为研究对象，
通过 RACE 技术获得其全长 cDNA 序列，构建 Bla g
8 原核表达质粒，诱导重组蛋白表达，并运用生物
信息学方法对Bla g 8蛋白的结构及建立系统进化树，
旨在为 Bla g 8 蛋白的进一步深入研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
德国小蠊为本实验室人工饲养，RNA 提取试剂
盒购于 Omega 公司，RACE 试剂盒购于 Invitrogen 公
司，pMD18-T 质粒，限制性核酸内切酶 BamH I 和
Hind III 购于 TaKaRa 公司，pET-32a 为本实验常规
保存。
1.2 方法
1.2.1 全长 cDNA 序列的获取 通过美国国立生物
技术信息中心 NCBI（National Center for Biotechnology
Information）网站查询德国小蠊 Bla g 8 蛋白的氨基
酸 序 列（http ：//www.ncbi.nlm.nih.gov），GenBank 登
录号为 ：ABD47458。经分析发现该序列并不完整，
其 5端有缺失。根据该序列片段及 RACE 引物设
计要求设计 5-RACE 引物（表 1）。按 GeneRacerTM
Kit 试剂盒说明书提取德国小蠊成虫总 RNA 及逆
转录获得第一链的 cDNA，用 5-RACE 引物扩增出
cDNA 的 5-末端，将 PCR 产物切胶纯化回收后与
pMD18-T 克隆载体连接，通过氨苄青霉素抗性及蓝
白斑筛选后挑取阳性克隆，菌液 PCR 初步鉴定后送
上海生工生物工程有限公司测序。序列拼接后获得
德国小蠊变应原 Bla g 8 基因的全长序列，根据该序
列再设计全长引物，PCR 扩增出全长序列，将其克
隆到载体 pMD18-T（18T-B8）上后再送上海生工生
物公司测序鉴定。
表 1 5-RACE引物
引物 序列（5-3） 长度（bp）
Bla g 8-5 GSP TACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTT 27
Bla g -5 Nest TGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCA 27
GeneRacerTM 5 Primer CGACTGGAGCACGAGGACACTGA 23
GeneRacerTM 5 Nested Primer GGACACTGACATGGACTGAAGGAGTA 26
1.2.2 Bla g 8 蛋白的生物信息学分析 Bla g 8 蛋白
的信号肽预测通过 CBS Prediction 服务器（登陆 http：
//www.cbs.dtu.dk 网站，选择 signalIP 方法）；蛋白
疏水性预测采用 ExPASy Proteomics 服务器（登陆
http ：//www.expasy.ch 网站，选择 ScanProsite 方法）；
跨 膜 结 构 通 过 TMHMM Server v.2.0 服 务 器 预 测
（http ：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/） 在 线
预测。Bla g 8 氨基酸序列在公共数据库 NCBI 及变
应原数据库 SDAP（http ：//fermi.utmb.edu/SDAP/）中
进行同源比对，获取各物种肌球蛋白轻链的氨基酸
序列，使用 MEGA4.1 软件的邻接法建立 NJ 系统树
（Neighbor-joining tree）， 设 置 1 000 次 Bootstraps 进
2012年第9期 175龙高群等 ：德国小蠊变应原 Bla g 8 的克隆表达及进化分析
行评估。
Bla g 8 蛋白的二级结构预测采用 ExPASy Proteo-
mics 服务器蛋白二级结构预测方法中的 SOPMA 在
线完成。用 Swiss-Model 服务器（http ：//swissmodel.
expasy.org/）中，通过 Swiss-Model 蛋白质在线软件
完成蛋白质三维结构的预测。
利用 NCBI 在线软件 conserved domain （http ：//
www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）分析 Bla
g 8 蛋白的保守结构域，其功能结构域通过 SMART
（http：//smart.embl-heidelberg.de/）在线软件完成预测。
1.2.3 德国小蠊 Bla g 8 重组蛋白表达
1.2.3.1 pET32a-B8 重组质粒的构建 利用 Primer
Primer5 软件，设计 5端带有 BamH I 和 3端带有
Hind III 的引物，以德国小蠊 18T-B8 质粒为模板进
行 PCR 扩增。同时双酶切处理 PCR 产物和 pET-32a
表达载体，纯化定量后 16℃连接过夜，并转化至感
受态大肠埃希菌 BL21，次日挑取阳性菌，放入含氨
苄青霉素（50 mg/mL）的 LB 液体培养基中培养过夜，
提取质粒进行 PCR、双酶切及测序鉴定。
1.2.3.2 pET32a-B8 重组蛋白的表达及鉴定 取过夜
培养的菌液 60 μL，加入含有氨苄青霉素的 6 mL LB
液体培养基中，37℃、280 r/min 震摇约 3 h 至 OD600=
0.6，加入 IPTG 诱导表达，取 6 h 表达液，SDS-PAGE
电泳分析。按照 His-Western blot kit 蛋白抗体试剂
说明书进行，重组蛋白经 12% SDS-PAGE 分离后转
移到硝酸纤维膜上，室温下封闭液封闭 1 h 后在摇
床上用 PBS 漂洗 3 次（10 min/次）。然后用 6-his tag
蛋白抗体孵育结合，PBS 漂洗 3 次（10 min/次），再
用抗 His-tag 蛋白抗体（二抗）孵育结合，PBS 漂洗
3 次（10 min/次）。采用二氨基联苯胺（DAB）显色
5 min，后将 NC 膜转移入 PBS 液，终止反应。
2 结果
2.1 Bla g 8全长cDNA序列的获取
通过 5-RACE 技术获得一条长约为 300 bp 的
条带，测序后与 Bla g 8 的部分序列拼接，获得一
个长为 618 bp 的完整开放阅读框，编码 205 个氨基
酸 ；全长引物 PCR 扩增，克隆到 pMD18-T 后测序
结果与拼接序列碱基一致（图 1），该序列已上传至
GenBank（登录号 ：JN982315.1）。
M. DNA Marker DL2000 ；1. 3-RACE PCR 产物 ；2. 全长引物 PCR 产物
图 1 RACE PCR及全长 cDNA序列 PCR
2.2 生物信息学分析
2.2.1 Bla g 8 信号肽、蛋白疏水性及跨膜区分析
信号肽分析 Bla g 8 蛋白无信号肽序列。ExPASy
proteomics 服务器预测 Bla g 8 蛋白疏水性，得分大
于 0，且分值越大，表示疏水性愈好。结果显示该
蛋白的疏水性较差，虽然存在得分大于 0 的氨基酸
残基，但不存在一个连续 20 个氨基酸以上的疏水
空间。同时利用 TMHMM Server v.2.0 服务器预测 Bla
g 8 跨膜结构区的结果显示 Bla g 8 蛋白不存在跨膜
结构区。
2.2.2 结构分析 采用 SOMPA 方法对德国小蠊 Bla
g 8 蛋白的二级结构进行预测，结果显示，α-螺旋占
53.66%，β-折叠占 5.37%，无规则卷曲占 38.05%。
Bla g 8 蛋白的二级结构中 α-螺旋含量较高，并且 α-
螺旋结构与 β-折叠结构的相对含量大于 15%，属于
α+β 类型的蛋白。
通过 Swiss-model 预测 Bla g 8 蛋白的三级结构，
结果（图 2）显示，其 α-螺旋及 β-折叠的相对含量
与二级结构预测所得结果能较好地吻合。
保守结构域分析显示，Bla g 8 为德国小蠊一种
肌球蛋白轻链，具有完整的 EF-hand 钙结合结构域，
属于 EF-hand 钙结合蛋白家族。SMART 功能结构域
分析发现该蛋白具有 2 个完整的 EF-hand 钙结合基
序，分别位于第 61-89 位及第 165-193 位氨基酸，
EF-hand 一般成对出现，每个基序包括 12 个氨基酸
残基的环合 12 个残基的 α-螺旋。
2.2.3 氨基酸序列比对及系统进化分析 NCBI 同源
比对显示，德国小蠊 Bla g 8 基因编码的氨基酸序列
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第9期176
与蠼和东方蝼蛄的同源性分别为 85% 和 87% ；变应
原数据库 SDAP 同源比对显示德国小蠊 Bla g 8 对草
虾、凡纳滨对虾肌球蛋白轻链变应原具有同源性，
其同源性均为 50.24%。使用 MEGA4.1 软件的邻接法
构建 NJ 系统进化树，如图 3 所示，NJ 系统树共分
为两大支，其中德国小蠊与对草虾、凡纳滨对虾聚
为一小支，并与 Synthetic construct聚为一大支；褐鼠、
智人及家马聚为一小支并与其他昆虫聚为一大支。
2.3 德国小蠊Bla g 8重组蛋白表达
2.3.1 pET28a-GAPDH 重组质粒的构建 重组质粒
pET32a-B8 经菌液 PCR 及提取重组质粒经 BamH I
和 Hind III 双酶切处理鉴定与测序鉴定，如图 4 所
示均与预期结果一致，表明以正确的方向将 Bla g 8
图 2 Swiss-model预测 Bla g 8的三级结构
肌球蛋白序列 GenBank 登录号为：Marsupenaeus japonicas（日本囊对虾，ADD70028.1），Rattus norvegicus（褐鼠，AAA98534.1），Gryllotalpa orientalis（东方蝼蛄，
AAW22543），Homo sapiens（智人，AAA59895），Biston betularia（桦尺蛾，AEP43792），Lepeophtheirus salmonis（鲑疮痂鱼虱，ADD38409.1），Lonomia oblique（蠼，
AAV91411.1），Crangon crangon（褐虾，ACR43477.1），Caligus rogercresssyi（智利鱼虱，ACO11381.1），Maconellicoccus hirsutus（木槿曼粉虾，ABM55658.1），
Tribolium castaneum（ 赤 拟 谷 盗，XP976209.1），Nasonia virtripennis（ 丽 蝇 蛹 集 金 小 蜂，XP001599362.1），Camponotus floridanus（ 弓 背 蚁，EFN65648.1），
Aarpegnathos saltator（印度跳蚁，EFN85742.1），Acyrthosiphon pisum（豌豆芽，NP001119626.1），Haemaphysalis qinghaiensis（青海血蜱，AAV41826.1），Lycosa
singoriensis（黑腹狼蛛，ABX75494.1），Equus caballus（家马，XP001501584.1），Synthetic construct （ABP87672.1），Penaeus monodon（对草虾，ADV17342.1），
Litopenaeus vannamei（凡纳滨对虾，ACC76803.1），Blattelle germanic（德国小蠊）
图 3 构建的肌球蛋白轻链氨基酸序列系统进化树
2012年第9期 177龙高群等 ：德国小蠊变应原 Bla g 8 的克隆表达及进化分析
基因克隆到表达载体 pET-32a。
MLC 经分析无信号肽也不含跨膜区［13］，与凡纳滨对
虾 MLC 预测结果一致。提示德国小蠊 Bla g 8 不可
能作为膜受体起作用，也不可能是定位于膜上的锚
定蛋白或者离子通道蛋白。
结构域分析发现，该蛋白为肌球蛋白轻链，是
EF-hand 钙结合蛋白家族的一员，过敏原数据库同
源比对，Bla g 8 与变应原 Pen m 3.0101、Lit v 3.0101
及 Cup a 4 具有同源性，且这些蛋白均为肌球蛋白轻
链，是 EF-hand 钙结合蛋白家族的成员。EF-hand 家
族蛋白具有相似的结构［14］，暗示 Bla g 8 为德国小
蠊一种变应原。而本次试验也通过原核表达获得了
德国小蠊 Bla g 8 的重组蛋白，这就为下一步收集蟑
螂过敏病人血清，检测 Bla g 8 重组蛋白的变应原性
提供了理论依据。
建立 NJ 系统进化树，共分为两大支，德国小蠊
与对草虾、凡纳滨对虾聚为一小支，并与 Synthetic
construct聚为一大支 ；褐鼠、智人及家马聚为一小
支并与其他昆虫聚为一大支。其中对草虾、凡纳滨
对虾及 Synthetic construct的肌球蛋白轻链即 Pen m
3.0101、Lit v 3.0101［15］及 Cup a 4 均为 IUIS 已公布
的肌球蛋白轻链为变应原的物种均聚为一支，所有
变应原的氨基酸序列聚为一支，非变应原氨基酸序
列聚为一支。而截至目前为止，所见进化树都是按
物种进行聚类，而此次出现的按功能聚类现象未见
任何报道，该结果为下一步研究该类蛋白的结构及
进化方式奠定了基础。
M1.DNA Marker λ-Hind III ；1. 质粒 pET-32a ；2. BamH I 和 Hind III 双酶
切处理的质粒 pET-32a ；3. 重组质粒 pET32a-B8 ；4. BamH I 和 Hind III
双酶切处理的重组质粒 pET32a-B8 ；5. PCR 检测重组质粒 pET32a-B8 ；
M2. DNA 标准品 DL2000
图 4 重组质粒 pET32a-B8限制性内切酶鉴定
2.3.2 表达产物 SDS-PAGE 及 Western blotting 鉴定
SDS-PAGE 分析，在 0 h 未有目的蛋白表达，但经
4 h 后在约 42 kD（His 标签大小约为 20 kD）处有大
量重组蛋白表达（图 5），与理论预测融合蛋白大小
相一致。His-tag 抗体 Western blotting 分析显示在 42
kD 处重组蛋白能与 His-tag 抗体特异结合。阴性对
照（空质粒）并无此条带（图 6），进一步说明该条
带为融合表达所得目的蛋白。
M. 蛋白质 Marker ；1. 未经 IPTG 诱导的空质粒 pET-32a ；2. 经 IPTG 诱导
的空质粒 pET-32a ； 3. 未经 IPTG 诱导的重组质粒 pET32a-B8 ；4. 经 IPTG
诱导的重组质粒 pET32a-B8
图 5 pET32a-B8基因表达产物的 SDS-PAGE分析
M. 蛋白质 Marker ；1. 经 IPTG 诱导的重组质粒 pET32a-B8 ；2. 未经 IPTG 诱
导的重组质粒 pET32a-B8 ；3. 经 IPTG 诱导的空质粒 pET-32a
图 6 重组 pET32a-B8蛋白的Western blotting分析
3 讨论
经分析德国小蠊 Bla g 8 不含信号肽序列，同时
也不含有跨膜区，而凡纳滨对虾肌球蛋白轻链基因
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第9期178
4 结论
本研究通过 5-RACE PCR 扩增，获得德国小蠊
变应原 Bla g 8 的完整 cDNA 编码序列，含 618 bp 编
码 205 个氨基酸 ；构建原核表达重组质粒，诱导重
组蛋白表达及纯化，获得可溶性重组蛋白。
参 考 文 献
［1］ 刘国璋 , 何麟 .我国人体寄生虫及病媒昆虫染色体研究概况 .中
国寄生虫学与寄生虫病杂志 , 1989, 7（2）：128-132.
［2］ 齐欣 , 孙耕芹 . 德国小蠊生物学特性及综合治理 . 中国媒介生
物学及控制杂志 , 2004, 15（1）：73-75.
［3］ Zeiler T, Taivainen A, Rytkönen M, et al. Recombinant allergen
fragments as candidate preparations for allergen immunotherapy.
Allergy Clin Immunol, 1997, 100（6）：721-727.
［4］ Jeong KY, Hongb CS, Yong TS. Recombinant allergens for diagnosis
and immunotherapy of allergic disorders, with emphasis on cockroach
allergy. Curr Protein Pept Sci, 2006, 7（1）：57-71.
［5］ Zhou B, Ensell M, Glichstein J, et al. Characterization of the
protective and therapeutic efficiency of a DNA vaccine encoding the
cockroach allergen Bla g 1. Allergy Clin Immunol, 2006, 117（2）：
1071-1074.
［6］ Yang J, Nair U, Yoo TJ. Genetic vaccination with plasmid DNA
encoding cockroach allergen Blag-2 in mice. Allergy Clin Immunol,
2002, 109 ：209-212.
［7］ Kagen S, Muthiah R, Holinbeck JA. A new and safer method for
preserving allergen stability in human vaccines. Allergy Clin
Immunol, 2004, 113（2）（Suppl）：S110-114.
［8］ Arruda LK, Vailes LD, Hayden ML, et al. Cloning of cockroach
allergen, Bla g4, identifies ligand binding proteins（or calycins） as
a cause of IgE antibody responses. Biol Chem, 1995, 270（52）：
196-201.
［9］ 马慧 , 刘志刚 . 蟑螂重组变应原的研究进展 . 热带医学杂志 ,
2007, 23（2）：288-291.
［10］ Sookrung N, Chaicumpa W. A revisit to cockroach allergens. Asian
Pac J Allergy Immunol, 2010, 28（2-3）：95-106.
［11］ 蒋圣娟 , 孙玉军 , 张强 , 等 . 花生致敏蛋白 Ara h1 的电子克隆
及生物信息学分析 . 安徽科技学院学报 , 2009, 23（2）：31-37.
［11］ 潘书波 .1390 例高校本科生 UPI 人格健康评价效应及对策 . 中
国体育科技 , 2002, 36（6）：39-50.
［12］ Nelson HS. Tudies of allergen extract stability ：the effects of
dilution and mixing. Allergy Clin Immunol, 1996, 98（2）：
382-388.
［13］ 李文兰 , 盛小伟 , 高永华 , 等 . 凡纳滨对虾肌球蛋白轻链基
因 MLC 的克隆及表达分析 . 西南农业学报 , 2011, 24（4）：
1558-1563.
［14］ 彭鸿娟 , 陈晓光 , 王殉章 . 日本血吸虫一个新钙结合蛋白全
长编码区的克隆与功能预测 . 中国人兽共患病杂志 , 2002, 18
（2）：47-49.
［15］ Ayuso R, Grishina G, Ibáñez MD, et al. Sarcoplasmic calcium-
binding protein is an EF-hand-type protein identified as a new
shrimp allergen. Allergy Clin Immounol, 2009, 124（1）：114-120.
（责任编辑 马鑫）