全 文 ：·综述与专论· 2012年第3期
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN
收稿日期 : 2011-09-21
基金项目 : 浙江省自然科学基金项目（Y3110396）
作者简介 : 万婧 , 女 , 硕士研究生 , 研究方向 : 微生物与食品安全 ; E-mail: wanjing9687@126.com
通讯作者 : 周向阳 , 男 , 高级工程师 , 研究方向 : 食品微生物 ; E-mail: zxy@zs.ziq.gov.cn
杆状病毒在载体疫苗中应用的研究进展
万婧1 周向阳1 方维焕2
（1 舟山出入境检验检疫局，舟山 316000 ；2 浙江大学浙江省动物预防医学重点实验室，杭州 310058）
摘 要： 目前利用来源于哺乳动物的病毒作病毒载体介导动物和人体的免疫应答存在诸多问题，如预存免疫和高致病力重组
病毒的出现等。将自然条件下宿主为非哺乳类动物的病毒发展为载体的过程中，由于杆状病毒内在的免疫刺激活性、广泛的组织
趋向性及生物安全性使杆状病毒成为疫苗载体发展中的有效工具。随着分子生物学的深入发展，国内外学者应用基因工程技术对
杆状病毒转移载体进行了深入研究，并取得丰富的研究成果。对杆状病毒作为转移载体在未来载体疫苗发展中的应用进行综述。
关键词： 杆状病毒 载体疫苗 免疫 传染性疾病
Development of Baculovirus as Vaccine Vectors
Wan Jing1 Zhou Xiangyang1 Fang Weihuan2
（1Zhoushan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Zhoushan 316000；2Zhejiang Provincial Key Laboratory of Preventive Veterinary
Medicine，Hangzhou 310058）
Abstract: Application of viral vectors derived from mammal viruses to mediate immune response in animals and humans has been
greatly hindered by the problems associated with pre-existing immunity and associated toxicities. With broad tissue tropism and expanded bio-
safety profile suitably supplemented with intrinsic immunostimulatory properties, baculovirus has now evolved as a novel tool for vaccine vector
development. Baculovirus as vaccine vectors drew more and more attention. In this paper, the baculovirus as a novel tool in future development
were reviewed.
Key words: Baculovirus Vaccine vector Immunity Infectious diseases
在疫苗的多种形式中，长期以来一直应用失活
疫苗，但其最大的缺点是缺乏免疫原性，需要依次
注射多种佐剂来使其被激活，且引起的免疫应答主
要是短期的体液免疫［1］。与失活疫苗相比，活的弱
毒疫苗能诱导较强的体液和细胞免疫应答，但由于
其安全性和潜在的反复突变，限制了弱毒疫苗的广
泛应用［2］。近年来亚单位疫苗以其易于生产和安全
性好受到了广泛关注。但是，单个抗原虽然具有一
定的免疫保护性，但由于抗原谱窄，不足以引起有
效的免疫保护，而且生产成本偏高、产量低及需要
合适的佐剂限制了亚单位疫苗在疫苗发展道路上的
应用［3］。与传统疫苗相比，DNA 疫苗既能引起细胞
免疫应答又能引起抗体免疫应答，可以有效地预防
潜伏期或临床阶段的感染性疾病。但是 DNA 疫苗能
诱导自身免疫应答，并可能在靶宿主中引起免疫耐
受，也可能导致宿主基因组插入性基因突变，引起
接种后不良影响。
目前质粒载体是 DNA 疫苗载体中最常用的，而
质粒转染效率低，影响编码抗原的有效表达，从而
导致了机体不能产生有效的免疫应答，而且由于质
粒载体容量较小，限制了大分子和多价疫苗的发展。
腺病毒和痘病毒载体虽然克服了质粒转染效率和容
量方面的问题，但是又由于自身的免疫原性以及机
体内可能存在这些病毒的抗体影响了其进一步应
用［4, 5］。有研究发现，昆虫杆状病毒可以进入多种
哺乳动物细胞，并在合适的哺乳动物启动子控制下
表达外源基因，但其基因组在细胞中不复制，且对
哺乳动物细胞的生长无明显影响。近年来，由于杆
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第3期36
状病毒具有最理想疫苗转移载体的典型特征，伴随
着杆状病毒作为哺乳动物基因转运载体的不断发展，
使其成为 DNA 疫苗的载体成为可能。
1 现行的病毒载体
目前，作为载体的病毒多为哺乳动物病毒，如
腺病毒（adenovirus）、痘病毒（pox virus）、腺相关
病毒（adeno-associated vrius）、逆转录病毒（retrovir-
us）、伪狂犬病毒（pseudorabies virus）、水泡性口炎病
毒（vesicularsto matitis virus ，VSV）和禽痘病毒（fowlpox
virus）等，其中对腺病毒和痘病毒载体的研究最为
深入。在腺病毒载体疫苗的研究中 Ad5 复制缺陷型
的腺病毒载体是最常应用的，其能在体内形成高效
的体液和细胞免疫应答，而且具有诱导保护性免疫
应答抵抗疾病的能力［6］。但潜伏期和临床期研究表
明，啮齿类及非人类灵长类对 Ad5 的预存免疫可减
弱或抵消这些疫苗的免疫原性，对 Ad5 的高度预存
免疫限制了 Ad5 载体的应用［7, 8］。Ad5 型腺病毒进
入细胞依赖腺病毒纤维顶端的节结与细胞膜的柯萨
奇 - 腺病毒受体（coxsackie and adenovirus receptor，
CAR）结合，由于与 Ad5 的纤毛小结结合的 CAR 广
泛存在于各种细胞的表面，这就决定了腺病毒感染
的广泛性，然而这也决定了其缺乏靶向性［9］。目前
很少感染人类的 Ad35 及 Ad26 型腺病毒逐渐发展成
为腺病毒载体疫苗的核心［10］。但与 Ad5 载体的转导
效率相比，Ad35 和 Ad26 载体的转导效率较低，而
且健康成年人可以产生腺病毒特异长期 CD4+T 细胞
免疫应答，可以识别不同腺病毒血清型的保守抗原
决定簇，这表明稀少血清型的疫苗载体的发展存在
局限性［8］。其他腺病毒载体，如牛 Ad3、绵羊 Ad7、
猪和犬腺病毒载体也都可发展为疫苗载体，但在人
体上的应用效率及安全性仍需探究［11, 12］。
痘病毒能有效地将外源抗原展示给免疫系统，
诱导机体产生强效的免疫反应来对抗各种疾病。一
些 AIDS、疟疾和癌症的治疗疫苗就是由痘病毒重
组体发展而来的。但是，在这些载体疫苗的使用过
程中频繁发生局部或全身不良反应，限制了痘病毒
作为疫苗载体的研究。在弱毒株中，改造的痘病毒
Ankara（MVA）和 NYVAC 以其良好的安全性及高
效性被认为是潜在的临床疫苗［13］。由于痘病毒科各
个属内的成员间具有抗原相关性，因此痘病毒载体
用作活疫苗时，须慎重考虑这种抗原关系。因为若
使用同属的痘病毒载体，先前存在的疫苗对载体的
免疫会抑制病毒输入，影响病毒到达和感染靶组织，
从而降低病毒编码外源抗原的表达，最终影响针对
抗原的免疫反应［14］。此外，载体疫苗的反复接种可
能产生抗载体免疫，这会导致免疫应答减弱。同样，
并不能确定 NYVAC 诱导的保护性免疫应答是否长
期存在，而且 NYVAC 诱导产生的抗体效价明显低
于传统疫苗［15］。尽管如此，NYVAC 作为载体疫苗
在抵抗许多疾病上仍有广阔的前景。
2 杆状病毒成为载体疫苗发展中的高效工具
杆状病毒是双链 DNA 病毒，主要是鳞翅目、
膜翅目和双翅目昆虫的病原体，其基因组大小为
80-160 kb，位于直径为 30-60 nm、长 300 nm 的杆
状核衣壳中，具有较大的柔韧性，可以容纳较大片
段的外源基因插入。在杆状病毒众多成员中，研
究和利用最多的是苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒
（Autographa californica multicapsid Nucleopolyhedrovi-
rus，AcMNPV）。一般认为该种高表达载体仅限于介
导外源基因在昆虫细胞内表达，在非受纳细胞中不
能发挥作用。通过研究发现杆状病毒可以感染哺乳
动物和人的某些细胞，但是其病毒基因组在哺乳动
物细胞中不能复制和转录。当杆状病毒介导的外源
基因在哺乳动物细胞活性启动子的控制下表达时，
外源基因可以在哺乳动物细胞中高效转移并表达。
巨细胞病毒极早期启动子（cytomegalovirus immediate
early promoter，CMV-IE）、劳氏肉瘤病毒（RSV）启
动子、鸡 β-肌动蛋白启动子（CAG）、猿病毒 40 启
动子（SV40）、人类泛素 C 和乙肝病毒（HBV）启
动子 / 增强子已用于杆状病毒介导的外源基因在哺
乳动物细胞中的表达［16］。除这些成果外，杆状病毒
还能在体内进行基因转移，如小鼠的肝脏、脾脏、
精巢、心脏和骨骼肌肉［17］，大鼠的视网膜脉管系统
和脑［18］，兔的颈动脉和椎间圆盘［19］，表明杆状病
毒具有广泛的组织趋向性。
杆状病毒进入哺乳细胞主要依靠网格蛋白的
内吞和胞饮作用，借助于低 pH 值引发的囊膜蛋白
GP64 与胞饮体膜的融合作用［20］。为提高杆状病毒
2012年第3期 37万婧等 ：杆状病毒在载体疫苗中应用的研究进展
的转导效率和目的基因的表达效率，将水泡性口炎
病毒 G 蛋白（VSV-G）基因插入 AcMNPV 基因组
建成一个假型病毒。研究表明，无论在体内还是体
外，与未改造过的杆状病毒载体相比，VSV-G 假
型病毒载体介导的基因转移效率更高效［21］。但是，
VSV-G 的高度融合引起大量的多核体形成并提高了
细胞毒素的影响，而且全身接种后血清补体系统会
使 VSV-G 假型载体立即失活。目前利用杆状病毒囊
膜蛋白 GP64 将逆转录病毒和慢病毒假型化，具有
高效的基因转导效率并能克服 VSV-G 产生的细胞毒
性［22］。由于 VSV-G 假型病毒载体在保护性免疫应
答形成过程中的高效性，在载体疫苗发展中应用广
泛，但是免疫后的副作用并不可知。
鉴于杆状病毒在体内外的研究成果，其在疫
苗载体发展中成为一种有效工具。与其他病毒类载
体相比，杆状病毒作为载体，具有以下优点 ：自然
条件下，由于杆状病毒在非纳受细胞内其大部分
基因的转录沉默，因而在哺乳动物细胞中不能复
制，具有较高的生物安全性，在体内基因转移过程
中避免了先天抗病毒免疫的中和问题 ；杆状病毒
内在的免疫激活物在生产疫苗时减少了佐剂的需
求 ；多个外源基因的同时转移，广泛的细胞特异
性，高的滴度和低细胞毒性使得杆状病毒在疫苗发
展中占有重要地位 ；很短的时间里能获得携有外
源基因的重组杆状病毒，加速了疫苗的生产过程 ；
昆虫细胞可使用无血清培养基且可以大规模使用，
这简化了纯化和培养过程。上述优势都可使杆状
病毒发展成为载体疫苗，诱导产生准确而有效的
免疫应答来防止人类和动物的感染性疾病。
3 杆状病毒作为疫苗载体的应用
Aoki 等［22］首先提出了利用携带有哺乳动物细
胞启动子的杆状病毒载体进行疫苗研究的方案，将
表达伪狂犬病毒糖蛋白基因 B（gB）的重组杆状病
毒注射小鼠，产生了针对病毒糖蛋白的体液免疫反
应。此后的许多研究证明，重组杆状病毒可以在
多种动物体内诱导体液和细胞免疫来抵抗各种疾
病（表 1）。Facciabene 等［23］ 用表达丙肝病毒 E2
囊膜糖蛋白和癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，
CEA）的重组 VSV-G 假型病毒载体诱导小鼠产生
了抗 E2 特异性的 CD8+T 细胞免疫应答和抗 CEA 特
异性的 CD4+T 细胞免疫应答，而且在免疫过程中可
以检测到到炎症性细胞因子 α-肿瘤坏死因子和白介
素-6。另有研究发现，给小鼠注射不同剂量的共表
达猪蓝耳病病毒（porcine reproductive and respiratory
syndrome virus，PRRSV）的 GP5 与 M 蛋白的重组
VSV-G 假型病毒载体后，均可诱导机体产生针对
PRRSV 的中和抗体与 γ- 干扰素（γ-IFN），但是免疫
水平呈现剂量依赖性特点，而且低剂量的重组杆状
病毒诱导产生的中和性抗体与干扰素水平也比编码
相同抗原基因的 DNA 疫苗高［24］。而且，Lu 等［25］
用含有 PRRSV ORF7 的 C 端编码区域的特异 shRNA
的 VSV-G 假型化杆状病毒成功的抑制了 PRRSV 在
Marc145 细胞中的复制。此外，有研究显示，表达
流感病毒血细胞凝集素（influenza hemaaglutinin，
HA）的重组 VSV-G 假型病毒载体能诱导幼鸡产生
HA 特异性抗体，而且能抵抗 100 LD50 的 H5N1 的
感染［26］。此研究中体内的高效转导和有效地传递到
树突细胞是增强的免疫原性的基础。另有研究表明，
将重组有日本脑炎病毒（Japanese encephalitis virus，
JEV）E 蛋白基因的假性病毒免疫小鼠后，可诱导产
生高于 DNA 疫苗中和性抗体、IN F-γ 水平，而且用
野生型 JEV 攻击后，假型病毒也可获得更好的保护
效率［27］。此外，在巨细胞病毒极早期启动子（CMV-IE）
控制下用 VSV-G 假型病毒载体表达猪圆环病毒的衣
壳蛋白（ORF2）发现，在相同的剂量条件下，重组
杆状病毒疫苗比编码 ORF2 蛋白的 DNA 疫苗具有更
强的免疫原性，这表明杆状病毒介导的免疫应答可
能比抗原更为高效。这些研究结果说明杆状病毒载
体疫苗相对于 DNA 疫苗可更有效地刺激机体产生体
液免疫与细胞免疫反应。
近年来携带自身囊膜糖蛋白 GP64 未假型化的
杆状病毒在疫苗发展中起到了重要作用。Yoshida
等［28］用表达伯氏疟原虫的环子孢子蛋白（plasmodium
berghei circumsporozoite protein，PbCSP）的未假型化
重组杆状病毒免疫小鼠后，诱导机体分泌了高水平
的特异性抗体和 INF-γ。利用杆状病毒囊膜糖蛋白
GP64 的跨膜区域（TM）和细胞质区域（CTD）在
小鼠和猪中表达 JEV 的 E 蛋白也能诱导产生高效价
的特异性抗体［29］。Xu 等［30］用同样的方法表达了
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第3期38
传染性法氏囊病（Infectious bursal disease，IBD）的
VP2 蛋白，免疫鸡后能产生特异性抗体，并能有效
地保护鸡，使其免受 IBD 的感染。Yang 等［31］研究
发现，在哺乳动物细胞中同时表达囊膜糖蛋白 GP64
的 CTD 与流感病毒 HA 能提高基因转移和外源基
因表达效率，表明 HA 与杆状病毒囊膜结合可增强
基因转导水平，提高杆状病毒疫苗的免疫原性。利
用表达 SARS 冠状病毒刺突蛋白和核衣壳蛋白的重
组杆状病毒免疫小鼠，能诱导产生抗原特异性中和
抗体免疫和 CD4+T 细胞免疫，说明了未假型化杆状
病毒也可以诱导体液和细胞免疫［32］。Suzuki 等［33］
通过未假型化杆状病毒介导流感病毒 A 和 B 的 NP
基因的特异性 shRNA 结构来阻止这两种病毒的产
生，此前他们的研究证实埃 - 巴二氏病毒核抗原
（epstein Bar nuclear antigen，EBNA）能有效阻断细
胞内丙肝病毒（hepatitis C virus，HCV）的复制，而
且至少可以在 14 d 内阻断 HCV 核心蛋白的表达［34］。
而 Starkey 等［35］构建了表达乙肝病毒（hepatitis B
virus，HBV）特异的 shRNA 的重组杆状病毒，在体
外能成功的阻断 HBV 复制。有研究表明，利用鸟
呼肠孤病毒（avian reoviruses）的 σC 和 σB 蛋白与
囊膜糖蛋白 GP64 融合表达的重组杆状病毒免疫小
鼠，可以诱导产生高效病毒中和活性的抗原特异性
抗体［36］。之前也用类似融合蛋白的方法表达了手足
口病病毒（foot and mouth disease virus）的 P1 区域
和牛疱疹病毒的糖蛋白 D［37, 38］。在无佐剂辅助情况
下，Yoshida 等［39］将在 ph、CMV 两个启动子下表
达伯氏疟原虫 CSP 基因的重组杆状病毒免疫小鼠，
表 1 利用杆状病毒载体构建的载体疫苗
重组杆状病毒载体 病原 抗原 物种 文献
野生型
Pseudorabies virus Glycoprotein B Pig ［22］
Influenza seasonal H1N1 virus Hemagglutinin Human ［48］
Influenza A and B viruses Nucleoprotein Human ［33］
Hepatitis C virus（HCV） HCV core protein Human ［34］
Hepatitis B virus HBV surface antigen Human ［35］
White Spot Syndrome virus Envelope protein VP28 Shrimps ［55］
Avian Influenza H5N1 Hemagglutinin Avian/Human ［56］
Swine origin new H1N1 Hemagglutinin Human
Severe acute Respiratory Syndrome Nucleocapsid/Spike protein Human ［32］
VSV-G 假型 Classical swine fever virus Envelope protein E2 Swine ［57］
Porcine reproductive and respiratory syndrome virus ORF7 GP3 GP5 & M protein Pig ［24］
［25］
［53］
Porcine circovirus 2 ORF2 Swine ［49］
Japanese encephalitis virus Envelope protein Human ［50］
Toxoplasma gondii Immunodominant surface antigen（SAG1） Human ［27］
H5N1 Hemagglutinin Avian/Human ［26］
Hepatitis C E2 glycoprotein Human ［23］
Rabies virus（RABV） G protein Animal ［54］
GP64 融合型
East coast fever / Theileria parva p67 protein Cattle ［51］
Malaria Circumsporozoite protein Human ［39］
Avian reovirus Sigma B and Sigma C protein Avian ［36］
H5N1 Hemagglutinin Human ［56］
Bovine herpesvirus Glycoprotein D Bovine ［38］
Foot and mouth disease P1 protein Animal ［37］
Malaria merozoite surface protein 1 Human ［52］
infectious bursal disease virus VP2 Chicken ［30］
Japanese encephalitis virus E envelope protein Human ［29］
2012年第3期 39万婧等 ：杆状病毒在载体疫苗中应用的研究进展
可同时诱导 TH1 类和 TH2 类免疫反应，不但能产生
高滴度的抗 PbCSP 特异性抗体和特异性的 CD8+T 细
胞免疫反应，而且免疫动物获得了完全保护，而单
独使用 CMV 启动子在体内表达的方式仅能获得 60%
的保护。Lin 等［40］用类似方法表达流感病毒的 HA，
免疫小鼠后，可诱导产生高于 DNA 疫苗的免疫反应，
而且能保护小鼠免受 H9N2 的感染。
4 提高体内基因转移效率
许多研究已经证实其在动物模型中的有效性。
但杆状病毒对人体血清中补体因子高度敏感，这样
体内应用杆状病毒将受到一定的限制。要使杆状病
毒作为疫苗载体得到广泛使用，必须克服与杆状病
毒介导体内基因转移的障碍。研究者已尝试用基因
和化学方法来抵抗人的补体系统。将人补体调节蛋
白衰变加速因子（decayaccelerating factor，DAF）组
合入杆状病毒囊膜，直接接种补体充足的新生鼠后
转导效率提高［41］。另外有研究证实携带有人血凝结
因子 IX（human coagulation factor IX，Hfix）的杆状
病毒具有抗补体特性。Yang 等［42］发明了一种化学
方法，通过静电作用在杆状病毒载体上覆盖一层带
正电荷的聚乙烯亚胺，聚乙烯亚胺包被的杆状病毒
粒子在体内具有抵抗人和小鼠血清调节灭活的能力。
而 Kim 等［43］试图利用聚乙二醇连接两个病毒粒子
产生补体抗性。对杆状病毒不断的研究势必会促进
杆状病毒载体补体抗性的发展。
5 杆状病毒作为疫苗载体的安全性介绍
杆状病毒具有高度的种属特异性，目前尚未发
现杆状病毒可以感染节肢动物以外的生物。给小鼠、
豚鼠和仓鼠添食活的杆状病毒粒子，对快速分裂的
骨髓细胞的染色体并未造成任何影响［44］。Gao 等［45］
证实杆状病毒感染人肝脏星状细胞并没有产生细胞
毒性、抑制细胞生长和调制影响。而且有研究表明
杆状病毒 DNA 转导入哺乳动物细胞后，超过培养时
间便会发生降解［46］。Heimpel 等［47］在 5 d 时间内对
测试者添食 58.2 亿多角体，评测活的杆状病毒粒子
对人类的安全问题，安全测试结果显示都没有病毒
炎症、过敏和副作用，而且在试验阶段测试者中没
有出现临床或实验室反应。另外，对感染杆状病毒
的一些动物模型进行毒力致病性和皮肤刺激敏感性
试验，并未发现任何负面影响。最近对以杆状病毒
为基础的猕猴疫苗的安全性进行评估，结果显示不
但不会引起任何毒性，而且在高剂量条件下也是安
全的。
6 展望
以上研究表明杆状病毒载体是疫苗发展过程中
极其有效的工具。与其他病毒载体相比，利用杆状
病毒作为基因传递的载体具有很多优势。但杆状病
毒作为疫苗载体的应用仍处于初始阶段，因此深入
了解杆状病毒的转导机制将尤为重要。此外，明确
杆状病毒复制和出芽的必备元件将有助于构建简化
基因组的杆状病毒载体，这无疑促进了调控元件的
快速运转，从而使杆状病毒载体进入临床试验阶段。
总之，杆状病毒载体将在未来变革疫苗技术中发挥
重要作用。
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（责任编辑 狄艳红）