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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第6期
脂肪酶是一类可水解油脂的酶类，可在油水界
面催化甘油三酯水解生成甘油及长链脂肪酸，作为
生物催化剂，广泛应用于油脂化学、食品加工、精
细化工、去污剂添加剂、手性化合物拆分、生物柴
油合成等诸多工业领域［1，2］。
米黑根毛霉脂肪酶（RML）是一条 α/β 型单链
多肽［3］，其较好的立体选择性、较高的转化率和稳
定性，不仅能催化油脂水解，也能在非水相中催化
收稿日期 ：2012-11-23
基金项目 ：“十二五”农村领域国家科技计划课题（2011BAD22B05），中科院广州能源所博士启动基金项目（y107rb1001）
作者简介 ：苗长林，男，硕士，助理研究员，研究方向 ：生物能源研究 ；E-mail ：304796926@qq.com
通讯作者 ：吕鹏梅，女，研究员，博士生导师，研究方向 ：生物质能 ；E-mail ：lvpm@ms.giec.ac.cn
米黑根毛霉脂肪酶基因的克隆、表达及活性分析
苗长林1  罗文1  刘姝娜1  吕鹏梅1  李惠文1   
杨玲梅1  袁振宏1  蒋剑春2
（1. 中国科学院广州能源研究所 中国科学院可再生能源与天然气水合物重点实验室，广州 510640 ；2. 中国林业科学研究院
林产化学工业研究所，南京 210042）
摘 要： 以米黑根毛霉（Rhizomucor miehei）为出发菌株，采用 UNIQ-10 柱式 Trizol 总 RNA 抽提试剂盒提取其总 RNA，反转录 -
聚合酶链式反应（RT-PCR）扩增出米黑根毛霉脂肪酶（RML）结构基因。构建真核重组表达质粒 RML-pPIC9K，电转化 His+ 缺陷
型巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115，利用 MD-MM 平板及 PCR 方法筛选和鉴定出重组子，进行甲醇诱导表达。结果表明，
RML 基因能够在巴斯德毕赤酵母中实现高效表达。重组子发酵液经 SDS-PAGE 分析显示获得了与预期大小（约 39 kD）一致的蛋
白表达特异条带，用 NaOH 滴定法测其活性，酶活可达 84 U/mL。
关键词 ： 米黑根毛霉 脂肪酶 毕赤酵母 基因克隆 基因表达
Cloning，Expression and Activity Analysis of Lipase Gene from
Rhizomucor miehei
Miao Changlin1 Luo Wen1 Liu Shuna1 Lü Pengmei1 Li Huiwen1
Yang Lingmei1 Yuan Zhenhong1 Jiang Jianchun2
（1. Key Laboratory of Renewable Energy and Gas Hydrate，Guangzhou Institute of Energy Conversion，CAS，Guangzhou 510640 ；
2. Institute of Chemical Industry of Forest Products，CAF，Nanjing 210042）
Abstract:  Lipase gene cDNA fragment from Rhizomucor miehei（RML）was amplified by RT-PCR method. Expression vector RML-
pPIC9K containing lipase gene was constructed and the gene was expressed in His4 mutant Pichia pastoris yeast GS115. Recombinant Pichia
strains were obtained by minimal olive oil-methanol plates screening and confirmed by PCR. The expression product of RML gene was analysis
by SDS-PAGE, and molecular weight of the expressed protein was estimated to be 39 kD. The activity of lipase was up to 84 U/mL determined by
the method of titration of NaOH. The result indicated that RML gene was functionally overexpressed in Pichia pastoris.
Key words:  Rhizomucor miehei Lipase Pichia pastoris Gene clone Gene expression
酯合成、转酯化和酸解等反应。因此在医药、化工
工业等行业具有非常广泛的应用前景［4-6］。但天然的
米黑根毛霉菌株脂肪酶产量低、成分不稳定，发酵
周期长，远不能满足目前的需求。毕赤酵母（Pichia
pastoris）表达系统是一种比较成熟的应用于外源蛋
白表达的表达体系［7，8］。该表达体系含有特有的强
启动子 AOX（醇氧化酶基因），因此，当在 AOX 基
因前插入外源蛋白基因时，可获得大量外源表达 ；
2013年第6期 123苗长林等 ：米黑根毛霉脂肪酶基因的克隆、表达及活性分析
另外毕赤酵母菌体内无天然质粒，外源蛋白基因是
被整合到毕赤酵母染色体上，随染色体复制而复制，
不易丢失，与现有的其它表达系统相比，具有良好
的遗传稳定性。现已有多种蛋白质在该系统中得以
高效表达，如王乐乐［9］报道了华根霉前导肽脂肪
酶基因的克隆及其表达，摇瓶发酵后毕赤酵母分泌
表达 161 U/mL，其比活比野生型华根霉脂肪酶高约
43 倍。孙金鹏［10］将南极假丝酵母脂肪酶 B 在毕赤
酵母中得到成功表达，摇瓶发酵 120 h 后上清液酶
活力达到 46 U/mL。阎金勇［11］报道的白地霉 Y162
脂肪酶毕赤酵母中表达菌，摇瓶发酵 96 h 后，毕
赤酵母分泌表达重组脂肪酶酶活为 55 U/mL。Huge-
Jensen 等［12］将长度达 1.2 kb 的编码 RML 的 cDNA
序列插入米曲霉质粒 pBoel-777 构建表达质粒 pRML-
787，该基因在米曲霉 α-淀粉酶启动子和黑曲霉糖化
酶终止子的控制下进行了表达。
米曲霉所表达分泌的脂肪酶 rRML 具有活性，
经过纯化的脂肪酶 rRML 在还原性 SDS 凝胶上表现
出与天然酶一样的性质和氨基酸组成。因此，利用
毕赤酵母表达米黑根毛霉脂肪酶对于提高其产量、
降低成本、实现工业化应用具有重要意义。本研究
根据米黑根毛霉脂肪酶基因设计引物，应用 PCR 技
术扩增全长序列，并与表达载体 pPIC9K 连接，构
建重组质粒，转化毕赤酵母表达系统，旨在实现脂
肪酶的高效表达。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株及质粒 米黑根毛霉、毕赤酵母 GS115、
大肠杆菌 DH5α 均为本实验室保存 ；pMD18-T 载体
为上海生工生物工程技术服务有限公司产品 ；表达
载体 pPIC9K 购自 Invitrogen 公司。
1.1.2 培养基 米黑根毛霉斜面培养基 ：20% 马铃
薯汁 1 L、葡萄糖 20 g/L、KH2PO4 3 g/L、 MgSO4·7H2O
1.5 g/L、维生素 B1（硫胺素）Trace 8 mg/L、琼脂
20 g/L，pH6。LB、YPD、MD、MM、BMGY、BMMY
培养基按 Invitrogen 公司操作手册推荐方法配制。
1.1.3 主要试剂与仪器 T4 DNA 连接酶、限制性内
切酶 EcoR Ⅰ、Not Ⅰ、Sal Ⅰ、DNA Marker DL2000
和 蛋 白 质 Marker、 总 RNA 提 取 试 剂 盒 购 均 购 自
TaKaRa 公司 ；Taq DNA 酶、AMV 第一条链合成试
剂盒、无氨基酸酵母基础氮源 YNB 均购自上海生工
生物工程技术服务有限公司 ；DNA 回收试剂盒购自
北京鼎国生物技术有限公司 ；生物素、G418 购自美
津生物公司 ；SDS、过硫酸铵、丙烯酰胺及 N，N-
甲叉双丙烯酰胺等试剂均为市售国产分析纯。PCR
仪，Techne 公司 ；电泳仪，Phamacia 公司 ；高速离
心机，Sorvall 公司 ；DK-8D 型电热恒温水槽，上海
精宏实验设备有限公司。
1.2 方法
1.2.1 引物设计及合成 根据 GenBank 中的已报道
的 RML 基因序列（A02536）设计引物，上游 ：5-
CGGCGAATTCGTGCCAATCAAGAGACAATCAAAC-
3（下划线为 EcoR Ⅰ酶切位点）；下游 ：5-CAGCG-
CGGCCGCAGTACAGAGGCCTGTGTTGATACC-3（下
划线为 Not Ⅰ酶切位点）。引物由上海生工生物工程
技术服务有限公司合成。
1.2.2 RML 基因扩增 采用 UNIQ-10 柱式 Trizol 总
RNA 抽提试剂盒提取米黑根毛霉总 RNA，具体操作
步骤按试剂盒说明书进行。以提取的总 RNA 为模板，
采用 AMV 第一链 cDNA 合成试剂盒，获得 cDNA 第
一条链，反应条件为 ：70℃热变性 10 min，冰浴，
加入反转录酶，30℃ 10 min，42℃ 1 h，70℃保温
15 min 后冰上冷却。以合成的 cDNA 为模板，通过
上、下游引物，经 PCR 扩增 RML 基因，反应条件
为 ：94℃预变性 2 min ；94℃变性 45 s，60℃退火 30
s，72℃延伸 1.5 min，共 30 个循环 ；最后 72℃延伸
10 min。扩增产物经 1% 琼脂糖凝胶电泳分析。
1.2.3 目的基因的克隆及测序 回收 PCR 扩增产物，
与 pMD18-T 载体在 16℃条件下连接过夜，转化感受
态细胞 E.coli DH5α，经 Amp 抗性筛选阳性克隆，提
取质粒，进行 PCR 鉴定。鉴定正确的阳性克隆菌送
上海生工生物工程技术服务有限公司测序。测序正
确的质粒命名为 pMD18-T-RML。
1.2.4 重组表达质粒的构建 重组克隆质粒 pMD18-
T-RML 和 表 达 载 体 pPIC9K 分 别 用 限 制 性 内 切 酶
EcoR Ⅰ和 Not Ⅰ双酶切，回收目的基因片段及载体
片段进行连接，连接产物转化感受态 E.coli DH5α。
经 Amp 抗性筛选阳性克隆，提取质粒，进行 PCR
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第6期124
及 EcoR Ⅰ和 Not Ⅰ双酶切鉴定。鉴定正确后，委托
上海生工生物工程有限公司进行测序。将鉴定正确
的重组表达质粒命名为 pPIC9K-RML。
1.2.5 毕赤酵母转化及筛选 SalⅠ线性化上述构建
成功的重组质粒，电转化至宿主菌毕赤酵母 GS115
上，涂布于 MD 平板上，28℃培养 2-3 d ；再将 MD
平 板 长 势 好 的 转 化 子 转 至 G418-YPD 平 板 上（ 含
G418 浓度分别为 1、2、3、4 和 5 mg/mL），28℃培
养 3-4 d，然后将 G418-YPD 平板上出现的转化子接
种于（含有橄榄油、溴甲酚绿）MM 平板上，28℃
倒置培养 3-4 d，每隔 24 h 添加甲醇诱导 ；挑取经
过 G418 抗性和活性平板透明圈筛选的高抗性和水解
透明圈较大的转化子，PCR 鉴定质粒是否导入，并
选择最佳转化子进行诱导表达［13］。
1.2.6 目的基因的诱导表达 挑取最佳转化子，接
种 至 BMGY 培 养 基 中，28 ℃，200 r/min 震 荡 培 养
48-72 h 至 OD600=2-6，离心收集菌体，用 BMMY 培
养基重新悬起菌体至 OD600≈1，28℃，200 r/min 震
荡培养，每隔 24 h 加甲醇，使终浓度达 0.5% 进行
诱 导 表 达。 分 别 在 24、48、72、96、120 及 144 h
取样测定脂肪酶活力［14］。
1.2.7 表达产物的 SDS-PAGE 分析 取连续诱导培
养 144 h 重组转化子发酵上清液 500 μL 超滤浓缩 5
倍，以 10 μL 上样，进行 12% SDS-PAGE 电泳，考
马斯亮蓝 R250 染色，分析检测目的蛋白的表达水
平和分子质量。
1.2.8 脂肪酶酶活的定量测定 采用 NaOH 滴定法，
以乳化橄榄油为底物，测定酶活性［14］。在反应条件
下，每分钟分解底物产生 1 μmol 脂肪酸的酶量定义
为 1 个脂肪酶国际单位。
1.2.9 酶学性质检测
1.2.9.1 最适温度 测定不同温度（20℃、25℃、
30℃、35℃、40℃、45℃和 50℃）下水解酶活，确
定脂肪酶最适温度。每个温度测 3 次，酶活取平均值。
1.2.9.2 最 适 pH 测 定 不 同 pH 值（pH5.0-6.0 的
NaAc-HAc 缓 冲 液，pH6.0-6.5 的 His-HCl 缓 冲 液，
pH7.0-9.0 的 Tris-HCl 缓 冲 液 及 pH9.0-11.0 的 Gly-
NaOH 缓冲液）下的水解酶活，确定脂肪酶的最适
pH。每个 pH 测 3 次，酶活取平均值。
1.2.9.3 金属离子对酶活的影响 分别添加终浓度
为 2 mmol/L 的不同金属盐离子（Ca2+、Mg2+、Cu2+、
Fe2+、K+ 和 Zn2+）到脂肪酶溶液中，4℃处理 1 h 时，
在最适温度和最适 pH 条件下，测定脂肪酶的水解活
力，以不加金属离子的底物溶液为对照，研究金属
离子对其酶活的影响，酶活取 3 个平行数据平均值。
1.2.9.4 底物链长特异性 配制 10 mmol/L 的不同
碳链长度的底物对硝基苯酚酯（C2、C4、C8、C10、
C12、C14、C16）的乙腈溶液，依次加入乙醇和 50
mmol/L Tris-HCl 缓冲液，使最终 V乙腈∶V乙醇∶VTris-HCl=
1∶4∶95（V/V/V）。 将 发 酵 液 12 000 r/min 离 心 1
min 后，取适当稀释后的 50 μL 酶液加入到 4 mL 经
45℃预热 5 min 后的底物中，反应 5 min 后，加入
10 μL 0.5 mol/L EDTA 立即放冰水中中止反应。用紫
外可见分光光度计（405 nm）读取吸光度值。通过
不同底物的水解酶活力，确定脂肪酶的链长偏好性。
不同底物的酶活测 3 次，取其平均值。
2 结果
2.1 总RNA的鉴定
1% 琼脂糖凝胶电泳分析可见所提取的米黑根
毛霉总 RNA，具有真核微生物所特有的 28S rRNA
和 18S rRNA 两条清晰条带，亮度比约为 2∶1，完
整性较好。
2.2 RML基因扩增产物及重组克隆质粒的鉴定
RML 基因扩增基因的 RT-PCR 扩增产物经 1%
琼脂糖凝胶电泳分析，可见约 1 100 bp 左右的特
异条带，大小与预期相符（图 1）。重组克隆质粒
pMD18-T-RML PCR 鉴 定 结 果 表 明，RML 基 因 与
pMD18-T 质粒构建正确。测序结果表明，RT-PCR
扩增的核酸序列与 GenBank 中登录的 RML 的 cDNA
序列（A02536）完全一致。
2.3 pPIC9K- RML重组表达质粒的鉴定
重组表达质粒 pPIC9K-RML 经 EcoRⅠ和 NotⅠ
双酶切，琼脂糖凝胶电泳分析可见约 1 100 bp 的
目 的 基 因 片 段 和 载 体 片 段（ 图 2）。 测 序 结 果 与
GenBank 中登录的序列完全一致。
2.4 重组酵母的筛选及鉴定
将 酶 切 鉴 定 和 测 序 正 确 的 重 组 质 粒 pPIC9K-
RML 经 Sal Ⅰ酶切线性化后，电转化巴斯德毕赤酵
母。质粒构建流程见图 3。
2013年第6期 125苗长林等 ：米黑根毛霉脂肪酶基因的克隆、表达及活性分析
挑选经 MD-MM 平板筛选获得的重组转化子，
用试剂盒提取其基因组后，PCR 鉴定显示，在约
1 100 bp 位置处扩增出与目的基因片段大小一致的
特异性条带，而对照未扩增出条带，说明 RML 已正
确整合入重组酵母转化子的基因组中。
2.5 酵母菌的诱导表达
经过 G418（含 G418 浓度为 5 mg/mL）抗性和
溴甲酚绿活性平板透明圈筛选的高抗性和水解圈较
大的转化子进行摇瓶发酵。重组子的产酶能力定量
分析在摇瓶发酵条件下进行，以 0.5% 甲醇诱导表
达。取发酵液离心收集上清，用橄榄油平板检测活
性，在重组酵母发酵上清液周围可观察到明显的透
明圈（图 4），以橄榄油为底物，用 NaOH 滴定法对
纯化后的重组蛋白测定酶活性。结果（图 5）显示，
当甲醇诱导表达时间为 120 h 时，重组子的发酵液
酶活达 84 U/mL，较未优化的原始菌提高了 8 倍。
发酵上清液中蛋白质的 SDS-PAGE 检测结果（图 6）
表明，重组菌诱导表达后在 39 kD 处出现了 1 条蛋
白带［15］，与 RML 的理论分子量大小一致，而对照
GS115/pPIC9K 的诱导表达产物则未见此条带。
M 1 2 3
2000
bp bp
11001000
500
M ：DNA Marker DL2000 ；1-3 ：RML 基因 PCR 产物
图 1 RML 基因的 PCR 扩增
M 1 2
2000
bp bp
11001000
750
500
M ：DNA Marker DL2000 ；1，2 ：pPIC9K-RML 经双酶切产物
图 2 毕赤酵母表达质粒酶切鉴定
Amp
pMD18-T-RML
3 784 bp
Not I
RML
EcoR I
Amp
pPIC9K
9 300 bp HIS4
EcoR I
Not I
Sal I
Kan
Not I
RML
EcoR I
HIS4
Sal IKan
pPIC9K-RML
10 392 bp
Amp
T4 DNA lipase
RML
EcoR I/Not I
EcoR I/Not I
5 A˃oX1
3 A˃oX1
5 A˃oX1
3 A˃oX1
图 3 穿梭表达质粒 pPIC9K-RML 的构建
ሩ➗㓴
䈅傼㓴
图 4 重组毕赤酵母胞外脂肪酶活性检测
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0 24 48 72 96 120 144ਁ䞥ᰦ䰤h
䞦⍫
࣋U
/m
L
图 5 重组毕赤酵母发酵产酶曲线
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第6期126
2.6 最适温度、pH及金属离子和底物对脂肪酶特
性的影响
由图 7 可知，米黑根毛霉脂肪酶最适温度为
97.2
kD
66.4
44.3
29.0
20.1
14.3
M 1 2 3
M ：蛋白质分子质量标准 ；1，2 ：重组酵母表达产物 ；3 ：GS115 对照
图 6 重组酵母发酵上清液的 SDS-PAGE
0
20
40
60
80
100
20 60⑙ᓖć
⴨ሩ
䞦⍫
%
25 30 35 40 45 50 55
0
20
40
60
80
100
5
pH
⴨ሩ
䞦⍫
%
106 7 8 9
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
Ca2+ 䠁኎⿫ᆀ
⴨ሩ
䞦⍫
%
Mg2+ Cu2+ Fe2+ Zn2+ K+ ሩ➗ 0
20
40
60
80
100
C4 ᓅ⢙⻣䬮䮯ᓖ
⴨ሩ
䞦⍫
%
C8 C10 C12 C14 C16
图 7 酶的最适温度、最适 pH、不同盐离子及不同底物对脂肪酶活力影响
40℃，属于中温性脂肪酶。其最适 pH 为 8，且 pH
作用范围较宽（pH7.0-9.0），稳定性较好。金属离子
中，Ca2+ 和 Mg2+ 能提高脂肪酶的活力，其中 Ca2+ 作
用最为明显，达到 175%。Cu2+、Fe2+ 和 Zn2+ 对此脂肪
酶有较强的抑制作用，尤其是 Fe2+，仅保留 19.78%
的残余酶活力。脂肪酶对中长度碳链底物有选择性，
最适作用底物为 12 个碳的对硝基苯酚酯，对 C16 长
链酯也有较高的活性，对短链酯的活性较弱。
3 讨论
随着环保意识的增强和能源危机的影响，以动
植物油脂为原料生产的生物柴油作为一种可再生、
易降解、无毒、含硫量低的清洁能源，目前已经受
到世界各国的普遍关注［16］。但是传统工厂化生物柴
油制备工艺一般采用强酸、强碱作为催化剂，用强酸、
强碱产生的大量废水仍然会对环境造成污染。因此
传统化学催化工艺带来的负面影响，迫切需要找到
新的方法避免化学催化对环境造成的破坏。酶促合
成法合成生物柴油具有条件温和、反应专一、成本低、
易于操作、无污染物排放等优点，将成为生物柴油
未来发展的方向［17］。但生物柴油生产中所需脂肪
酶价格昂贵，且产量低、耐毒性差，而使其工业化
应用受到较大的影响。而随着生物技术的发展，利
用基因工程技术进行工业酶制剂的研发及改造已成
2013年第6期 127苗长林等 ：米黑根毛霉脂肪酶基因的克隆、表达及活性分析
为可能［18，19］。如王刚［20］将来源于荧光假单胞菌的
新型脂肪酶基因 lipB52 在大肠杆菌 BL21（DE3）中
获得成功表达，采用脂肪酶 LipB52 催化大豆油与甲
醇的转酯反应生产生物柴油发现，脂肪酶 LipB52 表
现出较高的催化活性，反应 40 h 后甲酯的产率高达
92.5%。本研究对后续酶法催化油脂制备生物柴油奠
定了基础。同时，该酶的酶学性质在耐酸碱和耐温
方面依然需要改善，利用密码子优化对脂肪酶进行
改造，提高酶的性质将是下一步主要研究工作。
4 结论
将米黑根毛霉脂肪酶基因插入到巴斯德毕赤酵
母染色体上，并成功得到了表达。大小与天然蛋白
质一致。120 h 摇瓶培养后，发酵液上清中脂肪酶
活性达到 84 U/mL，较野生菌提高了 8 倍。对重组
脂肪酶酶学性质研究表明，其最适反应温度和 pH
分别为 40℃和 8，Ca2+、Mg2+ 有助于酶活力的提高，
而 Cu2+、Fe2+ 和 Zn2+ 强烈抑制酶催化反应。
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）