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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(7):220-225
幽 门 螺 杆 菌（Helicobacter pylori，H. pylori） 被
公认是消化性溃疡、慢性活动性胃炎、胃黏膜相关
淋巴组织（MALT）淋巴瘤的主要致病因素，与胃癌
的发生存在密切关联性［1-3］，已被世界卫生组织定
为Ⅰ类致癌因子［4］。H. pylori 感染呈现全球分布特点，
据有关报道显示，世界人口平均感染率已超过 50%，
发展中国家的 H. pylori 感染率更高，我国的感染率
达到 61%［5］。目前对于抗 H. pylori 感染方法主要采
用的是药物治疗法，但都存在一定的局限性［6］，因
此开发抗 H. pylori 感染疫苗产品成为研究热点。
尿素酶 B 亚单位（UreB）作为疫苗的有效抗原
蛋白，具有无毒、免疫效果好等特点，已被相关实
验所证实［7-9］。目前关于 ureB 克隆表达及纯化的方
法已有报道，主要采用细菌培养的方法获取大量 H.
收稿日期 ： 2014-10-15
基金项目 ：国家科技重大专项子课题项目（2014ZX09102042-002），安徽省科技攻关计划项目（1301041020）
作者简介 ：闫锦锦，男，硕士，研究方向 ：生物化学与分子生物 ；E-mail ：yanjinjin222702@163.com
通讯作者 ：刘丹，女，博士，研究方向 ：医学免疫学 ；E-mail ：luckyliu2001@sina.com
幽门螺杆菌尿素酶 B 亚单位的克隆表达及纯化
闫锦锦  闫东明  邹雪  刘丹  彭超  苏亚南
（芜湖康卫生物科技有限公司，芜湖 241000）
摘 要 ： 为获得高纯度具有生物活性的尿素酶 B 亚单位（UreB）蛋白，利用 PCR 方法扩增出 ureB 目的基因，将其插入到
pET28a 载体中，构建表达质粒 pET28a-ureB。将鉴定正确的质粒转入大肠杆菌中培养，通过 IPTG 诱导表达获得 UreB 蛋白。采用
Q Sepharose High Performance 阴离子交换层析纯化，G-25 凝胶过滤层析脱盐，并通过 SDS-PAGE 和免疫双扩散法对 UreB 蛋白进行
鉴定。结果表明，该蛋白相对分子质量约为 64 kD，与预期结果相符，脱盐后获得的 UreB 蛋白纯度为 98.5% ；免疫双扩散法证明
该蛋白具有良好的生物活性和反应特异性。最终确定的纯化工艺，达到了一步纯化即得到高纯度、具有生物活性蛋白的目的，该
纯化工艺简单、有效。
关键词 ： 幽门螺杆菌 ；尿素酶 B 亚单位 ；UreB 蛋白 ；蛋白纯化
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.07.034
Cloning，Expression and Purification of Urease B Subunit of
Helicobacter pylori
Yan Jinjin Yan Dongming Zou Xue Liu Dan Peng Chao Su Yanan
（Wuhu Kangwei Biotechnology Co.，Ltd.，Wuhu 241000）
Abstract: In order to obtain high-purity and bioactive urease B subunit protein（UreB）, the fragments of ureB amplified by PCR
was inserted into expression vector pET28a, and the recombinant plasmid pET28a-ureB was constructed successfully. The identified plasmid
was transformed into Escherichia coli, which was induced to express by IPTG. The expressed protein UreB was purified by Q Sepharose High
Performance anion exchange chromatography and desalted by G-25 gel filtration chromatography, then analyzed by SDS-PAGE and double
immunodiffusion. The results indicated that the molecular weight of the protein was about 64 kD and its purity was 98. 5% after desalting, which
was in accord with the prediction. Double immunodiffusion showed that protein UreB possessed a favorable bioactivity and specificity. The
finalized purification process achieved the goal of 1-step purification may obtain high-purity and bioactive protein, and it was simpler than the
existing purification process as well as effective.
Key words: Helicobacter pylori ；urease B subunit ；UreB protein ；protein purification
2015,31(7) 221闫锦锦等 ：幽门螺杆菌尿素酶 B 亚单位的克隆表达及纯化
pylori，利用基因工程技术克隆 ureB 基因，构建表达
质粒，并使用亲和层析及多级纯化相结合的方法获
得较高纯度的 UreB 蛋白［10-12］，但利用离子交换层
析技术进行一步纯化，来获得高纯度 UreB 蛋白的相
关信息未见报道。
本研究以 pET11c-LTB-ureB 质粒为模板，设计
引物，克隆 ureB 基因，构建重组质粒 pET28a-ureB，
并使用离子交换层析一步纯化法，获得高纯度且具
有生物活性的目的蛋白，可作为疫苗参考品，为疫
苗后续研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌 株 及 质 粒 E . coli DH5α 及 E. coli BL21
（DE3）由本实验室保种，pET11c-LTB-ureB 表达质
粒由本实验室构建保存，载体 pMD18-T、pET-28a
购自 TaKaRa 公司（大连）。
1.1.2 主要试剂 质粒提取试剂盒、DNA 凝胶回收
试 剂 盒 购 自 AXYGEN 公 司 ；Taq DNA 聚 合 酶、T4
DNA 连接酶、DL5000 DNA Marker、限制性内切酶
BamH Ⅰ、Nde Ⅰ、Xba Ⅰ、Xho Ⅰ 均 购 自 TaKaRa
公 司（ 大 连 ）；离 子 交 换 层 析 柱 介 质 Q Sepharose
High Performance、凝胶过滤层析柱介质Sephadex G-25
Medium 购自美国 GE 公司。
1.2 方法
1.2.1 pET11c-LTB-ureB 重组质粒的克隆及序列测
定 取 5 μL pET11c-LTB-ureB 质粒转化 DH5α 感受
态，涂 Amp 抗性的 LB 平板，挑取单克隆于 LB 液
体培养基中大量扩增，用质粒提取试剂盒提取质粒。
经 BamH Ⅰ、Nde Ⅰ双酶切，电泳鉴定正确后，送
上海生工测序。
1.2.2 ureB 基因表达载体的构建 根据测序结果，
应用 Primer 5.0 设计扩增 ureB 基因引物。上游引物 ：
GTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAG-
ATATAATGAAAAAGATTAGCAGAAAAGAATATG
（下划线为 Xba Ⅰ酶切位点），下游引物 ：CTCGAGT-
TACTAGAAAAT GCTAAAGAGTTGTGCCAAGCTCA
（下划线为 Xho Ⅰ酶切位点）。以 pET11c-LTB-ureB
质粒为模板，采用上述引物，进行 PCR 扩增。扩
增条件为 ：95℃ 2 min ；95℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃
2 min ；35 个循环。1% 琼脂糖凝胶电泳鉴定后，用
DNA 凝胶回收试剂盒回收 1 700 bp 目的片段，并将
ureB 基因连接到 pMD18-T 载体上，转化 DH5α 感受
态，提取阳性克隆质粒，用 Xba Ⅰ和 Xho Ⅰ双酶切
鉴定质粒，并将鉴定正确的质粒送至上海生工测序。
利 用 Xba Ⅰ 和 Xho Ⅰ 双 酶 切 测 序 正 确 的
pMD18T-ureB 和 pET-28a 载体质粒，并回收 1 700 bp
和 5 000 bp 的目的条带。将回收的目的片段和载体
片段，用 T4 DNA 连接酶连接，连接产物转化 BL21
（DE3）感受态细胞 ；均匀涂布于含有 Kan 抗性的
LB 平板，37℃恒温培养箱过夜培养，挑取单克隆
于 LB 液体培养基中大量扩增，提取重组质粒 ；经
Xba Ⅰ和 Xho Ⅰ双酶切鉴定正确后送上海生工测序。
1.2.3 UreB 蛋白的诱导表达 将测序结果正确的重
组工程菌接种于 5 mL 含 Kan 的 LB 液体培养基中，
37℃摇床培养过夜。将过夜培养的重组工程菌按 1%
的比例转接入 50 mL 含 Kan 的 LB 培养液中，37℃
摇床培养（200 r/min）。待 OD600 ≈ 1.0 时，加入终
浓度为 1 mmol/L 的 IPTG 开始诱导，分别于诱导 0、
1、2、3、4、5 h 取样，并采用 SDS-PAGE 检测目的
蛋白诱导表达情况。
1.2.4 发酵菌体的处理 将高效表达的菌体以 1∶10
（M/V） 比 例 与 缓 冲 液（10 mmol/L Tris-HCl pH8.5）
混合、溶解，搅拌均匀后，向菌体悬液液中加入冰
袋将菌液冷却至 10℃左右，利用高压均质机高压（800
bar）破碎 2 次，破碎后的菌液通过管式离心机离心
收集粗包涵体沉淀（离心转速 ：20 000 r/min ；离心
流速 ：1 L/min），-20℃保存。
1.2.5 UreB 包涵体的洗涤及裂解 称取 UreB 包涵
体 20 g，按照 1∶10（m/v）的比例，用洗涤液Ⅰ（50
mmol/L Tris-HCl 1%Triton-X 100 pH8.5）溶解包涵体，
高速分散器混匀后，搅拌 1 h，8 000 g 离心 30 min，
弃上清，预留上清（收集液）检测，重复洗涤一次；
沉淀再用洗涤液Ⅱ（50 mmol/L Tris-HCl 1 mol/L 尿素
pH8.5）溶解，高速分散器混匀后，搅拌 1 h，8 000
g 离心 30 min，弃上清，预留上清检测，重复洗涤一次；
最 后 沉 淀 用 pH8.5 的 50 mmol/L Tris-HCl 8 mol/L 尿
素溶解，高速分散器混匀后，裂解过夜。
1.2.6 UreB 蛋 白 的 Q Sepharose High Performance 纯
化 柱 床 体 积 为 150 mL， 用 5 倍 柱 体 积 pH8.5 50
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.7222
mmol/L Tris-HCl、8 mol/L 尿素平衡层析柱 ；用 3 倍
柱体积含不同盐浓度的 50 mmol/L Tris-HCl 8 mol/L
尿素 pH8.5 的洗脱缓冲液进行梯度洗脱，盐浓度
梯度分别为 40 mmol/L、60 mmol/L、80 mmol/L、90
mmol/L、0.2 mol/L、2 mol/L NaCl， 流 速 为 15 mL/
min，采取分段收集样品的方法，对样品进行 SDS-
PAGE 检测，利用凝胶成像系统进行纯度分析，系
统的分析软件为 Imaglab（Version 4.1）。
1.2.7 超滤浓缩、脱盐 Q 柱样品用截留量为 50 kD
的膜包进行超滤浓缩后，用 G-25 凝胶过滤层析柱脱
盐处理（pH10.0 25 mmol/L 碳酸氢钠缓冲液），收集
样品进行 SDS-PAGE 检测，利用凝胶成像系统进行
纯度分析，系统的分析软件为 Imaglab（Version 4.1）。
1.2.8 免疫双扩散检测蛋白特性 选用重约 2 kg、
健康状况良好的新西兰大耳兔 2 只，每只兔子采用
背部多点皮内注射 1 mg 抗原。免疫时间分别为 0、
10、17 d，3 次免疫后取兔耳缘静脉血，免疫双扩散
检测 UreB 抗原的特异性。
用 0.9% 的生理盐水配制 1.5% 的琼脂糖凝胶，
水浴加热至充分溶化后，倒于载玻片上，制成厚度
约为 2-3 mm 厚的琼脂糖凝胶板 ；置于室温冷却凝
固后，用打孔器准确打孔，加热封底。冷却后，中
央孔内滴加一定的兔抗血清，加入量以不溢出为度，
周边孔分别滴加 UreB 纯化蛋白（1、5、10、20 μg）、
空白对照（pH10.025 mmol/L 碳酸氢钠缓冲液）、阴
性对照（pET-28a 空载质粒转化后诱导表达蛋白，
采用 Lowery 法测蛋白质含量，取 10 μg 加样）。加
完样品后，将琼脂平皿加盖后放置于加盖的湿盒内，
37℃温箱中孵育 30 h，观察并记录结果。
2 结果
2.1 ureB基因的核酸电泳鉴定
ureB 基因的 PCR 扩增产物和重组质粒 pET28a-
ureB 双酶切产物，用 1.0% 的琼脂糖凝胶电泳检测，
结果分别见图 1、图 2。图 1 中为扩增的目的基因
电泳结果，经序列测定 ：ureB 基因大小为 1 710 bp，
与 ureB 基因的预期大小一致 ；从图 2 中可以观察到
pET28a-ureB 质粒采用 Xba Ⅰ和 Xho Ⅰ双酶切后，可
见约 5 000 bp 和 1 700 bp 左右的条带，与预期结果
一致。
2.2 UreB蛋白的诱导表达
将重组质粒转入大肠杆菌中扩增培养后进行诱
导表达 5 h，采用 SDS-PAGE 检测（0、1、2、3、4、
5 h）UreB 目的蛋白的表达情况。结果（图 3）显示，
UreB 的相对分子质量约为 64 kD，表达量随诱导时
间的延长而增加，诱导 5 h 时表达量最高，目的蛋
2000
bp
1 2
1500
1 ：DNA Marker DL5000 ；2 ：ureB 基因的 PCR 扩增产物
图 1 ureB 基因的 PCR 扩增
5000
bp
1 2
2000
1 ：pET28a-ureB 重组质粒经 Xba Ⅰ、Xho Ⅰ双酶切 ；2 ：DNA Marker DL5000
图 2 pET28a-ureB 重组质粒双酶切鉴定
70
kD
1 2 3 4 5 6 7
55
1-3 ：IPTG 诱导时间 0、1、2 h ；4 ：蛋白分子量标准 ；5-7 ：IPTG 诱导时间
3、4、5 h
图 3 不同诱导时间下 UreB 的表达量分析
2015,31(7) 223闫锦锦等 ：幽门螺杆菌尿素酶 B 亚单位的克隆表达及纯化
白约占总蛋白的 27.4%。
2.3 UreB包涵体洗涤
利用洗涤液Ⅰ和洗涤液Ⅱ对包涵体各洗涤两次，
SDS-PAGE 检测结果（图 4）显示，包涵体洗涤效果
良好，4 次洗涤收集液中 UreB 目的蛋白的纯度依次
为 9.7%、25%、37.5%、49.5%，而在裂解液中 UreB
纯度达到了 67.3%。
2.4.2 G-25 凝胶过滤脱盐 Q 柱样品用截留量为 50
kD 的膜包进行超滤浓缩，浓缩后的样品用 G-25 脱
盐柱进行脱盐处理。脱盐后目的蛋白以可溶性的形
式存在，经 SDS-PAGE 检测（图 6），样品中的目的
蛋白纯度高达 98.5%。
70
kD
1 2 3 4 5 6 7 8
55
1-3 ：依次 6 μL、8 μL、10 μL 裂解液 ；4 ：蛋白质分子量标准 ；5-8 ：依次
10 μL 4 次洗涤收集液
图 4 UreB 包涵体的洗涤与裂解效果的电泳分析
2.4 UreB蛋白的纯化
2.4.1 阴 离 子 交 换 层 析 采 用 Q Sepharose High
Performance 阴 离 子 交 换 层 析 对 UreB 蛋 白 进 行 纯
化，经 SDS-PAGE 检测（图 5），用 80 mmol/L 和 90
mmol/L NaCl 进行洗脱可获得较高纯度的目的蛋白，
纯度可达到 96.7%、96.9%。
70
kD
1 2 3 4 5 6
55
1-3 ：依次为 80-1、80-2、80-3，即为 80 mmol/L NaCl 洗脱分段接收的样品 ；
4 ：蛋白质分子量标准 ；5-6 ：依次为 90-1、90-2，即为 90 mmol/L NaCl 洗脱
分段接收样品
图 5 80 mmol/L 和 90 mmol/L NaCl 洗脱目的蛋白的电泳
分析
70
kD
1 2 3 4
55
1-3 ：收集的样品 ；4 ：蛋白质分子量标准
图 6 UreB 蛋白脱盐后电泳分析
2.4.3 目的蛋白免疫双扩散鉴定结果 兔抗 UreB 血
清免疫双扩散结果（图 7）显示，UreB 抗原具有良
好的反应特异性，在兔抗血清与 UreB 纯化蛋白之间
出现明显的免疫沉淀线，而兔抗血清与阴性对照之
间未出现沉淀线。
1
2
3
4
5
6
7
1 ：空白对照 ；2 ：阴性对照（10 μg）；3 ：兔抗 UreB 血清 ；4-7 ：分别为 1、5、
10、20 μg UreB 纯化蛋白
图 7 免疫双扩散鉴定
3 讨论
研究表明，UreB 作为疫苗的抗原，具有较好的
免疫保护作用，如何获得高质量 UreB 蛋白，是能否
作为疫苗参考品的关键。这就要求不仅要获得高纯
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.7224
度的 UreB 蛋白，还需要保证其具有良好的生物活性、
反应特异性，为此我们构建重组表达质粒，进行诱
导表达及纯化工艺的摸索。
本研究选用 pET28a 作为表达载体，并以实验
室保存的 pET11c-LTB-ureB 表达质粒为模板，设计
带有 Xba Ⅰ和 Xho Ⅰ酶切位点上下游引物，克隆出
疫苗的抗原基因，成功构建了重组表达质粒 pET28a-
ureB。将重组质粒转入大肠杆菌中进行表达，可获得
以包涵体形式表达的 UreB 蛋白，该形式被认为可防
止蛋白质降解，且利于纯化［13，14］。
我们优化了包涵体洗涤工艺，进行 4 次洗涤即
可达到较好的洗涤效果，其中采用洗涤液Ⅰ进行的
前两次洗涤，电泳检测 UreB 蛋白纯度只有 9.7% 和
25%，这表明前两次洗涤杂蛋白去除效果较好，而
洗涤液Ⅱ中因含有尿素，导致目的蛋白有一定量的
损失，但经过工艺验证，当洗涤液Ⅱ中尿素浓度 1
mol/L 时，可使目的蛋白损失最小，而杂蛋白去除
效率最大化，洗涤液在电泳检测结果表明杂质去除
效果非常明显，杂质去除率可达 30% 以上。经过
多次试验验证，包涵体的最佳裂解液为 pH8.5 的 50
mmol/L Tris-HCl 8mol/L 尿素溶液。在蛋白纯化过程
中，样品能否保证其生物学活性，被看作工艺是否
成功的前提条件［15］，而经过多次纯化必然会对蛋白
的活性有所影响。因此，在 UreB 纯化过程中，利用
Q Sepharose High Performance 阴离子交换层析进行了
多次实验摸索，确定了最佳的平衡缓冲液为 pH8.5
的 50 mmol/L Tris-HCl 8 mol/L 尿素溶液。同时在目
的蛋白洗脱的过程中，摸索出盐离子最佳洗脱梯度，
并采取分段收集样品的方法检测样品，最终确定了
一步纯化即可获得高纯度且具有生物活性的目的蛋
白的方法。而根据已有的相关报道，在利用阴离子
交换层析法进行 UreB 纯化时，在裂解及平衡缓冲
液组成上有所不同，所用缓冲液 pH 值多为 8.0，大
多采用了梯度洗脱，但都未采取分段收集样品方法，
这就导致收获液的纯度达不到要求，增加了纯化
难度。
实验表明离子交换层析是一种高效分离蛋白的
方法，可以根据蛋白表面静电荷不同，建立适合的
盐离子洗脱梯度，从而获得我们所需要具有生物活
性的目的蛋白。目前有相关报道的 UreB 纯化方法，
一是采用亲和层析进行纯化 ；二是采用多级纯化法，
如亲和层析与离子交换层析相结合或离子交换层析
与疏水层析相结合，这两种方式都可以获得较满意
蛋白纯度，可见的报道中最高的蛋白纯度为 98.3%。
相比以上两种传统的 UreB 纯化方式，我们通过摸索
纯化工艺，优化纯化条件，最终确定了一步纯化的
工艺，将 UreB 蛋白经 Q Sepharose High Performance
阴离子交换层析纯化及 G-25 凝胶过滤脱盐后，能够
快速获得纯度高且具有生物活性、反应特异性的目
的蛋白，蛋白纯度可高达 98.5%，在节省了时间的
同时，保证了蛋白的活性，同时节省了生产成本。
4 结论
本研究确定的纯化工艺，达到了一步纯化即得
到高纯度、具有生物活性蛋白的目的，该纯化工艺
简单、有效。制备的 UreB 蛋白，可作为口服重组幽
门螺杆菌疫苗的参考品，用于疫苗的相关检测试验。
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（责任编辑 李楠）