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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第2期
赖氨酸是世界上仅次于谷氨酸的第二大氨基酸
品种，目前主要应用于饲料添加剂［1-3］、食品添加
剂和医药中间体［4-8］。随着科技的发展，赖氨酸品
种已经发展出赖氨酸盐酸盐、蛋白赖氨酸和液体赖
氨酸等［9，10］。截止到 2010 年底，世界市场每年的
赖氨酸需求量达 140 万吨，按照工业赖氨酸计算，
其直接市值达 200 亿元，间接市场难以估量［11］。
目前常用的赖氨酸检测方法主要有酶法、高效
液相色谱（HPLC）和化学法（茚三酮）法。酶法
主要是通过赖氨酸在特异的氧化酶催化下发生氧化
还原反应，其电子产物在生物传感器电极表面形成
电流从而进行测定，检测准确度和应用性受酶活力
收稿日期 ：2012-07-05
基金项目 ：国家重点基础研究发展计划“973 ”计划（2009CB724703）
作者简介 ：姜安娜，女，硕士研究生，研究方向 ：生物化学与分子生物学 ；E-mail ：annajiang_anj@163.com
通讯作者 ：孙际宾，男，研究员，博士生导师，研究方向 ：微生物代谢工程 ；E-mail ：sun_jb@tib.cas.cn
一种改进的赖氨酸浓度测定方法
姜安娜1，2 曹名锋2，3 李庆刚2，3 郑平2，3 杨洪江1 孙际宾2，3
（1. 天津科技大学生物工程学院，天津 300457 ；2. 中国科学院天津工业生物技术研究所，天津 300308 ；
3. 中国科学院系统微生物工程重点实验室，天津 300308）
摘 要 ： 茚三酮显色法是一种常用的氨基酸测定方法，可以对游离氨基酸进行定性、定量分析，但检测赖氨酸的选择性和
准确度却较差。本研究通过对传统茚三酮方法的改进实现赖氨酸的特异性检测。研究发现，在 pH2.2 的磷酸氢二钠 - 柠檬酸缓冲
液中只有赖氨酸可与茚三酮 - 铁试剂在 480 nm 处发生特征显色反应，其最佳测定条件为 100℃反应 35 min ；并发现改进的方法赖
氨酸的有效浓度为 0-200 mmol/L。此方法可以排除脯氨酸、鸟氨酸、甘氨酸、精氨酸和组氨酸等杂质氨基酸的干扰，而且适用于
对发酵液中赖氨酸浓度进行直接测定，结果准确可靠。
关键词 ： 赖氨酸 茚三酮 - 铁试剂 显色反应 特异性检测
A Modified Method for Quantification of L-lysine
Jiang Anna1，2 Cao Mingfeng2，3 Li Qinggang2，3 Zheng Ping2，3 Yang Hongjiang1 Sun Jibin2，3
（1. School of Biological Engineering，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457 ；2. Tianjin Institute of Industrial
Biotechnology，Chinese Academy of Sciences，Tianjin 300308 ；3. Key Laboratory of Systems Microbial Biotechnology，
Chinese Academy of Sciences，Tianjin 300308）
Abstract: A modified method was established to determine lysine concentration using ninhydrin-ferric reagents. Unlike the traditional
method which measures the total amino acids, our modification showed high specificity and favorable linearity to lysine（0-200 mmol/L）. In
our protocol the characteristic absorption at 480 nm was measured after the reaction mixture was boiled for 35 minutes in disodium hydrogen
phosphate-citrate buffer at pH2.2. The method not only successfully excludes the interference of impurities including proline, ornithine, glycine,
arginine and histidine, but offers the accurate and reliable determination of the lysine in the fermentation broth directly.
Key words: Lysine Ninhydrin-ferric reagents Color reaction Specific detection
和酶价格的限制 ；HPLC 方法采用 2，4-二硝基氟
苯（DNFB）、1-氟-2，4-二硝基苯基 -5-L-丙氨酰胺
（FDAA）等衍生化试剂，虽然能够精确区分和测定
D-/L-型赖基酸的含量，但对仪器精密度和操作人员
要求极高，并且易受样品中杂质成分的干扰，不适
合工业发酵液中赖氨酸的检测 ；化学法主要指茚三
酮方法，基本原理为 ：氨基酸与水合茚三酮共同加
热后可发生氧化脱氨反应，生成 NH3 与酮酸 ；加热
过程中酮酸裂解，放出 CO2，自身变为少一个碳的
醛，水合茚三酮变为还原型茚三酮。NH3 与水合茚
三酮及还原茚三酮脱水缩合，生成蓝紫色化合物［12］。
传统的茚三酮检测方法无法排除杂质氨基酸的干扰，
2013年第2期 191姜安娜等 ：一种改进的赖氨酸浓度测定方法
且反应过程中易受 pH 和温度变化的影响，造成测
定结果准确性降低［13，14］。本研究在传统的茚三酮
试剂中添加了铁离子（Fe3+），通过铁离子对脯氨酸、
鸟氨酸、甘氨酸、精氨酸、组氨酸与茚三酮反应的
抑制作用，从而提高茚三酮溶液与赖氨酸反应的特
异性［15］。此外，由于赖氨酸发酵过程中产生其他副
产物会影响发酵液的 pH 值，对反应的成色速度和
产物的颜色造成影响，进而削弱了分子内基团反应
的灵敏性，所以试验中拟设计不同的缓冲液反应体
系，旨在提高茚三酮法检测赖氨酸的特异性，并实
现了对赖氨酸发酵液稳定和准确的检测。本方法不
需要昂贵的设备，方法简单，试剂便宜，数据精确，
适合实验室检测和工业应用。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 化学试剂 21 种氨基酸，即甘氨酸（Gly）、
丙氨酸（Ala）、缬氨酸（Val）、亮氨酸（Leu）、异
亮氨酸（Ile）、苯丙氨酸（Phe）、脯氨酸（Pro）、色
氨酸（Trp）、丝氨酸（Ser）、酪氨酸（Tyr）、半胱氨
酸（Cys）、蛋氨酸（Met）、天冬酰胺（Asn）、谷氨
酰胺（Gln）、苏氨酸（Thr）、天冬氨酸（Asp）、谷
氨酸（Glu）、赖氨酸（Lys）、精氨酸（Arg）、组氨
酸（His）和鸟氨酸（Ornithine）购自上海生工生物
工程有限公司 ；分析纯的茚三酮、氯化铁、甲基溶
纤剂、二甲基亚砜和正己烷购自国药集团化学试剂
有限公司 ；色谱纯乙酸钠、异硫氰酸苯酯和三乙胺
购自 Sigma 公司 ；乙腈由 Merck 公司提供。
1.1.2 仪器和设备 酶标仪为美国 Molecular Devices
公司产品，恒温加热器购自上海一恒科技有限公司，
电子天平（0.000 1 g）购自上海梅特勒 - 托利多仪
器有限公司，高效液相色谱仪购自日本岛津公司。
1.2 方法
1.2.1 茚三酮 - 铁溶液与氨基酸溶液反应［16］ 首先
配制 200 mmol/L 的氨基酸溶液（天冬氨酸、谷氨酸、
苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、
色氨酸、酪氨酸溶于 0.1 mol/L 的盐酸，然后用相同
体积的 0.1 mol/L 的氢氧化钠中和，添加去离子水至
终浓度 200 mmol/L ；谷氨酰胺由于在酸碱条件下均
不稳定，故配成饱和溶液，现配现用 ；其他氨基酸
溶于去离子水）。取 20 μL 氨基酸溶液加入到 0.66
mL 溶液 I［373 mL 甲基溶纤剂与 30 mL 50%（W/W）
的氯化铁溶液混合加入 600 mL 缓冲液］和 0.37 mL
溶液 II（1 g 茚三酮溶于 100 mL 缓冲液）中混合均
匀，100℃恒温加热 40 min，快速用自来水冷却至
室温，加入 4 mL 二甲基亚砜和 6 mL 去离子水，取
200 μL 样品在 480 nm 波长下（常温）测定吸光值。
对显色反应的最佳反应时间、最佳检测波长进
行了摸索，以确定最佳反应条件。另外，还用不同
pH 值的酸性氯化钾溶液取代缓冲液来确定溶液显色
反应的最佳 pH 值以及更换不同的缓冲液确定最佳
缓冲体系。
1.2.2 高效液相色谱法（HPLC）检测赖氨酸生产菌
发酵液中赖氨酸的浓度［17］ 异硫氰酸苯酯柱前衍
生 - 反相高效液相色谱法测定赖氨酸 ：将赖氨酸生
产菌的发酵液分别稀释 20、30 和 40 倍，取出 0.4
mL 置于离心管中，加入 1 mol/L 三乙胺 - 乙腈溶液 0.2
mL，异硫氰酸苯酯乙腈溶液 0.2 mL，漩涡混合器振
荡 1 min，37℃水浴 1 h，加入正己烷 0.7 mL 漩涡混
合器振荡 1 min，静置 60 min。用注射器吸取下层溶
液，经 0.45 μm 滤膜过滤后置于色谱自动进样系统，
进行洗脱和谱图分析。
2 结果
2.1 茚三酮法最适检测条件的摸索
2.1.1 最佳检测波长和最佳 pH 的确定 200 mmol/L
赖氨酸与 pH 为 0.8、1.6、2.4、3.2 和 4.0 的茚三酮 -
铁混合液反应，等体积去离子水取代 200 mmol/L 赖
氨酸加入反应体系作为对照，通过酶标仪快速读取
吸光值，检测结果见图 1。对不同 pH 值的反应混合
液进行了波谱扫描发现，最佳扫描波长为 480 nm。
当 pH>2.4 时，反应溶液中出现了沉淀，所以试验选
择在 pH<2.4（即 pH 为 2.2）的环境中进行。
2.1.2 最佳缓冲液的选择 将不同浓度的赖氨酸溶液
（0、50、100、150、200、300、400 和 500 mmol/L）
与茚三酮 - 铁试剂在 pH2.2 的不同类型的缓冲液
体系下进行反应，检测 480 nm 处的吸光值。结果
（图 2）显示，以甘氨酸 - 盐酸和邻苯二甲酸 - 盐酸
作为反应的缓冲液体系时，产物在 480 nm 处的吸光
值始终处于很小数值范围内，波形比较缓和。而在
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第2期192
柠檬酸 - 氢氧化钠 - 盐酸和磷酸氢二钠 - 柠檬酸缓
冲液体系中进行反应时，480 nm 处的吸光值较强，
呈线性分布，说明柠檬酸 - 氢氧化钠 - 盐酸和磷酸
氢二钠 - 柠檬酸缓冲液是比较理想的缓冲试剂。本
试验选择 pH2.2 的磷酸氢二钠 - 柠檬酸缓冲液进行
后续的试验。
pH2.2 的磷酸氢二钠 - 柠檬酸缓冲液条件下，采用
常见的 21 种氨基酸（200 mmol/L）与茚三酮 - 铁试
剂反应，进行 350 nm-650 nm 的波谱扫描（图 4），
并检测 480 nm 处的特异性反应（表 1），以反应体
系中去离子水取代氨基酸为对照。从图 4 的波谱扫
描结果可以看出，虽然茚三酮与色氨酸反应在 390
nm 处出现最大吸收的波峰，但 480 nm 处吸光值仅
为 0.02，相反在 480 nm 处只有赖氨酸反应产物出现
强吸收峰，其吸收值为 0.37，远高于其他氨基酸。
因此，在 pH2.2 的磷酸氢二钠 - 柠檬酸缓冲液条件下，
茚三酮 - 铁试剂对赖氨酸的反应特异性非常强，可
以完全排除其他氨基酸的干扰。
2.2.2 改进的茚三酮法对赖氨酸浓度检测范围的确
定 配制浓度为 0、50、100、150、200、300、400
和 500 mmol/L 的赖氨酸溶液与茚三酮 - 铁试剂反应，
100℃加热 1 h，测定产物在 480 nm 处的吸光值。从
图 5 可以看出，数值分布趋势较明显，在赖氨酸浓
度 0-200 mmol/L 范围内其吸光值与赖氨酸浓度呈非
0.9
1
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
400 450 500 600 700 750650550⌒䮯 nm
੨ݹ
ᓖA
bs
pH 4.0
pH 3.2
pH 2.4
pH 1.6
pH 0.8ሩ➗
图 1 不同 pH 茚三酮 - 铁试剂与 200 mmol/L 赖氨酸反应的吸光值
0
0 100 200 300 400 500
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1
੨ݹ
ᓖ
䎆≘䞨⎃ᓖ mmol/L
⼧䞨≒Ҽ䫐Ḑ⃜䞨㕃ߢ⏢Ḑ⃜䞨≒≗ॆ䫐ⴀ䞨㕃ߢ⏢䛫㤟ⴀ䞨㕃ߢ⏢⭈≘䞨ⴀ䞨㕃ߢ⏢
图 2 不同浓度的赖氨酸溶液与茚三酮 - 铁试剂在不
同缓冲液体系下反应结果
2.1.3 最佳反应时间的确定 选择线性关系中赖氨
酸浓度最高的 200 mmol/L 溶液，与茚三酮 - 铁混合
溶液在 100℃条件下加热，每隔 5 min 检测反应溶液
在 480 nm 处的吸光值。结果（图 3）表明，反应结
束达到稳定期需要的时间基本与赖氨酸浓度成正比。
当 200 mmol/L 赖氨酸与茚三酮溶液反应，在沸水浴
中加热至 35 min 时抛物线坡度开始变缓，接近最高
点，吸光值的线性关系较好，可以将 100℃加热 35
min 作为 200 mmol/L 赖氨酸完全反应的条件 ；当待
测试样中赖氨酸浓度低于 200 mmol/L 时，反应时间
可以适当缩短。
2.2 茚三酮法对赖氨酸检测的特异性与灵敏度
2.2.1 改进的茚三酮法对赖氨酸的特异性检测 在
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0 10 20 30 40 50
0.05
0.15
0.25
0.35
৽ᓄᰦ䰤 min
੨ݹ
ᓖA
bs
200 mmol/L
150 mmol/L
100 mmol/L
50 mmol/L
图 3 不同浓度的赖氨酸与茚三酮 - 铁试剂在
100℃反应的变化
2013年第2期 193姜安娜等 ：一种改进的赖氨酸浓度测定方法
常好的线性关系（R2=0.9924），因此茚三酮方法测
定的赖氨酸适用浓度范围为 0-200 mmol/L。
2.2.3 改进的茚三酮法与 HPLC 检测法的比较 以
本研究室构建的一株高产赖氨酸的基因工程大肠杆
菌经过摇瓶发酵 36 h 后，12 000 r/min 离心 10 min
去除菌体，发酵液上清分别采用茚三酮 - 铁试剂
法和反相高效液相色谱 HPLC 法检测产物赖氨酸的
含量。表 2 中数据显示，茚三酮 - 铁试剂检测发酵
液中赖氨酸含量与 HPLC 检测结果几乎一致，但是
HPLC 会出现一定的图谱重叠（谱图未给出），分析
原因可能为发酵液中杂质氨基酸的干扰。茚三酮 -
铁法检测赖氨酸的方法可以克服这个缺点，并且在
茚三酮方法简便易行，对设备和试验人员要求低，
满足了工业发酵的需要。
3 讨论
在改进的茚三酮法检测赖氨酸的试验过程中，
甲基溶纤剂（GDME）和二甲基亚砜（DMSO）作为
有效的分散剂和促溶剂，通过加快分子间化学键的
形成可以大大促进 α-氨基酸和茚三酮的反应，帮助
反应溶液中的混合物均匀分布，特别是在高温反应
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
350 450 550 650600500400
⌒䮯 nm
੨ݹ
ᓖ
䎆≘䞨㢢≘䞨ަԆ
图 4 21 种氨基酸（200 mmol/L）与茚三酮 - 铁试剂反应
的波谱扫描
表 1 21 种氨基酸（200 mmol/L）与茚三酮 - 铁试剂
反应结果
氨基酸 OD480 氨基酸 OD480 氨基酸 OD480
His 0.01 Arg 0.00 Ser 0.00
Asn 0.03 Gln 0.00 Met 0.00
Lys 0.37 Glu 0.00 Ala 0.00
Pho 0.01 Trp 0.02 Phe 0.00
Ile 0.00 Cys 0.00 Val 0.00
Ori 0.00 Leu 0.00 Asp 0.00
Gly 0.00 Tyr 0.00 Thr 0.00
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0 50 100 200150䎆≘䞨ⓦ⏢⎃ᓖ mmol/L
੨ݹ
ᓖ
0.9
0.6
0.3
0
0 250 500 mmol/L y=0.0018xR2=0.9924
图 5 不同浓度的赖氨酸与茚三酮 - 铁试剂反应的标准曲线
表 2 茚三酮 - 铁和 HPLC 检测发酵液中赖氨酸含量比较
茚三酮 - 铁 HPLC
发酵样品 1 27.523±0.518 27.842±0.772
发酵样品 2 18.993±0.721 18.908±0.701
结束后加入 DMSO 使数据检测结果更加精确［16］。然
而我们在尝试低浓度赖氨酸（<10 g/L）的测定时发
现，若按照上述材料方法中的 4 mL DMSO 和 6 mL
去离子水加入，就会导致稀释倍数过大，检测吸光
度数值很小，导致误差增大，因此可以适当减小稀
释倍数，比如只加 1 mL DMSO，在 480 nm 下检测溶
液的吸光值，也会得到很好的标准曲线，数值分布
趋势较明显，在赖氨酸浓度 0-6 g/L 范围内反应结果
吸光值与赖氨酸浓度呈线性关系（R2=0.997），检测
灵敏度为≤ 1 g/L（数据未给出）。
Chinard［15］提出，在强酸性条件下，茚三酮可
以与脯氨酸和鸟氨酸反应，使溶液呈现红色 ；Hsieh
等提出，金属离子（铜、铁、锡等）能够抑制茚三
酮与脯氨酸、鸟氨酸、甘氨酸、精氨酸和组氨酸的
显色反应［16，18］，可以一定程度上排除杂质氨基酸的
干扰。刘飞飞等［19］在测定赖氨酸最佳反应条件时
发现加热时间过长导致反应结果吸光值下降。此外，
据报道 pH 的变化不仅影响到氨基酸和茚三酮反应
的成色速度和产物的颜色，而且可以影响催化反应
的机理，即分子内其他一些基团对茚三酮反应的灵
敏性，但目前仍没有通过调节 pH 来降低其他氨基
酸干扰的报道。因此，我们尝试在加入 pH2.2 的缓
冲液和铁离子后，发现当茚三酮与赖氨酸反应结束
后，吸光值在较长时间内保持稳定，并且反应体系
的检测结果也非常灵敏。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第2期194
随着工业生物技术的发展，菌种、药物等目的
试样的快速筛选变得极为重要，这就需要一套有效
的高通量筛选技术来实现小反应体积、高灵敏度和
短反应时间的测定。本研究中介绍的方法，当温度
设置为 100℃时，容易造成溶剂的挥发，使得反应
体系体积和样品浓度发生变化，影响了高通量的测
定。本研究所建立的设备完善的高通量筛选平台可
实现最高温度为 70℃的恒温储藏箱对样品进行加
热，因此我们尝试将茚三酮 - 铁与赖氨酸的反应温
度下调到 70℃，采用 200 mmol/L 的赖氨酸溶液与
茚三酮 - 铁试剂反应，每隔 40 min 检测反应溶液在
480 nm 处的吸光值，来观察测定结果的变化（数据
未给出）。结果显示，在 8 h 时抛物线坡度变缓，达
到最高点，即 200 mmol/L 的赖氨酸在 70℃需要 8 h
才能反应完全，虽然较好地降低了温度，准确度较高，
但是由于时间较长，大大限制了高通量检测赖氨酸
的可行性，所以此方法要想应用于高通量测定还需
要进一步的改进。
4 结论
本研究对用于赖氨酸检测的茚三酮方法进行了
改进，在 pH2.2 的磷酸氢二钠 - 柠檬酸缓冲液中只
有赖氨酸可与茚三酮 - 铁试剂发生 480 nm 处的特
征显色反应，其最佳测定条件为 100℃反应 35 min。
改进的方法不仅可以排除杂氨基酸和有机酸的干扰，
达到快速准确特异测定赖氨酸浓度的目的，而且在
工业发酵中可作为简单可行的方法实现对赖氨酸的
定性和定量分析。
参 考 文 献
［1］ Zelder O, Klopprogge C, Schöner H, et al. L-lysine fermentation［J］.
Microbial Technolol, 2005, 1（1）：211-240.
［2］ Rao D, Razak SA, Praveena B, Swamy A. Dissolved oxygen concen-
tration analysis of L-Lysine fermentation production by Corynebac-
terium glutamicum［J］. The Internet Journal of Pharmacology,
2008, 6（1）, DOI ：10.5580/19f0.
［3］ Anastassiadis S. L-Lysine fermentation［J］. Microbial Technolol,
2007, 1（1）：11-24.
［4］ Nelofer R, Syed Q, Nadeem M. Statistical optimization of process va-
riables for L-lysine production by Corynebacterium glutamicum［J］.
Türk Biyokimya Dergisi, 2008, 33（2）：50-57.
［5］ Debatosh D, Akshay B, Vidya C. Lysine ：Is it worth more?［J］.
Cytotechnology, 2001, 36 ：3-32.
［6］ Oh JW, Kim SJ, Cho YJ, et al. Strain of corynebacterium glutamicum
and method for producing L-lysine ：US, 5268293［P］. 1993-12-7.
［7］ Nakazawa M, Takahashi D, Onishi N, et al. L-Lysine fermentation ：
US, 20067012152［P］. 2006.
［8］ Nakazawa M, Takahashi D, Onishi N, et al. Method for producing
lysine derivative ：US, 20067012152［P］. 2006.
［9］ Emmert JL, Douglas MW, Boling SD, et al. Bioavailability of lysine
from a liquid lysine source in chick［J］. Poultry Science, 1999, 78
（3）: 383-386.
［10］ 周伟 . 浅谈赖氨酸行业现状和发展趋势［J］. 发酵科技通讯 ,
2007（6）：31-35.
［11］ 闫洪颖 , 柳晓峰 . 2010 年中国赖氨酸市场回顾及 2011 年展
望［J］. 中国畜牧杂志 , 2011, 47（4）：23-30.
［12］ 王镜岩 , 朱圣庚 , 徐长法 . 生物化学［M］. 北京 ：高等教育出
版社 , 2002 ：138-139.
［13］ Friedman M. Applications of the ninhydrin reaction for analysis of
amino acids, peptides, and proteins to agricultural and biomedical
sciences［J］. Agric Food Chem, 2004, 52 ：385-406.
［14］ Dietzen DJ, Weindel AL, Carayannopoulos MO, et al. Rapid
comprehensive amino acid analysis by liquid chromatography/
tandem mass spectrometry ：comparison to cation exchange with
post-column ninhydrin detection［J］. Rapid Commun Mass
Spectrom, 2008, 22（22）：3481-3488.
［15］ Chinard FP. Photometric estimation of proline and ornithine［J］.
J Biol Chem, 1952, 91（5）：91-95.
［16］ Hsieh CL, Hsiung KP, Su JC. Determination of lysine with
ninhydrin-ferric reagent［J］. Analytical Biochemistry, 1995, 224
（1）：187-189.
［17］ 杨菁 , 孙黎光 , 白秀珍 , 周海涛 . 异硫氰酸苯酯柱前衍生化反
相高效液相色谱法同时测定 18 种氨基酸［J］. 色谱 , 2002,
20（4）：369-371.
［18］ Beckwith AC, Paulis JW, Wall JS. Direct estimation of lysine in
corn meals by the ninhydrin color reaction［J］. Food Chem, 1975,
23（2）：194-196.
［19］ 刘飞飞 , 李群 , 于岚 . 茚三酮比色法定量检测赖氨酸条件的研
究［J］. 中国食品添加剂 , 2010, 5 ：223-234.
（责任编辑 马鑫）