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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第1期
收稿日期 : 2011-06-16
基金项目 : 贵州省教育厅自然科学研究项目重点项目 [ 黔科教（2009）0132 号 ], 贵州省优秀科技教育人才省长专项资金项目 [ 黔省专合字
（2009）104 号 ] , 农业科技成果转化资金项目（2009GB2F200330）, 科技人员服务企业行动项目（2009GJF20047), 贵州省科技厅
农业攻关项目（黔科合 NY 字［2011］3052 号）
作者简介 : 陈卓 , 男 , 博士 , 副教授 , 研究方向 : 植物分子生物学 ; E-mail: gychenzhuo@yahoo.com.cn
NPR1 多肽抗体的制备和应用
陈卓 刘家驹 毕亮 李向阳 胡德禹 于丹丹 王贞超 杨松 宋宝安
（贵州大学绿色农药与农业生物工程国家重点实验室培育基地 , 贵阳 550025; 贵州大学绿色农药与农业生物
工程教育部重点实验室 , 贵阳 550025）
摘 要： 根据 NCBI GenBank 中报道的 NPR1 一级结构信息，采用 Blastn、Blastx、ExPASy 和 Protean 等软件进行序列同源性
和抗原性指数分析，获得三段序列特异性较高的多肽，并从中优选一段序列特异性多肽，采用 9- 氟甲氧羰基固相合成法获得序列
特异性最好的多肽，采用 HPLC 和 LC-MS 测定合成多肽的浓度和分子量，试验表明目的多肽纯度达 88%、目的多肽分子量为
1.92234 kD。采用碳化二亚胺法将多肽与 KLH 进行偶联获得免疫原 Pep-KLH，并将其免疫新西兰大白兔以获得抗血清和多克隆抗
体，采用 ELISA 和 Western blotting 测定其效价和特异性，经 ELISA 检测表明抗血清和多克隆抗体可与 Pep 发生特异性免疫反应，
经 Western blotting 试验表明抗血清和多克隆抗体可识别烟草叶片特异性条带，其相对分子量为 65 kD，与预测分子量相符，表明利
用该方法制备的 NPR1 多肽抗体具有较高特异性和灵敏度。
关键词： 非表达型病程相关蛋白 序列分析 多肽 合成 多克隆抗体
Preparation and Application of Polyclonal Antibody
with a Peptide of NPR1
Chen Zhuo Liu Jiaju Bi Liang Li Xiangyang Hu Deyu Yu Dandan Wang Zhenchao Yang Song Song Baoan
（State Key Laboratory Breeding Base of Green Pesticide and Agricultural Bioengineering , Guiyang 550025; Key Laboratory of Green Pesticide
and Agricultural Bioengineering, Ministry of Education, Guizhou University, Guiyang 550025）
Abstract: According to the primary structure of information about NPR1 in NCBI GenBank, 3 polypeptides with sequence-specific were
obtained using Blastn and Blastx software. One polypeptide was synthetized by fmoc solid phase synthesis methods, and determined theirs purity
and molecular weight using HPLC and LC-MS with purity value reaching at 88% and molecular weight being at 1.92234 kD. The polypeptide
was coupled to keyhole limpet hemocyanin （KLH） to form a complex of Pep-KLH by EDC. Anti-sera were acquired by immunizing rabbit with
Pep-KLH emulsified by complete freund’s adjuvant （CFA） and incomplete freund’s adjuvant （IFA）, and polyclonal antibody was purified
by affinity chromatography. The titer and specificity of anti-sera and polyclonal antibody were determined by ELISA and Western blotting. The
results showed that anti-sera and polyclonal antibody reacted with Pep-KLH and detected a specific band of 65 kD, and the size was agreed with
the predicted molecular mass. The NPR1 polyclonal antibody revealed high sensitivity and specificity.
Key words: Nonexpressor of pathogenesis-related genes 1 （NPR1） Sequence analysis Polypeptide synthesizing Polyclonal
antibody
系统性获得性抗性（systemic acquired resistance,
SAR）在植物体内具有持效长、作用谱广的抗病特
性，在植物体内，它常被外来入侵的病原生物所激
发［1,2］。植物 SAR 常被植物体内的内源性激素——
水杨酸（salicylic acid, SA）所调控［3-6］，同时引起
病程相关蛋白的表达上调并发挥广泛的抗真菌、抗
细 菌 和 抗 病 毒 的 活 性［7-9］。NPR1（nonexpressor of
pathogenesis-related genes 1），又称为 NIM1 或 SAI1，
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第1期146
是最早从拟南芥（Arabidopsis thaliana）中克隆得到
的、能调控植物病害抗性的关键基因，它不仅对植
物系统获得抗性和诱导系统抗性（induced systemic
resistance, ISR）起核心调控作用，而且是植物基础
抗性（basic resistance）以及由抗病基因（resistance
gene, R）决定的抗性的重要调控因子，它位于 SA 信
号转导通路中，并对 SAR 的活性起着重要的调控作
用［10-12］。同时，研究发现 NPR1 广泛分布于各种植
物中，如水稻、玉米等［13-16］。因此，关于 NPR1 的
研究对于植物生理、植物病理和农药创制的新靶标
研究中均具有重要的意义。本研究拟采用抗体制备
及基于抗体检测的策略，利用生物信息学方法研究
NPR1 的多肽一级结构的序列特异性，人工合成方法
获得目的多肽，并通过偶联获得 Pep-KLH，将其作
为免疫原，由此制备 NPR1 的多肽抗体，并进行抗
原鉴定、抗体纯化以及应用于标本的检测。
1 材料与方法
1. 1 材料
新西兰雄性大白兔（2.5 kg），购自吉林省生
物 制 品 所。 完 全 弗 氏 佐 剂（Complete Freund’s
adjuvant, CFA） 和 不 完 全 弗 氏 佐 剂（Incomplete
Freund’s adjuvant, IFA）购自北京鼎国生物公司。
HRP- 标 记 羊 抗 兔 IgG 抗 体 购 自 Santa Cruz 公 司。
ECL 化学发光试剂盒（ECL plus）购自碧云天公司。
酶联免疫测定仪为 Bio-Rad 公司产品（Model 680），
电泳仪（DYY-12C）、电泳槽（DYY-24DN）及转移
槽（DYCZ-40D）为北京六一公司产品。
1. 2 方法
1.2.1 生物信息学分析 登录进入 http://www.ncbi.
nlm.nih.Gov，采用 Blastn 和 Blastx 程序，进行序列
同源性检索和保守性分析［17］，采用 ProtScale 程序、
ExPASy 工具包程序［18］、SWISS PROT 蛋白数据库［19］
和 DNA star（Protean）［20］生物信息学软件对 HrBP
的二级结构、抗原性、亲疏水性、结合位点、氨基
酸的带电性等理化性质进行分析。
1.2.2 NPR1 多肽的设计与合成 根据生物信息学分
析和预测，按抗原性、亲疏水性和同源性分析，设
计含 15-18 个氨基酸的目的多肽，采用 9- 氟甲氧
羰基（Fmoc）固相合成法合成目的多肽，合成得到
的多肽裂解后得到粗肽，粗肽经高效液相法（high
performance liquid chromatography, HPLC）进行纯化，
纯化后的样品再采用 HPLC 进行纯度分析。HPLC 色
谱柱为 4.6 mm×250 mm（VYDAC-C18 柱），溶剂 A
和 B 分别为含 0.1% 三氟醋酸的无水乙腈溶液和 0.1%
三氟醋酸的水溶液。肽链与 KLH 进行化学连接形成
分子量较大的抗原分子，经纯化后获得纯品多肽抗
原即 Pep-KLH。采用碳化二亚胺法（EDCI）将纯化
多肽与钥孔戚血蓝素（KLH）用进行缩合反应，得
到 Pep-KLH 复合物。
1.2.3 NPR1 抗体的制备 根据抗体生成规律，取
250 μL（约 250 μg）纯化的多肽抗原液，并与等体
积的 CFA 混合，待充分乳化后，采用背部多点注射
法免疫新西兰大白兔。两周后取多肽抗原液加等体
积 IFA，采用上述方法进行加强免疫，免疫抗原量
约 200 μg，以后每两周免疫一次，每次免疫抗原量
约 100 μg，全程共免疫 5 次，在末次免疫 5-7 d 后，
通过家兔耳缘静脉取血进行效价检测，待效价达理
想值后，采用颈动脉放血，收集家兔血清［21］。采用
饱和硫酸铵沉淀法初步纯化兔血清，采用 HPLC 进
行多肽纯度分析［21］。收集兔抗血清，并经过离心
和微滤后，采用 HiTrap Protein A 亲和层析柱进行纯
化。将 5.0 mL 的 HiTrap Protein A 亲和层析预装柱，
与 AKTA explorer 系统相连接，用 0.1 mol/L Tris-HCl
buffer 含（0.15 mol/L NaCl，pH7.5）充分洗涤平衡后
上样，以相同 buffer 洗去未结合的杂蛋白质后，用
0.1 mol/L Gly-HCl buffer（含 0.15 mol/L NaCl，pH2.8）
洗脱，收集洗脱峰，并用 pH7.5 的 buffer 中和后，
冻干备用，采用 SDS-PAGE 分析多抗的纯度［22］。
1.2.4 ELISA 检测抗血清和多克隆抗体效价 将人
工合成裸肽作为抗原，包被浓度设为 2 μg/mL，包被
量为 100 μL/ 孔，4℃包被过夜 ；封闭体系含有 2%
BSA 的 PBST buffer，200 μL/孔，37℃封闭 1-2 h ；采
用含 2% BSA PBST buffer 稀释抗血清，抗血清稀释
比分别为 1 1 k、1 8 k、1 16 k、1 32 k，以 1 200
稀释的正常兔血清作为阴性对照，37℃孵育 1-2 h ；
二 抗 采 用 HRP- 标 记 羊 抗 兔 二 抗， 工 作 浓 度 为
1 10 000，100 μL/ 孔 ；37℃孵育 1-2 h ；以上每步
结束后都是用 PBST 洗 3-5 遍 ；最终采用 TMB 显色
系统进行显色，酶标仪读取 450 nm 波长处的 OD 值，
2012年第1期 147陈卓等 ：NPR1 多肽抗体的制备和应用
当效价达 1 8 000 后，采兔血清，并纯化抗血清获
得多克隆抗体。
1.2.5 Western blotting 分析抗血清和多克隆抗体特异
性 采用打孔器采用烟草叶片样品，并称重后经液
氮固定后，保存于 -80℃冰箱。烟草样品经液氮研磨
成粉后，按质量体积比 1 10 加入碳酸盐包被 buffer，
研 磨 匀 浆 后 转 移 至 EPP 管 中，4 ℃ 条 件 下， 采 用
12 000×g 条件下，离心 15 min，获得蛋白上清液。
采用 Bio-Rad 蛋白定量试剂对上清液进行定量和稀
释，-80℃保存备用。采用 12% SDS-PAGE 电泳分离
烟草蛋白上清液，采用 0.22 μm 的 PVDF 进行转移，
转移条件为 90 mA 恒流，转移时间为 1.5 h。封闭液
采用含 5% 脱脂牛奶 -TBST buffer，室温条件下，采用
0.1% Tween-20 TBST buffer 洗涤 3 次，每次 3-5 min。
样本 A 和样本 B 的抗血清稀释比为 1 650，多克隆
抗体的工作浓度为 5 μg/mL。HRP-标记羊抗兔二抗
采用 1 3 000 稀释比，室温孵育 4 h，ECL plus 试
剂常规感光胶片显影至条带显示完全终止反应。
2 结果
2.1 采用生物信息学预测多肽序列
NPR1 在 GenBank 中的登录号为 AF480488.1 和
LOCUS AF480488。http://www.uniprot.org/uniprot/
Q8LL13，http://www.ebi.ac.uk/cgi-bin/expasyfetch?
AF480488。通过 Blastn 和 Blastx 程序发现 HrBP 中
3 段多肽序列在烟草及其它物种中都具有良好的序
列特异性，其多肽序列为（1）C- NSRTAFSDSNDIS
GSSSIC；（2）C- YSGKVRPSPKDVC；（3）C- CSSTSKG
VDKPNKLPFRK。对 NPR1 进行抗原表位预测分析，
结果如图 1 所示。
1. 柔性区域 ; 2. 抗原性指数 ; 3. 亲水性区域 ; 4. 表面概率结构
图 1 NPR1 抗原性的生物信息学分析
2.2 抗原多肽的合成、纯化及鉴定
采用 HPLC 试验结果（图 2，表 1）发现共有 5
图 2 高效液相色谱测定 NPR1 纯度
编号 时间（min） 样品浓度 峰面积（相对值） 峰高度（相对值）
1 7.943 0.5565 26262 3251
2 13.204 0.2511 11852 1159
3 13.395 1.31 61823 8539
4 13.618 88 4152796 331522
5 14.206 9.883 466373 35266
合计 100 　 4719106 379737
表 1 高效液相色谱测定 NPR1 的纯度
个成分峰，其中一个主要成分峰的含量为 88%，
其 它 4 个 成 分 峰 的 总 浓 度 为 12% ；同 时， 采 用
质谱方法对主要成分多肽进行分子量鉴定，试验
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第1期148
发现其分子量为 1.92234 kD，与预测分子量吻
合 度 较 好， 提 示 获 得 的 目 的 多 肽 可 达 到 抗 体 制
备 试 验 的 要 求， 可 以 用 作 目 的 免 疫 原， 用 以 制
备抗体。
试验发现的 5 个成分峰，其保留时间分别是
7.943,13.204, 13.395, 13.618, 14.206 min， 它 们 对 应
的浓度分别为 0.5565%、0.2511%、1.31%、88% 及
9.883%。
2.3 抗血清或多克隆抗体效价
采用间接 ELISA 方法，对两个样本的抗血清进
行免疫检测，试验发现在 1 32 k 的条件下，样本 A
和 B 的两个重复抗血清的 OD 值为分别为 1.804 和
1.173（图 3）。对样本 B 的抗血清进一步进行纯化，
获得的多克隆抗体（样本 C），并进行效价检测，试
验发现在稀释比在 1 128 k 条件下，其 OD 值为 1.047
（图 4）。
图 3 样本 A 和样本 B 的 NPR1 的抗血清效价测定
图 4 NPR1 的多克隆抗体（样本 C）效价测定
2.4 抗血清和多克隆抗体的特异性
试验以健康烟草和经 TMV 处理的烟草叶片蛋
白提取液为样本，进行抗血清的特异性检测（图
5），在分子量为 72 kD 和 55 kD 之间有一条带，经
GenBank 检索表明 NPR1 的分子量大小为 60 kD，正
好处于两个分子量条带之间，表明该蛋白为目的蛋
白。同时，试验发现样本 A 抗血清的特异性比样本
B 的特异性好。
此外，对样本 A 的抗血清进行多克隆抗体的
纯化（样本 C）以及抗体对上述烟草样本的特异性
检测（图 6），试验发现多克隆抗体特异性好，不
存在非特异性产物，同时发现 NPR1 在 CK、1D、
3D 和 5D 各处理组的表达趋势呈先增加，后逐渐降
低的趋势。
CK、1 D、3 D 和 5 D 分别代表普通烟叶片被 TMV 侵染 0 d、
1 d、3 d 和 5 d 的时间
图 5 Western blotting 检测 NPR1 分子特异性
3 讨论
自 1994 年 Cao 等［10-12,23］ 发现 NPR1 对于诱导
PR 表达、激活植物 SA 信号通路、提高 SAR 活性，
有着重要的作用。同时，研究发现各种植物体内的
CK、1 D、3 D 和 5 D 分别代表普通烟叶片被 TMV 侵染 0 d、
1 d、3 d 和 5 d 的时间
图 6 Western blotting 检测 NPR1 分子特异性
2012年第1期 149陈卓等 ：NPR1 多肽抗体的制备和应用
肽段，为制备高选择性的抗体奠定了基础。
试验采用 9-氟甲氧羰基固相合成法获得了多肽，
并采用碳化二亚胺法制备 Pep-KLH 的复合物，并由
此进行兔的免疫，获得了多克隆抗体。
试验采用间接 ELISA 和 Western blotting 方法对
NPR1 多克隆抗体的效价和特异性进行评价，结果表
明通过该方法制备的抗体的效价高、特异性强。
参 考 文 献
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有重要的作用。因此，关于 NPR 的研究备受大家的
关注，国外科学家针对 NPR1 在激活 SA 信号通路
中的作用，相继发现具有激活 NPR1 的小分子化合
物， 如 BA、BTH 和 INA［24-27］。 同 时，Nakashita 等
发现 Chloroisonicotinamide 衍生物还能广泛作用于双
子叶植物烟草和单子叶植物水稻的 SA 信号转导通
路，并引起 NPR1 分子的高表达。因此，关于 NPR1
分子在植物生理、病理和农业应用中具有重要的研
究价值。然而，关于 NPR1 及其所在 SA 信号通路的
研究，前人一直是采用综合的方法进行研究，如采
用 HPLC 测定 SA 含量、采用 SDS-PAGE 分析植物
叶片中胞间蛋白、采用 Western blotting 技术研究 PR
蛋白的表达、采用 POD、PAL 和 SOD 等防御酶方法
研究酶活性的变化，但目前，一直未见有 NPR1 的
抗体及相关检测方法的报道。因此，我们通过 NCBI
GenBank 中报道 NPR1 序列信息，并根据多肽亲水性、
肽链可塑性、二级结构和抗原性指数，获得三段序
列特异性较高的多肽序列，并进行人工合成，同时，
通过 HPLC 方法测定人工合成多肽表明其纯度达
88%，并且通过质谱鉴定分子量与预计分子量吻合，
其分子量为 1.99234 kD。在此基础上，将其与 KLH
连接，并免疫新西兰大白兔，得到针对 NPR1 的多
肽抗体。采用 ELISA 和 Western blot 技术验证了该
抗体的特异性和敏感性。ELISA 结果显示所制备兔
抗 NPR1 多肽抗体可特异性识别多肽，并呈现较高
滴度。同时，采用健康普通烟、TMV 浸染 1 d、3 d
和 5 d 四样本，研究 NPR1 在 4 个处理组中的表达变
化，试验发现烟草经 TMV 处理后，具有诱导高表达
的趋势，这与前人研究结果一致。
综上所述，本研究制备的 NPR1 多克隆抗体
具有与其抗原特异性结合的特征，并成功应用于
ELISA 和免疫印迹试验，这为进一步深入研究此分
子的病理、生理学功能及其调控提供了重要参考。
4 结论
根据生物信息学方法对普通烟（Nicotiana taba-
cum）的 NPR1 的同源性较低的区域以及新的结构域
进行了分析，同时还进一步分析了这些区域的亲水
性、抗原性指数等，从而获得了序列特异性较高的
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第1期150
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（责任编辑 李楠）