全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第2期
收稿日期 : 2011-06-23
基金项目 : 国家自然科学基金项目（31070119）
作者简介 : 姜茵 , 女 , 本科 , 研究方向 : 幽门螺杆菌 T 细胞表位研究 ; E-mail: christina881101@sina.com
通讯作者 : 李妍 , 副教授 ,E-mail: liyan_nys@hotmail.com
幽门杆菌 Catalase/GST 融合蛋白的表达、
标签切除及鉴定
姜茵 奚月 李妍
（南方医科大学生物技术学院生物治疗研究所，广州 510515）
摘 要 : 旨在利用 GST 融合基因表达系统表达幽门螺杆菌 Catalase 融合蛋白，并利用凝血酶切除 GST 标签。将重组质粒
Catalase/pGEX-4T-1 转化大肠杆菌 BL21（DE3）感受态中，用 IPTG 进行诱导表达，菌体经反复冻融、溶菌酶裂解及超声破菌后，
Catalase/GST 融合蛋白以部分可溶性的形式表达在上清中。采用谷胱甘肽琼脂糖树脂 Glutathione Sepharose 4B 对其进行纯化，得到
Catalase/GST 融合蛋白，再用凝血酶进行 GST 标签的切除，所得产物进行 Western blotting 鉴定。高效表达出 Catalase/GST 融合蛋白
的相对分子质量约 85 kD，凝血酶成功地切除了 GST 标签，Western blotting 证实 Catalase 蛋白能被鼠抗 Catalase 单克隆抗体识别。
关键词 : 幽门螺杆菌 Catalase 融合表达 GST 标签切除 纯化
Expression, Tag Cleavage and Identification of Catalase/GST
Fusion Protein of Helicobacter pylori
Jiang Yin Xi Yue Li Yan
（Biotherapy Institute, School of Biotechnology, Southern Medical University, Guangzhou 510515）
Abstact: It was to express Catalase-GST fusion protein by GST gene expression system and cleave GST-tag using thrombin. The
recombinant Catalase/pGEX4T-1 plasmid was transformed into E. coli BL21 （DE3） compenent cell and induced by IPTG. The bacterial
sediment was lysed by repeating freezing and thawing, lysozyme lysis and ultrasonication. Catalase/GST fusion protein was purified by
Glutathione Sepharose 4B and cleaved the GST-tag using thrombin. Then Catalase was identified by anti-Catalase monoclonal antibody using
Western blotting. Results showed that the fusion Catalase/GST was partly expressed in soluble form with relative molecular mass of 8.5 kD. After
cleavage of GST tag, Catalase protein was recognized by mouse anti-Catalase monoclonal antibody by Western blotting. The recombinant Catalase
is successfully expressed and purified, which lay a foundation for further study on function of Catalase protein.
Key words: Helicobacter pylori Catalase Fusion expression GST-tag cleavage Purification
过氧化氢酶（Catalase，KatA）是幽门螺杆菌（Heli-
cobacter pylori）的一种高活力、稳定并高度保守的
蛋白酶 , 约占其菌体蛋白的 1.5% ［1］ 。当 H. pylori 感
染胃黏膜组织后 , 大量嗜中性粒细胞浸润引起的急
性炎症反应可产生大量的氧自由基，对 H. pylori 的
生 存 构 成 威 胁 , 从 而 诱 导 H. pylori 表 达 Catalase。
Catalase 和 超 氧 化 物 歧 化 酶（SOD） 共 同 构 成 H.
pylori 的抗氧化保护系统，SOD 可催化超氧阴离子与
氢离子的反应形成 H2O2 和水 ；Catalase 则催化 H2O2
分解成分子氧和水，从而解除氧自由基对 H. pylori
的杀伤作用［2］，保护 H. pylori 免遭胃内环境中的氧
化损害，使微需氧的 H. pylori 能逃避宿主的抵御和
清除 , 在富含超氧离子的不利环境中生存。可见，
Catalase 在 H. pylori 致病过程及抵抗宿主炎症细胞的
防御作用过程中发挥着重要作用。尤其值得关注的
是，当 pH<5 时，占 H. pylori 菌体总蛋白 10 % 的尿
素酶即失去活性 ；与之相反 , 当 pH<3 时，Catalase
仍可保持活性 , 提示 H. pylori 能在酸性环境下存活，
2012年第2期 103姜茵等 ：幽门杆菌 Catalase/GST 融合蛋白的表达、标签切除及鉴定
Catalase 可能比尿素酶发挥着更大的作用，将其作为
H. pylori 的疫苗候选成分 , 可能比传统的尿素酶有更
好的应用前景［3］。 Catalase 除定位于胞质和胞周质
外［1］，另外还存在于细菌的表面［4］，从而为宿主免
疫反应提供方便的作用靶点。Radcliff 等［3］通过动
物试验证实，以天然 Catalase 为抗原的疫苗保护率
达 80%，以重组 Catalase 为抗原的疫苗保护率可达
95%，表明 Catalase 是制备 H. pylori 疫苗的一种理想
的靶抗原。国内的一些研究表明，单独的 Catalase
或 Catalase 与 UreaseB、UreaseA 和 粘 附 素 重 组 的
双价减毒沙门菌疫苗株能诱导抗 H. pylori 保护性免
疫反应，对 H. pylori 感染的小鼠具有一定的治疗作
用［7-11］。黄文等［12］利用脂质体包裹 Catalase 制成口
服疫苗免疫小鼠，胃粘膜H. pylori 感染数目明显减少。
Sanchez 等［5］利用 Catalase 能在小鼠中诱导出保护
性的 Th 反应。综上所述， Catalase 是 H. pylori 的一
种比较理想的疫苗候选抗原。
本研究拟表达 Catalase/GST 融合蛋白，并对其
进行 GST 的切割纯化，旨在为进一步研究 Catalase
的功能研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株及质粒 大肠杆菌 BL21（DE3）和载体
pGEX-4T-1 由本教研室提供 ; Catalase/pGEX-4T-1 重
组质粒由李妍［13］构建。
1.1.2 试 剂 谷 胱 甘 肽 琼 脂 糖 树 脂 Glutathione
Sepharose 4B 和凝血酶（thrombin）为 GE Healthcare
公 司 产 品 ；还 原 型 谷 胱 甘 肽（reduced glutathione）
为 Novagen 公 司 产 品 ; 溶 菌 酶 为 Amresco 公 司 产
品 ；Triton X-100 为 Sigma 公司产品 ; 为低相对分子
质量蛋白 Marker 购自 TaKaRa 公司、异丙基硫代半
乳糖苷（IPTG）、β-巯基乙醇、乙二胺四乙酸二钠
（EDTA）、HRP 标记的羊抗鼠 IgG 购自华美生物工程
公司 ；BCA 蛋白检测试剂盒购自碧云天公司 ；鼠抗
Catalase 单克隆抗体由李研制备［13］; 丙烯酰胺、甲
叉双丙烯酰胺等均为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 Catalase/GST 融合蛋白的诱导表达及其表达形
式分析 利用 CaCl2 法制备 E. coli BL21（DE3） 感受
态，并进行重组质粒 Catalase/pGEX-4T-1 转化 , 37℃
孵箱倒置培养过夜。次日挑取单菌落 , 接种至 LB 液
体 培 养 基（ 含 Amp，100 μg/mL），30 ℃ 摇 床 振 荡
（220 r/min） 培 养 过 夜。 次 日 按 1% 接 种 LB 液 体
培 养 基 中（ 含 Amp，100 μg/mL），30 ℃ 摇 床 振 荡
（220 r/min）培养至 OD600=0.5 时 , 加入 IPTG（终浓
度为 1 mmol/L）, 诱导表达 5 h，离心 , 4℃ , 5 000 r /min，
20 min, 弃上清，收集沉淀称重。先采用反复冻融破菌，
随后将按 1 g 沉淀加 10 mL PBS（pH7.3）重悬菌体，
同时按 1 g 菌体加 10 mg 溶菌酶，并按 1 1 000 加入 β-
巯基乙醇，室温搅拌 1 h。结束后进行超声破碎，冰
上操作，15 s/5 s，全程 15 min，35℃，400 w。收集
破碎液，4℃离心，12 000 r/min，30 min，分别收集
上清和沉淀，进行 12% SDS-PAGE，分析 Catalase/
GST 融合蛋白的表达形式。
1.2.2 Catalase/GST 融 合 蛋 白 的 亲 和 层 析 纯 化 及
其 GST 标签的切除 经融合蛋白的表达形式分析，
Catalase/GST 融合蛋白部分以可溶性的形式存在于
上清中，因此采用谷胱甘肽琼脂糖树脂 Glutathione
Sepharose 4B 进行纯化。用大约 5 柱床容积的平衡
缓 冲 液 PBS（pH7.3） 平 衡 柱 子。 上 样 经 0.45 μm
的过滤器过滤的超声裂解液的上清，再用 PBS 洗
杂， 用 5 柱 床 容 积 的 洗 脱 缓 冲 液 50 mmol/L Tris-
HCl，10 mmol/L 还原型谷胱甘肽（pH8.0）洗脱结合
在柱子上的融合蛋白，收集洗脱液 , 进行 12% SDS-
PAGE。确定成功纯化 Catalase/GST 融合蛋白后，对
其进行过夜透析，透析液为凝血酶裂解液（PBS，
pH7.3）, 以除去还原型谷胱甘肽。利用 BCA 法测定
Catalase/GST 融合蛋白的浓度，根据每毫克蛋白加
入 10 μL（10 单位）的凝血酶 , 室温（22-25℃）孵
育 16 h，用 PBS （pH7.3）缓冲液过夜透析除去 GST。
然后与 Glutathione Sepharose 4B（按每毫升层析介质
结合 8 mg 蛋白）孵育 30 min，500×g 离心 5 min，
上清中将含有目的蛋白 Catalase。
1.2.3 Western blotting 鉴 定 Catalase 蛋 白 将 GST
蛋白（作为对照）及 Catalase 蛋白（500 ng）先经
12% SDS-PAGE 分离后 , 然后电转移至硝酸纤维素
膜（PVDF）上，将膜在含 5% 脱脂奶粉的 TBST（10
mmol/L Tris-HCl，pH7.5，150 mmol/L NaCl，0.05%
Tween-20）中室温下封闭 1 h，先加入鼠抗 Catalase
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第2期104
单克隆抗体［6］（1 500），室温下孵育 1 h，TBST 洗膜
3 次 , 10 min / 次 , 再 加 入 兔 抗 鼠 HRP-IgG（1
5 000），室温下孵育 1 h，TBST 洗膜 3 次，10 min / 次，
ECL 显色。
2 结果
2.1 Catalase-GST 融合蛋白的诱导表达
经 12% SDS-PAGE 可见 , IPTG 诱导 4 h 后，空载
体 pGEX-4T-1 在 相 对 分 子 量 26 kD 处 表 达 出 蛋 白
条带，重组质粒 Catalase/pGEX-4T-1 在相对分子质
量 约 85 kD 处 表 达 出 蛋 白 条 带（ 图 1）， 与 预 期
Catalase-GST 融合蛋白的大小相符。
2.2 Catalase-GST融合蛋白的表达形式分析
反复冻融融合蛋白表达产物，随后用溶菌酶对
其进行裂解，并进行超声破菌，发现融合蛋白在上
清和沉淀中均有分布（图 2），表明融合蛋白以部分
可溶性形式分布。
1.pGEX-4T-1 诱导前；2.pGEX-4T-1 诱导后；3.Catalase/pGEX-4T-1 诱导前；
4.Catalase/pGEX-4T-1 诱导后 ；5. 蛋白质分子量标准
图 1 SDS-PAGE 分析 Catalase-GST 融合蛋白的诱导表达
1. 蛋白质分子量标准 ；2.Catalase/pGEX-4T-1 诱导前 ；3.Catalase/pGEX-
4T-1 诱导后 ；4. 超声破菌后上清 ；5. 超声破菌后沉淀
图 2 SDS-PAGE 分析 Catalase-GST 融合蛋白的表达形式
2.3 Catalase-GST融合蛋白的纯化及其GST标签的
切除
利用 Glutathione Sepharose 4B 对 Catalase-GST 融
合蛋白的表达上清进行纯化 , 对结合在树脂上的
Catalase-GST 融合蛋白，用含有还原型谷胱甘肽的洗
脱缓冲液洗脱，可见一洗脱峰（图 3）。SDS-PAGE
分析洗脱液成分，在相对分子质量约 85 kD 处可见
与 Catalase-GST 融合蛋白大小相符（图 4）。 将纯化
后的 Catalase-GST 进行 GST 标签的切除，SDS-PAGE
分 析 Catalase 目 的 蛋 白 大 小 与 预 计 的 相 符， 约 为
59 kD 左右。
2.4 切除GST标签后的目的蛋白的Western blotting
鉴定
以鼠抗 Catalase 单克隆抗体对切除 GST 标签后
的 Catalase 蛋 白 进 行 Western blotting 检 测（ 图 5），
以 GST 蛋白为对照，鼠抗 Catalase 单克隆抗体只与
Catalase 蛋白反应，而与 GST 蛋白不反应，证实切
割 GST 标签后成功获得目的蛋白 Catalase。
I. 上样和洗杂峰 ；II. 还原型谷胱甘肽洗脱峰
图 3 Catalase-GST 融合蛋白的纯化色谱图
2012年第2期 105姜茵等 ：幽门杆菌 Catalase/GST 融合蛋白的表达、标签切除及鉴定
3 讨论
Invitrogen 公 司 的 pGEX-4T-1 是 一 种 高 效 的 原
核表达载体 , 属于 IPTG 诱导的启动子 , 其所表达的
蛋白在 N 端带有 GST 标签蛋白 , 其相对分子质量约
为 26 kD。 其优点之一是 pGEX-4T-1 载体一般能高
效表达外源蛋白，优点之二是融合蛋白的表达产物
可通过 GST 亲和层析柱简便、快速地纯化，优点之
三是在 GST 标签后含有凝血酶（thrombin）切割位
点 , 其表达的融合蛋白可以通过 thrombin 切割 GST
标签后而获得目的蛋白。在本试验中，H. pylori 的
Catalase 预期蛋白表达的分子量约为 59 kD，故融合
蛋白相对分子量约为 85 kD，表达结果与预期相符。
同时，为了达到完全裂解细菌的目的，采用了 3 种
破碎方法，即反复冻融、溶菌酶法和超声破菌法，
发现融合蛋白 Catalase/GST 在上清和沉淀中均有表
达。如果利用包涵体进行变性和复性，可能会影响
蛋白质的结构和功能。因此，利用超声裂菌液的上
清进行纯化，尽管上清中目的蛋白的含量没有沉淀
中多。 经 Glutathione Sepharose 4B 亲和层析纯化后 ,
得到融合蛋白 Catalase/GST，体外经 thormbin 切割后，
在相对分子质量 5.9 kD 得到纯化条带，与预期大小
一致。
前期研究中，利用 Catalase/GST 融合蛋白免疫
BALB/c 小鼠制备了鼠抗 Catalase 单克隆抗体，在
筛选杂交瘤和单克隆抗体过程中，在 ELISA 板上
同时包被 Catalase/GST 融合蛋白和 GST 蛋白，与两
者同时反应或只与 GST 反应的抗体被舍弃，只有
与 Catalase/GST 融合蛋白反应而与 GST 蛋白不反应
的抗体最后被建株，并以此抗体为靶标通过噬菌体
随机肽库技术鉴定了 Catalase 的 B 细胞的表位［6］。
在以上研究中，GST 标签并不影响试验研究和目
的，所以我们并没有进行 trombin 切割融合蛋白。但
是，下一步要鉴定 Catalase 的 Th 细胞表位，采用
的方法是计算机预测结合体外固相合成表位肽的技
术。首先要用 Catalase 抗原免疫 BALB/c 小鼠使其致
敏，然后分离脾细胞 , 用合成的 Th 表位肽刺激，为
避免 GST 引起的免疫反应产生干扰，对纯化后的
Catalase/GST 融合蛋白采用凝血酶切割 GST 标签，
获得单独的 Catalase 蛋白。为进一步证实所纯化得
到的 Catalase 蛋白，利用鼠抗 Catalase 单克隆抗体，
对切割 GST 标签后的目的蛋白进行 Western blotting
检测 , 证实获得了 Catalase 蛋白 , 这对下一步进行
Catalase 功能的研究奠定了基础。
4 结论
本研究采用 pGEX-4T-1 融合表达载体系统高
效 表 达 Catalase/GST 融 合 蛋 白， 利 用 Glutathione
Sepharose 4B 亲和层析方法纯化融合蛋白，并体外经
thormbin 切除 GST 标签。
1. 纯化的融合蛋白 Catalase/GST ；2. 切除 GST 标签后的 Catalase ；
3. 蛋白质分子量标准
图 4 SDS-PAGE 分析 Catalase-GST 融合蛋白的纯化及
切除 GST 标签
1.GST 蛋白 ；2.Catalase 蛋白 ；3. 蛋白质分子量标准
图 5 Western blotting 分析切割 GST 标签后的
Catalase 蛋白
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第2期106
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（责任编辑 李楠）