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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011年第 5期
谷氨酸棒杆菌 aroÒ、trpEGD基因的过量表达及其
对色氨酸合成的影响
李智涛 伍展红 郑穗平
(华南理工大学生物科学与工程学院,广州 510006 )
摘 要: 以谷氨酸棒杆菌 SPT9( Phe-、Ty r-、4-FPr、6-FTr )为出发菌株,采用 PCR方法扩增色氨酸合成途径中解除了反
馈抑制的关键酶 aroÒ和 trpEGD基因,应用大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭表达载体 pEC-XK99E在谷氨酸棒杆菌 SPT9中对其
进行了分别过量表达和串联过量表达。首先对 aroÒ和 trpEGD基因分别进行过量表达, 得到菌株 SPT9-a roÒ、SPT9- trpEGD,
摇瓶发酵试验表明, 菌株 SPT9-aroÒ、SPT9-trpEGD的色氨酸产量相对于出发菌株 SPT9分别提高了 30%、23% ; 进一步对 aro
Ò和 trpEGD进行了串联过量表达,得到菌株 SPT9- trpEGD-TP-aroÒ , 摇瓶发酵试验表明, 该菌株色氨酸产量相对于出发菌株
SPT9提高了 84%。荧光定量 PCR检测表明,菌株 SPT9- trpEGD-TP-a roÒ中 aroÒ、trpEGD基因的表达量分别为出发菌株 SPT9
的 41 0倍和 11 3倍。
关键词: 谷氨酸棒杆菌 L-色氨酸 关键酶 过量表达 串联表达
Over-expression of aroÒ and trpEGD Genes in Corynebacterium
glutam icum and Their Effects on Tryptophan Yield
L i Zh itao Wu Zhanhong Zheng Suiping
( School of B ioscience and T echno logy, South China University of T echnology, Guangzhou 510006)
Abstrac:t The host stra in in this paper was C. glutam icum SPT9( Phe- , T yr- , 4-FPr, 6-FT r ). In o rder to improve b io-production
o f tryptophan, feedback inh ib ition resistant a roÒ and trpEGD genes were c loned by PCR and ove r-expressed in C. glutam icum SPT9 re-
spectively us ing Escher ichia co li-C. glutam icum shuttle expression vec to r pEC-XK99E. Over-expressions w ere effec tive, and the am ounts
o f tryptophan biosynthesis in the resu lted strains SPT9-aroÒ , SPT9-trpEGD we re increased by 30% and 23% respectively, com pa red
w ith that o f the host strains SPT9. Then, aroÒ and trpEGD genes we re co-expressed using the sam e shuttle expression vector pEC-
XK99E, and the am ount o f tryptophan b io syn thesis in the resulted stra in SPT9- trpEGD-TP-aroÒ was inc reased by 84% compared w ith
tha t of the ho st stra ins SPT9. F luorescence quantitative PCR show ed that the relative express ions o f aroÒ and trpEGD genes in strain
SPT9- trpEGD-TP-aroÒ were increased to 41 0 fo lds and 11 3 fo lds, respectively.
Key words: Corynebacterium glutam icum L-tryptophan Key enzym es Over-expression Co-expression
收稿日期: 2011-03-01
基金项目:中央高校基本科研业务费资助项目 ( 2009ZM 0289 ) ,国家科技支撑计划项目 ( 2007BAK36B03)
作者简介:李智涛,男,硕士研究生,研究方向:氨基酸育种; E-m ai:l lizh itao3298@ 163. com
通讯作者:郑穗平,男,副教授, E-m ai:l sp zheng@ scu t. edu. cn
色氨酸作为人和动物体自身不能合成而又具有
多项生理功能的必需氨基酸,在医药、食品和饲料添
加剂等方面具有广泛的用途。由于 L-色氨酸在国
际市场上需求量的逐年攀升,而生产供应量远没有
达到要求,因此国内外对 L-色氨酸的生产研究非常
重视。在工业上, L-色氨酸的生产方式已由依靠化
学合成法和蛋白质水解法转为微生物发酵法。微生
物发酵是 L-色氨酸的主要生产方式, 它提供了一
种成本较低、收率高、纯度高、副产物少且操作容
易的工业化生产方法 [ 1, 2 ]。近年来由于分子生物
学技术 (特别是基因重组技术和基因组全序列测
定技术等 )的兴起及代谢工程概念的提出,为色氨
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2011年第 5期
酸的工业化生产注入新的活力。有目的的设计和
构建适合色氨酸生产的代谢途径已成为提高 L-色
氨酸产量的有效措施, 也将是今后育种的主要
方向 [ 3]。
自从 1957年 K inoshit首次描述谷氨酸棒杆菌
(C. g lutam icum )为谷氨酸产生菌 [ 4] , 谷氨酸棒杆菌
已经逐渐成为全世界范围内用于氨基酸生产的主要
菌株。在谷氨酸棒杆菌中, 芳香族氨基酸合成的共
同途径中的关键酶为 aroÒ基因编码的 3-脱氧-D-阿
拉伯庚酮糖酸-7-磷酸 ( DAHP)合成酶。色氨酸操纵
子 ( trp)负责编码色氨酸合成分支途径中的各个酶,
trpE和 trpG基因分别编码邻氨基苯甲酸合成酶
(ANS)的两个亚基, trpD基因编码邻氨基苯甲酸磷
酸核糖转移酶 ( PRT) , trpC ( F )基因编码邻氨基苯甲
酸异构酶、吲哚-3-磷酸甘油合成酶, trpB和 trpA基
因分别编码色氨酸合成酶的两个亚基。对色氨酸合
成途径代谢流的控制主要是通过色氨酸对这些酶的
反馈阻遏和反馈抑制实现的,而其中关键的控制位
点是邻氨基苯甲酸合成酶和邻氨基苯甲酸磷酸核糖
转移酶 [ 2, 5]。
王玉华等 [ 1]在谷氨酸棒杆菌突变菌株 JLC中
过量表达解除了苯丙氨酸和酪氨酸协同反馈抑制的
DAHP合成酶基因, 取得了较好的效果, DS酶活力
为宿主菌的 519倍, 色氨酸产量较宿主菌提高了
65%。由此可见,对色氨酸合成途径中的关键酶基
因的过量表达对色氨酸育种是有效的。运用分子生
物学技术手段, 在谷氨酸棒杆菌 SPT9中对 DAHP
合成酶 aroÒ基因、色氨酸操纵子中的关键基因 tr-
pEGD分别进行了单独过量表达和串联过量表达,
研究其对色氨酸产量的影响。
1 材料与方法
111 菌株及质粒
所用到的菌株和质粒,见表 1,其中谷氨酸棒杆
菌 SPT9由谷氨酸棒杆菌 ATCC13032经紫外和亚硝
基胍诱变得到。
112 培养基和培养条件
LB或 LBG( LB+ 015%葡萄糖 )培养基用于培
养大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌, 必要时加入终浓度为
50 Lg /mL的卡那霉素。大肠杆菌在 37e 培养, 谷
氨酸棒杆菌在 30e 培养。
表 1 菌株和质粒
菌株及质粒 功能 来源
E. coli TOP10
F-, m crA$ ( m rr-h sd RM S-m crBC ), U80, lacZ$M 15, v lacX74, recA1, ara$139$
( ara-leu) 7697, galU, galK, rps, ( Strr) endA1, nupG
本实验室
C. g lu tan icum SPT9 Phe-, Tyr-, 4-FPr, 6-FTr 本实验室
SPT9-aroÒ over-express aroÒ in C. g lu tan icum SPT9 本研究
SPT9-trpEGD over-express trpEGD inC. glutanicum SPT9 本研究
SPT9-trpEGD-TP-aroÒ co-express trpEGD and aroÒ C. g lu tanicum SPT9 本研究
pEC-XK99E E. C oli-C. g lu tam icum shutt le express ion vector, KmR 参考文献 [ 6 ]
pEC-XK99E-aroÒ over-express aroÒ 本研究
pEC-XK99E-trpEGD over-express trpEGD 本研究
pEC-XK99E-trpEGD-TP-aroÒ co-express trpEGD and aroÒ 本研究
种子培养基:葡萄糖 2% ,蛋白胨 115% ,酵母提
取 物 115%, NaC l 0125%, 尿 素 011% , Tyr
200mg /L、Phe 200 mg /L, pH712。
发酵培养基: 葡萄糖 6%, 硫酸铵 2% , 玉米浆
015%,磷酸氢二钾 0105%, 磷酸二氢钾 0105% , M g-
SO4# 7H2O 01025%, M nSO 4 # 7H2O 10 mg /L,生物
素 30 Lg /L, CaCO 3 2% , pH712, 生物素过滤除菌,
C aCO3分开灭菌 [ 7, 8]。
113 试剂
限制性内切酶、T4 DNA ligase、Taq DNA Po ly-
merase、DN ase I( RN ase Free)、DL15000DNA M arker
均为宝生物工程 (大连 )有限公司产品; 质粒提取试
剂盒、PCR产物纯化试剂盒及胶回收试剂盒购自上
海生工; 总 RNA的提取试剂盒 RN easyM id iK it购自
152
2011年第 5期 李智涛等:谷氨酸棒杆菌 aroÒ、trpEGD基因的过量表达及其对色氨酸合成的影响
Q IAGEN公司、纯化试剂盒 Nucleospin RNA C lean-up
购自 Macherey N agel公司, 反转录试剂盒 TaKaR a
PrimeScript
Ó
RT reagent kit、荧光定量 PCR试剂盒
SYBR
Ó
Prem ix ExTaq
TM
II均为宝生物工程 (大连 )
有限公司产品;胰蛋白胨、酵母提取物购自 Oxo id公
司;异丙基-B-D-硫代半乳糖苷 ( IPTG )、L-色氨酸标
准品购自美国 Sigma公司; 其他化学试剂均为国产
或进口分析纯产品。
114 PCR引物设计及目的片段的扩增
根据同源性,参照谷氨酸棒杆菌 ATCC13032基
因序列 ( GenBank登录号 NC003450)设计引物:
aroÒ-1: 5c-GCTCTAGAATGAATAGGGGTGT-
GAGTTGGACAGTT-3c
aroÒ-2: 5c-CGACGTCGACTTAGTTACGCAG-
CATTTCTGCAACGAG-3c
aroÒ -3: 5c-GCTCTAGATCGATCTGCTCCCATTC-
CATAGGTTGG-3c
trpEGD-1: 5c-CCGGAATTCATGAGCACGAATC-
CCCATGTTTTCTC-3c
trpEGD-2: 5c-CGCGGATCCCTAGTCATTGGAA-
GACTCCTTTTCTG-3c
aroÒ-1、aroÒ-2基因分别带有 XbaÑ、SalÑ酶
切位点,用于扩增 aroÒ结构基因 ( 1 401 bp); aroÒ-
3基因带 XbaÑ酶切位点, aroÒ-3与 aroÒ-2基因用
于扩增 TP-aroÒ ( 1 545 bp,包括 aroÒ结构基因及其
上游的启动子和终止子 ); trpEGD-1、trpEGD-2基因
分别带有 EcoRÑ、BamH Ñ酶切位点, 用于扩增 tr-
pEGD基因片段 ( 3 246 bp )。引物均由华大基因
合成。
PCR扩增 aroÒ (或 TP-aroÒ )基因的反应体系
为 50 LL: ddH 2O 3815 LL, 10 @ E @ buffer 5 LL,
dNTP 5 LL,引物 aroÒ-1、aroÒ-2(或 aroÒ-2、aroÒ-
3)各 015 LL, SPT9菌体少量, Ex Taq酶 015 LL,混
合后进行 PCR扩增。 PCR反应程序: 94e 预变性
10 m in; 94e 变性 30 s, 55e 退火 30 s, 72e 延伸
1175m in, 30个循环; 72e 最后延伸 10 m in。
PCR 扩增 trpEGD基因片段的反应体系为
50 LL: ddH2O 3815 LL, 10 @ E @ buffer 5 LL, dNTP
5 LL,引物 trpEGD-1、2各 015 LL, SPT9菌体少量,
ExTaq酶 015 LL, 混合后进行 PCR扩增。 PCR反
应程序: 94e 预变性 10 m in; 94e 变性 30 s, 58e 退
火 30 s, 72e 延伸 315m in, 30个循环; 72e 最后延伸
10m in。
115 重组质粒的构建
11511 pEC-XK99E-aroÒ (或 pEC-XK99E-TP-aro
Ò )的构建 将 aroÒ (或 TP-aroÒ )片段与表达载
体 pEC-XK99E同时用限制性内切酶 XbaÑ、SalÑ进
行双酶切,双酶切体系 50 LL:目的基因片段或载体
溶液 3915 LL, 10 @T buffer 715 LL, X baÑ、SalÑ各
115 LL, 37e 水浴过夜酶切。双酶切产物用 PCR产
物纯化试剂盒纯化后用于后续连接反应,连接反应
体系 20 LL: aroÒ (或 TP-aroÒ ) 14 LL, pEC-XK 99E
3 LL, 10 @ ligase buffer 2 LL,连接酶 1 LL, 16e 过夜
连接。连接体系转化大肠杆菌 TOP10感受态细胞
后涂布于含卡那霉素终浓度 50 Lg /mL的 LB平板
上, 置于 37e 恒温培养箱中倒置培养 12- 14 h。挑
单菌落进行菌落 PCR鉴定 ( PCR体系和方法同
114), 鉴定正确的菌落转接至含终浓度 50 Lg /mL
卡那霉素的 LB液体培养基中 37e , 200 r/m in培养
12 h, 提质粒进行酶切鉴定, 酶切体系同前面 pEC-
XK99E-aroÒ (或 pEC-XK99E-TP-aroÒ )的构建。
11512 pEC-XK99E-trpEGD的构建 trpEGD基因
片段与 pEC-XK99E的双酶切体系如下: trpEGD或
pEC-XK99E溶液 41 LL, 10 @ K bu ffer 5 LL, E coR
Ñ、BamH Ñ各 2 LL,总体积 50 LL。连接、转化及鉴
定方法同前面所述。
11513 串联表达载体 pEC-XK99E-trpEGD-TP-aroÒ
的构建 将 trpEGD基因片段与 pEC-XK99E-TP-aro
Ò按照构建 pEC-XK99E-trpEGD的相同的方法进行
双酶切、回收、连接、转化及鉴定, 从而构建串联表达
载体 pEC-XK99E-trpEGD-TP-aroÒ。
116 谷氨酸棒杆菌感受态的制备及电激转化
制备谷氨酸棒杆菌 SPT9感受态细胞, 并采用
电激转化将构建好的表达载体转化至谷氨酸棒杆菌
SPT9感受态细胞 [ 10, 11]。电激转化完成后将菌体涂
布在含卡那霉素终浓度为 50 Lg /mL的 LBG平板
上, 于 30e 倒置培养 36 h左右。
117 发酵试验及色氨酸的检测
挑取经过营养肉汤培养基活化的斜面种子一环
接种至种子培养基装液量为 20 mL的 250 mL三角
153
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2011年第 5期
瓶, 30e 、250 r /m in预培养至对数生长中后期 ( 24 h
左右 ) , 按 5%接种量接种至发酵培养基 30e 、250
r /m in发酵 72 h。转化了表达载体的菌株在种子培
养基及发酵培养基中均添加终浓度 50 Lg /mL的卡
那霉素,并当发酵进行到 12 h时添加终浓度为 012
g /L的 IPTG[ 12]。
发酵结束后,各菌株发酵液 13 000 r/m in离心
5 m in,取上清液稀释 10倍,过滤后用于 HPLC检测
Trp产量。色谱条件如下,色谱仪为W aters 1525,色
谱柱为 Ag ilent 20RBAX SB-C18 ( 416 mm @ 150mm,
5 Lm),流动相为甲醇: 0102 mo l/L醋酸钠缓冲溶液
( pH415) = 30% B70%,流速为 016 mL /m in, 检测波长
为 280 nm,进样量为 10 LL[ 1 ]。
118 目的基因表达量的荧光定量 PCR检测
谷氨酸棒杆菌发酵培养至 16 h时取菌液提取
总 RNA,取 RNA 5 Lg, 用 DNA酶 I处理,去除 DNA,
用 Nucleosp in RNA C lean-up试剂盒纯化后, 取 RNA
500 ng,用 PrimeScr iptÓ RT reagent kit反转录试剂盒
合成 cDNA。上述方法可参照试剂盒说明书进行。
以谷氨酸棒杆菌 DnaE基因作为内参基因, 分别以
不同菌株 aroÒ、trpEGD的 cDNA为模板进行实时
定量 PCR检测 aroÒ、trpEGD基因的表达量。反应
体系: SYBR Prem ix ExTaqTM ( 2 @ ) 10 LL,上游引物
018 LL, 下游引物 018 LL, ROX Re ference DyeÒ
( 50 @ ) 012 LL, 模板 2 LL, 加水至 20 LL。反应程
序:使用两步 PCR法,预变性 95e , 30 s;变性 95e ,
5 s, 退火 /延伸 60e , 34 s, 40个循环, 其中 60e ,
34 s结束时间为荧光信号检测点。每个反应均做
3孔重复 [ 11, 12 ]。所用引物 (表 2)均由华大基因
合成。
表 2 荧光定量 PCR引物
基因 引物序列 ( 5cy 3c) 产物长度
( bp)
aroÒ 正向引物: AATAGGGGTGTGAGTTGGAC反向引物: CCTCAGGGGCAACAACGATT 199
trpEGD
正向引物: TAAGCCCAACGGGTCCTGTC
反向引物: ACGTCATCGTATTCACCCAC 194
D anE
正向引物: TCTCACGCCGCAGGTTAT
反向引物: TGTCGGCAATCAGAAAGG 140
2 结果与讨论
211 重组质粒的构建
21111 pEC-XK99E-aroÒ和 pEC-XK99E-TP-aroÒ
的构建 以 aroÒ-1、aroÒ-2为引物,从 aroÒ基因片
段与 pEC-XK99E的连接体系转化大肠杆菌 TOP10
感受态细胞后涂布的平板上 (已于 37e 恒温培养箱
中倒置培养 12- 14 h)挑单菌落进行菌落 PCR鉴
定, 能够扩增出与 aroÒ ( 1 401 bp)大小相符的条带
(图 1-A)。进一步将 PCR鉴定正确的菌落进行液
体培养并提质粒用 XbaÑ、SalÑ进行酶切鉴定, 双
酶切能够切出与 aroÒ基因大小相符的条带 (图 1-
B) , 表明 pEC-XK 99E-aro Ò已经构建好。 pEC-
XK99E-TP-aroÒ构建与筛选过程与之类似, 仅 PCR
鉴定的引物不同,为 aroÒ-2与 aroÒ-3(电泳图片未
列出 )。
M. DNA分子量标准; 1.菌落 PCR产物; 2.X baÑ、SalÑ双酶切
pEC-XK99E-aroÒ的产物; 3.未酶切 pEC-XK99E-aroÒ
图 1 pEC-XK99E-aroÒ的鉴定
21112 pEC-XK99E-trpEGD的构建 以 trpEGD-1、
trpEGD-2为引物, 从 trpEGD 基因片段与 pEC-
XK99E的连接体系转化的大肠杆菌 TOP10感受态
细胞后涂布的平板上 (已于 37e 恒温培养箱中倒置
培养 12- 14 h)挑单菌落进行菌落 PCR鉴定, 能够
扩增出与 trpEGD基因 ( 3 246 bp)大小相符的条带
(图 2-A )。进一步对 PCR鉴定正确的菌落进行液
体培养并提质粒用 E coRÑ、BamH Ñ进行酶切鉴
定,双酶切能够切出与 trpEGD基因大小相符的条
带 (图 2-B ) , 表 明 pEC-XK99E-trpEGD 已构 建
成功。
154
2011年第 5期 李智涛等:谷氨酸棒杆菌 aroÒ、trpEGD基因的过量表达及其对色氨酸合成的影响
M. DNA分子量标准; 1.菌落 PCR产物; 2. 未酶切 pEC-
XK99E-trpEGD; 3. E coRÑ、B amHÑ双酶切 pEC-XK99E-
trpEGD的产物
图 2 pEC-XK99E-trpEGD的鉴定
21113 pEC-XK99E-trpEGD-TP-aroÒ的构建 以 tr-
pEGD-1、trpEGD-2为引物, 从 trpEGD基因片段与
pEC-XK99E-TP-aroÒ的连接体系转化大肠杆菌
TOP10感受态细胞后涂布的平板上 (已于 37e 恒温
培养箱中倒置培养 12- 14 h)挑单菌落进行菌落
PCR鉴定, 能够扩增出与 trpEGD基因大小相符的
条带 (图 3-A )。对 PCR鉴定正确的菌落进行液体
培养并提质粒用于进行双酶切鉴定, 用 E coRÑ、
BamHÑ进行双酶切能够切出与 trpEGD基因大小
相符的条带, 用 BamH Ñ、SalÑ进行双酶切能够切
出与 TP-aroÒ大小相符的条带 (图 3-B ), 表明 pEC-
XK99E-trpEGD-TP-aroÒ已经构建成功 (图 4)。
M. DNA分子量标准; 1.菌落 PCR产物; 2. 未酶切 pEC-
XK99E-trpEGD-TP-aroÒ ; 31E coR Ñ、BamH Ñ 双酶切
pEC-XK99E-trpEGD-TP-aroÒ的产物; 4. BamHÑ、Sa lÑ
双酶切 pEC-XK99E-trpEGD-TP-aroÒ的产物
图 3 pEC-XK99E-trpEGD-TP-aroÒ的鉴定
图 4 trpEGD和 aroÒ基因串联表达载体的结构示意图
212 发酵试验
将上述各表达载体分别通过电激转化至谷氨酸
棒杆菌 SPT9感受态细胞得到菌株 SPT9-aroÒ、
SPT9-trpEGD、SPT9-trpEGD-TP-aroÒ。将这些菌株
连同出发菌株 SPT9一起进行发酵, 得到的发酵液
经 HPLC 检测, 菌株 SPT9、SPT9-aroÒ、SPT9-tr-
pEGD、SPT9-trpEGD-TP-aroÒ的 T rp的产量分别为
0143、0156、0153及 0179 g /L。菌株 SPT9-aroÒ、
SPT9-trpEGD、SPT9-trpEGD-TP-aroÒ的色氨酸产量
相对于出发菌株 SPT9分别提高了 30%、23% 和
84% (图 5)。
图 5 各过量表达菌株的色氨酸产量
从发酵产色氨酸的结果来看, 关键酶基因 aroÒ
和 trpEGD的过量表达对于色氨酸产量的提高是有
效的。 aroÒ和 trpEGD基因的串联过量表达使色氨
酸产量提高的幅度超过了 aroÒ和 trpEGD单独过量
155
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2011年第 5期
表达的简单加和,表明在色氨酸育种过程中,宏观考
虑整个代谢途径的畅通更有利于色氨酸产量的
提高。
213 目的基因表达量的荧光定量 PCR检测
以谷氨酸棒杆菌的 DnaE基因作为内参基因,
对菌株 SPT9-trpEGD-TP-aroÒ中 aroÒ和 trpEGD基
因的表达量进行荧光定量 PCR分析。结果显示,菌
株 SPT9-trpEGD-TP-aroÒ中 aroÒ和 trpEGD的表达
量分别为出发菌株 SPT9中对应基因表达量的 410
倍和 113倍 (图 6 ), 表明 aroÒ和 trpEGD基因串联
过量表达是有效的。
图 6 菌株 SPT9-trpEGD-TP-aroÒ中
aroÒ和 trpEGD基因的表达情况
在菌株 SPT9-trpEGD-TP-aroÒ中, 基因 trpEGD
与 aroÒ之间通过谷氨酸棒杆菌 SPT9基因组中 aro
Ò结构基因上游自带的终止子和启动子连接, 以使
trpEGD与 aroÒ分别进行转录和翻译。因此, 在菌
株 SPT9-trpEGD-TP-aroÒ中, aroÒ属于组成型表达;
而 trpEGD的表达是受载体 pEC-XK99E的启动子控
制、在 IPTG的诱导下进行的 [ 6]。可能正是由于表
达载体 pEC-XK99E-trpEGD-TP-aroÒ中 aroÒ和 tr-
pEGD基因的表达调控机制不同,造成了其表达量
差异较大。可以预测,改变表达载体或改进 trpEGD
与 aroÒ之间的连接方式和优化 IPTG添加的时间,
将有可能使基因 trpEGD与 aroÒ的表达到一个更合
适的比例和表达量从而进一步提高色氨酸的产量 [ 3]。
3 结论
应用大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭表达载体
pEC-XK99E在谷氨酸棒杆菌 SPT9中对色氨酸合成
途径中的关键酶基因 aroÒ、trpEGD分别进行了单
独过量表达和串联过量表达,分别得到菌株 SPT9-
aroÒ、SPT9-trpEGD、SPT9-trpEGD-TP-aroÒ。这些
菌株色氨酸产量较出发菌株 SPT9分别提高了
30%、23% 和 84% ; 经荧光定量 PCR检测, 菌株
SPT9-trpEGD-TP-aroÒ中 aroÒ、trpEGD基因的表达
量分别为出发菌株 SPT9的 410倍和 113倍。
这些结果表明,在色氨酸育种中,采用分子生物
学手段在菌株中过量表达关键酶基因是一种有效的
方法; aroÒ、trpEGD基因的串联过量表达使色氨酸
产量提高的幅度更大,其效果超过了 aroÒ、trpEGD
单独过量表达的简单加和, 暗示着色氨酸育种过程
中考虑整个代谢途径的畅通更重要;另外,表达载体
的调控特点、诱导剂的添加量和添加时间,以及多个
关键酶基因串联表达时它们之间的连接方式等都影
响着关键酶基因的表达比例和表达量,从而影响色
氨酸的产量,这也是采用分子生物学手段育种过程
中需要重点考虑的问题。
参 考 文 献
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2011年第 5期 李露莉等:不同碳源对解磷真菌溶解低品位磷矿能力的影响
图 4 Ca2+及M g2+相对浓度随培养时间的变化关系
传统的硫酸法生产磷肥依赖于中高品位磷矿和
硫资源,造成了低品位磷矿资源的浪费。利用微生
物溶解低品位磷矿粉,生产生物磷肥,尤其是筛选出
高效溶磷菌株,对合理利用中低品位磷矿、减少环境
污染、降低硫资源依赖和提高中国磷资源的可持续
利用性具有重要意义。
参 考 文 献
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