全 文 ：第９卷第１期
２０１１年１月
生　物　加　工　过　程
ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｐｒｏｃｅｓｓＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ．９Ｎｏ．１
Ｊａｎ．２０１１
ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７２－３６７８．２０１１．０１．０１２
收稿日期：２０１０－０９－０１
基金项目：国家高技术研究发展计划（８６３计划）资助项目（２００７ＡＡ０２Ｚ２２８）；天津市应用基础及前沿技术研究计划资助项目（０８ＪＣＺＤＪＣ１５４００）
作者简介：史建明（１９８４—），男，河北沧州人，硕士研究生，研究方向：发酵代谢控制；陈　宁（联系人），教授，博士生导师，Ｅｍａｉｌ：ｎｉｎｇｃｈ＠ｔｕｓｔ．ｅｄｕ．ｃｎ
谷氨酸棒杆菌 ＹＩＬＷ苏氨酸脱水酶基因的
克隆表达及酶学性质
史建明，徐兰兰，徐庆阳，谢希贤，陈　宁
（天津科技大学 生物工程学院 工业微生物教育部重点实验室，天津 ３００４５７）
摘　要：将 Ｌ 异亮氨酸生产菌谷氨酸棒杆菌（ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＹＩＬＷ）苏氨酸脱水酶（ｔｈｒｅｏｎｉｎｅｄｅ
ｈｙｄｒａｔａｓｅ，ＴＤ）的编码基因ｉｌｖＡ在大肠杆菌中进行异源表达及进行初步的酶学性质研究。分别以 Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ
ＡＴＣＣ１３０３２、ＹＩＬＷ的基因组ＤＮＡ为模板，利用 ＰＣＲ技术扩增出苏氨酸脱水酶的编码基因 ｉｌｖＡ，测序获得编码序
列。利用质粒ＰＥＴＨｉｓ将该基因在大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中进行重组表达、金属螯合纯化，对其酶学性质进行初步
研究。结果显示Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＹＩＬＷ编码基因序列与已报道的 ｉｌｖＡ序列相差５个碱基，相似度为９９６％，第３８３
位氨基酸由苯丙氨酸突变为缬氨酸。酶学性质研究表明：重组酶ＹｉｌｗＴＤ最适反应温度为３２℃，在２０～５５℃范围
内该酶较稳定，最适ｐＨ为６７，该酶底物专一性强，对最适底物苏氨酸的米氏常数Ｋｍ＝８３２ｍｍｏｌ／Ｌ，最大反应速
度Ｖｍａｘ＝３１８×１０
４Ｕ／ｍｇ，与野生型酶相比，突变（Ｆ３８３Ｖ）后可显著降低终产物对酶的反馈抑制作用。为揭示突变
对苏氨酸脱水酶活性的影响及进一步利用基因工程技术改造 Ｌ 异亮氨酸生产菌，提高 Ｌ 异亮氨酸产量奠定了
基础。
关键词：谷氨酸棒杆菌；酶学性质；表达；苏氨酸脱水酶
中图分类号：Ｑ８１２；Ｑ７８　　　　文献标志码：Ａ　　　　文章编号：１６７２－３６７８（２０１１）０１－００５５－０６
Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｅｎｚｙｍａｔｉｃｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆｔｈｒｅｏｎｉｎｅｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ
ｆｒｏｍＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＹＩＬＷ
ＳＨＩＪｉａｎｍｉｎｇ，ＸＵＬａｎｌａｎ，ＸＵＱｉｎｇｙａｎｇ，ＸＩＥＸｉｘｉａｎ，ＣＨＥＮＮｉｎｇ
（ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＩｎｄｕｓｔｒｉａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙｏｆｔｈｅＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＥｄｕｃａｔｉｏｎ，ＣｏｌｅｇｅｏｆＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，
ＴｉａｎｊｉｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｔｉａｎｊｉｎｇ３００４５７，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＴｈｅｔｈｒｅｏｎｉｎｅｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅｇｅｎｅｉｌｖＡｆｒｏｍＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＹＩＬＷｗａｓｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎ
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉａｎｄｔｈｅｅｎｚｙｍａｔｉｃｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｗｅｒｅｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ．ＴｈｅｔｗｏｉｌｖＡｇｅｎｅｓａｍｐｌｉｆｉｅｄｆｒｏｍｔｈｅ
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＹＩＬＷａｎｄＡＴＣＣ１３０３２ｇｅｎｏｍｅｂｙＰＣＲｗｉｔｈｓｐｅｃｉｆｉｃｐｒｉｍｅｒｓ，ｓｅｑｕｅｎｃｅｄａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｅｄａｔ
Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）ｂｙｕｓｉｎｇｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｐＥＴＨｉｓ．Ｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｔｈｒｅｏｎｉｎｅｄｅｈｙｄｒａｔｅｓｅｎｚｙｍｅｗａｓ
ｐｕｒｉｆｉｅｄｂｙｍｅｔａｌｃｈｅｌａｔｅｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙａｎｄｉｔｓｓｅｖｅｒａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｗｅｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ．Ａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅ
ａｌｉｇｎｍｅｎｔｏｆａｍｉｎｏａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，ｉｔｗａｓｆｏｕｎｄｔｈａｔｔｈｅｃｏｍｐａｒａｂｉｌｉｔｙｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｃｌｏｎｅｄｉｌｖＡｓｅｑｕｅｎｃｅ
ａｎｄｔｈｅｒｅｐｏｒｔｅｄｓｅｑｕｅｎｃｅｗａｓｕｐｔｏ９９６％．Ｏｎｌｙｔｈｅ３８３ｔｈａｍｉｎｏａｃｉｄＰｈｅｍｕｔａｔｅｄｔｏＶａｌ（Ｐｈｅ→Ｖａｌ），
ｔｈｅｏｔｈｅｒｓｗｅｒｅｎｏｔ．ＴｈｅｏｐｔｉｍａｌｐＨａｎｄｔｈｅｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｅｎｚｙｍｅＹｉｌｗＴＤｗｅｒｅｐＨ６７ａｎｄ
３２℃，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ＴｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｅｎｚｙｍｅＹｉｌｗＴＤｓｈｏｗｅｄｔｈｅｈｉｇｈｅｓｔａｃｔｉｖｉｔｙｔｏｗａｒｄｔｈｒｅｏｎｉｎｅ（Ｋｍ＝
８３２ｍｍｏｌ／Ｌ，Ｖｍａｘ＝３１８×１０
４Ｕ／ｍｇ，ａｔ３２℃）．Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅ，ｔｈｅｍｕｔａｔｉｏｎ（Ｆ３８３Ｖ）ｃｏｕｌｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ
ｒｅｄｕｃｅｔｈｅｅｎｄｐｒｏｄｕｃｔｆｅｅｄｂａｃｋｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆｔｈｅｅｎｚｙｍｅ．Ｔｈｅｅｎｚｙｍａｔｉｃｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆｔｈｒｅｏｎｉｎｅｄｅ
ｈｙｄｒａｔａｓｅｆｒｏｍＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＹＩＬＷｗｅｒｅｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄｆｏｒｐｒｏｖｉｄｉｎｇｔｈｅｆｕｎｄａｍｅｎｔｔｏｔｈｅｒｅｖｅａｌｉｎｇｔｈｅ
ｉｍｐａｃｔｏｆｍｕｔａｔｉｏｎｓｏｎｔｈｅｅｎｚｙｍｅａｎｄｉｎｃｒｅａｓｉｎｇＬｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ；ｅｎｚｙｍａｔｉｃｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ；ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；ｔｈｒｅｏｎｉｎｅｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ
　　Ｌ异亮氨酸是合成人体激素、酶类的原料，具
有促进蛋白质合成和抑制其分解的效果［１－２］，在人
体生命活动中起着重要作用，因此，在食品和医药
行业中具有广泛的应用及商业价值。
　　 苏 氨 酸 脱 水 酶 （ｔｈｒｅｏｎｉｎｅｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ，ＥＣ
４３１１９）是Ｌ异亮氨酸生物合成途径中第一个限
速酶，该酶可以可逆地催化底物Ｌ 苏氨酸生成α 酮
丁酸和氨。谷氨酸棒杆菌中的苏氨酸脱水酶是由相
同亚基组成的四聚体结构，单体相对分子质量约为
４６×１０４［３］。Ｌ苏氨酸依次经苏氨酸脱水酶、乙酰羟
酸合成酶、异构还原酶、二羟酸脱水酶及转氨酶Ｂ催
化而形成终产物Ｌ 异亮氨酸，在这些酶中只有苏氨
酸脱水酶是 Ｌ 异亮氨酸生物合成中具有特异性的
酶，其他４种酶也参与Ｌ缬氨酸和Ｌ亮氨酸的生物
合成。目前的研究结果表明，终产物Ｌ 异亮氨酸是
该酶的变构抑制因子，而Ｌ 缬氨酸则是其变构激活
因子［４－５］，由于该酶活性受到严格控制，成为微生物
体内Ｌ异亮氨酸过量生产的限制因素，因此苏氨酸
脱水酶是研究Ｌ异亮氨酸生物合成途径中代谢流的
主要对象。
　　近年来，随着重组 ＤＮＡ技术的日益完善，人们
可以通过解除反馈抑制的关键酶来提高目的产物
产率［６］，Ｓａｈｍ等［７］通过扩增对反馈调节不敏感的
高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶及苏氨酸脱水酶的
相应基因，获得谷氨酸棒杆菌的Ｌ异亮氨酸高产菌
株，产量可达３０ｇ／Ｌ。对实验室保藏的Ｌ异亮氨酸
生产菌Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＹＩＬＷ中苏氨酸脱水酶的酶
学性质和该酶调节区域突变对酶的反馈抑制的影
响进行研究，，为进一步改造 Ｌ 异亮氨酸生产菌谷
氨酸棒杆菌奠定基础。
１　材料与方法
１．１　材料
１．１．１　菌株和质粒
　　谷氨酸棒杆菌Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＡＴＣＣ１３０３２，Ｌ异亮
氨酸生产菌 Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＹＩＬＷ，大肠杆菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）
ＤＨ ５α，ＢＬ２１（ＤＥ３），质粒载体ｐＥＴ Ｈｉｓ为本实验室
保藏。质粒载体ｐＭＤ１８ Ｔ购于 ＴａＫａＲａ公司。
１．１．２　培养基
　　ＬＢ培养基（ｇ／Ｌ）：胰蛋白胨 １０，酵母浸出粉 ５，
ＮａＣｌ１０。ｐＨ７０～７２，抗生素使用质量浓度为１００
μｇ／ｍＬ的氨苄西林（Ａｍｐ）。
１．１．３　主要试剂和仪器
　　实验用限制性内切酶 ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄＩＩ和 Ｔ４
ＤＮＡ连接酶购于 ＴａＫａＲａ公司；乳酸脱氢酶、
ＮＡＤＨ、细菌基因组提取试剂盒、质粒快速提取试剂
盒，ＰＣＲ产物纯化试剂盒购于北京博迈德公司；考
马斯亮蓝蛋白测定试剂盒购于南京建成生物工程
研究所；Ｎｉ＋ＮＴＡ树脂购于 ＢＩＯＢＡＳＩＣ公司；其余
试剂均为国产分析纯。细胞超声破碎仪购于宁波
新芝生物科技股份有限公司；ＰＣＲ仪购于美国
ＢＩＯＲＡＤＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ。
１．２　分子克隆技术
　　根据 ＧｅｎＢａｎｋ上的谷氨酸棒杆菌（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉ
ｃｕｍ）ＡＴＣＣ１３０３２ｉｌｖＡ编码基因上下游序列设计简
并引物：上游：５′ＣＡＡＣＴＧＧＡＧＴＧＡＡＣＡＣＧＧＡＣ３′，
下游：５′ＧＡＧＣＡＣＧＧＣＧＡＧＡＡＣＴＧ３′，根据苏氨酸
脱水酶基因测序结果来设计用于构建重组质粒的
引物，上游：５′ＡＧＧＴＧＧＡＴＣＣＡＴＧＡＧＴＧＡＡＡＣＡＴ
ＡＣＧＴＧＴＣＴＧ３′（划线处为 ＢａｍＨⅠ酶切位点），下
游：５′ＧＣＡＡＡＧＣＴＴＣＧＡＴＣＣＴＧＡＣＣＣＧＡＡＡＣＴＡＧ３′，
（划线处为ＨｉｎｄⅢ酶切位点）。ＰＣＲ反应条件：９４℃
３ｍｉｎ，９４℃１ｍｉｎ，５５℃ １ｍｉｎ，７２℃ １５ｍｉｎ，３０个
循环，７２℃ １０ｍｉｎ。细菌基因组提取、ＤＮＡ片段回
收、酶切、纯化、与载体连接及转化等操作参见参考文
献［８］。
１．３　苏氨酸脱水酶的表达
１．３．１　苏氨酸脱水酶基因的克隆与测序
　　取ＰＣＲ产物５μＬ在１０％琼脂糖凝胶中进行
电泳检测。使用ＤＮＡ凝胶回收试剂盒回收 ＰＣＲ反
应产物，直接与ｐＭＤ１８ Ｔ载体连接，连接产物转化
ＥｃｏｌｉＤＨ ５α感受态，在含 ＩＰＴＧ（２４ｍｇ／ｍＬ）和
Ｘ ｇａｌ（２０ｍｇ／ｍＬ）的Ａｍｐ抗性ＬＢ平板上３７℃培
养１６ｈ，随机挑选白色菌落进行 ＰＣＲ，对阳性重组
６５ 生　物　加　工　过　程　　 第９卷　
质粒进行测序和序列分析。质粒分别命名为 ｐＭＤ
ｉｌｖＡ（Ｗ）、ｐＭＤｉｌｖＡ（Ｓ）（Ｗ为野生型菌株，Ｓ为生产
菌株）。
１．３．２　苏氨酸脱水酶基因表达载体的构建
　　使用ＢａｍＨⅠ和 ＨｉｎｄⅢ对ｉｌｖＡ基因ＰＣＲ产物
及质粒 ｐＥＴＨｉｓ分别进行双酶切，将酶切回收片段
进行连接，得到重组质粒 ｐＥＴｉｌｖＡ（Ｗ）和 ｐＥＴｉｌｖＡ
（Ｓ），化学法转化 Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ ５α感受态细胞，在含
Ａｍｐ抗性的 ＬＢ平板上３７℃培养，提取质粒进行双
酶切验证，将阳性质粒转化 Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）得到
重组工程菌。
１．３．３　重组菌株的诱导表达
　　取单菌落接种于含有氨苄西林１００μｇ／ｍＬ的ＬＢ
培养液的试管中，３７℃下２００ｒ／ｍｉｎ培养过夜；以１％
接种量接种于含有３０ｍＬＬＢ培养液的５００ｍＬ三角
瓶中，３７℃下２００ｒ／ｍｉｎ培养至Ａ６００＝０６～０８，加入
００５ｍｍｏｌ／Ｌ（终浓度）ＩＰＴＧ，在３０℃、１５０ｒ／ｍｉｎ条件
下诱导４ｈ，取适量菌液进行 ＳＤＳＰＡＧＥ蛋白电泳
分析。
１．４　重组苏氨酸脱水酶的纯化及蛋白定量
　　重组酶的纯化方法见参考文献［８］，对纯化蛋
白进行透析，加入５０％甘油保存于－２０℃冰箱以用
于后续实验。
　　纯化后的蛋白浓度采用南京建成生物工程研
究所考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒测定。
１．５　重组苏氨酸脱水酶的标准酶活测定条件
　　反应体系为０１ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ６７磷酸盐缓冲液
（ＰＢＳ），３０μｍｏｌ／Ｌ磷酸吡哆醛，一定浓度的底物及
适量纯化重组酶，催化温度３２℃，反应时间２ｍｉｎ。
加入４０μＬ３６％三氯乙酸终止反应，冰浴１０ｍｉｎ。
加入 ４０μＬＴｒｉｓ（２ｍｏｌ／Ｌ），３５μＬ还原型辅酶Ⅰ
ＮＡＤＨ（４ｍｍｏｌ／Ｌ），８０μＬ双蒸水，５μＬ乳酸脱氢酶
（８Ｕ），３０℃水浴保温１５ｍｉｎ，于３４０ｎｍ测定吸光
度，ＮＡＤＨ吸光度的下降速率与产物α 酮丁酸生成
量成正比［９］。
　　酶活单位定义：在标准酶活测定条件下，１ｍｉｎ
８００μＬ反应体系使 Ａ３４０值降低００１所需酶量为一
个酶活单位。
１．６　酶学性质研究
１．６．１　最适酶促反应温度及ｐＨ测定
　　反应体系中底物苏氨酸浓度为 ３０ｍｍｏｌ／Ｌ，
在２０～８０℃区间，按标准酶活测定方法测定酶活。ｐＨ
梯度选定为５～１１。将最高酶活设定为１００％。
１．６．２　热稳定性及ｐＨ稳定性测定
　　热稳定性实验将重组酶置于各温度梯度保温
３０ｍｉｎ，按标准酶活测定方法测定酶活，ｐＨ稳定性
实验中将重组酶置于不同ｐＨ的ＰＢＳ缓冲液中冰浴
３０ｍｉｎ，按标准酶活测定方法测定酶活。将残余酶
活的最高点设定为１００％。
１．６．３　酶促动力学参数测定
　　为测定重组苏氨酸脱水酶对底物 Ｌ 苏氨酸的
动力学参数，以Ｌ苏氨酸浓度范围５～５０ｍｍｏｌ／Ｌ，
按标准酶活测定方法测定酶活，利用双倒数作图法
计算Ｋｍ和Ｖｍａｘ值。
１．６．４　底物特异性测定
　　酶促反应体系中分别加入３０ｍｍｏｌ／ＬＬ 谷氨
酸、Ｌ天冬氨酸（酸性）、Ｌ 亮氨酸（中性）、Ｌ 丝氨
酸（含羟基）、Ｌ色氨酸（芳香族），按标准酶活测定
方法测定酶活。以Ｌ苏氨酸为底物时的酶活力
为１００％。
１．６．５　终产物对重组酶活性反馈抑制的测定
　　 反应体系中底物 Ｌ 苏氨酸的浓度为
３０ｍｍｏｌ／Ｌ，在反应体系中加入不同浓度的终产物
Ｌ异亮氨酸，按标准酶活测定方法测定酶活。以未
添加Ｌ异亮氨酸时的酶活力为１００％。
２　结果与讨论
２．１　谷氨酸棒杆菌苏氨酸脱水酶基因的克隆及重
组子ｐＥＴｉｌｖＡ的鉴定
　　分别以提取的 Ｌ 异亮氨酸生产菌 Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉ
ｃｕｍＹＩＬＷ及 Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＡＴＣＣ１３０３２的基因组
ＤＮＡ为模板，采用简并引物扩增出一条约１５ｋｂ大
小的ＤＮＡ片段，ＰＣＲ反应产物与ｐＭＤ１８ Ｔ载体连
接，转化 Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ ５α感受态，在含有 ＩＰＴＧ（２４
ｍｇ／ｍＬ）和Ｘｇａｌ（２０ｍｇ／ｍＬ）的 Ａｍｐ抗性 ＬＢ平板
上３７℃培养 １６ｈ，蓝白斑筛选获得阳性重组子
ｐＭＤｉｌｖＡ（Ｗ）和ｐＭＤｉｌｖＡ（Ｓ），并对其进行测序，将
目的基因连接质粒ｐＥＴＨｉｓ，化学法转化Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１
（ＤＥ３），抗性筛选得到重组子 ｐＥＴｉｌｖＡ（Ｗ）和 ｐＥＴ
ｉｌｖＡ（Ｓ）。对重组质粒单、双酶切验证，显示重组质
粒ｐＥＴｉｌｖＡ构建正确，结果如图１所示。由图１可
知：重组质粒ｐＥＴｉｌｖＡ经ＨｉｎｄⅢ单酶切后得到一条
大小约为 ４５００ｂｐ的特异性条带，经 ＢａｍＨⅠ和
ＨｉｎｄⅢ双酶切后得到两条特异性条带，大小分别约
为３０００ｂｐ和１４００ｂｐ，以ｐＥＴｉｌｖＡ为模板，使用引
物Ｐ３，Ｐ４进行扩增，可得到大小约１４００ｂｐ的特异
７５　第１期 史建明等：谷氨酸棒杆菌ＹＩＬＷ苏氨酸脱水酶基因的克隆表达及酶学性质
性条带；质粒ｐＥＴＨｉｓ经ＨｉｎＤⅢ单酶切后得到一条
大小约为３０００ｂｐ的特异性条带，从而证明重组质
粒ｐＥＴｉｌｖＡ构建正确。
Ｍ—１ｋｂＤＮＡｍａｒｋｅｒ；
１—质粒ｐＥＴＨｉｓＨｉｎｄⅢ单酶切；
２—质粒ｐＥＴｉｌｖＡＨｉｎｄⅢ单酶切；
３—质粒ｐＥＴｉｌｖＡＢａｍＨⅠ＋ＨｉｎｄⅢ双酶切；
４—ｉｌｖＡ的ＰＣＲ产物
图１　重组质粒ｐＥＴｉｌｖＡ的酶切验证
Ｆｉｇ．１　ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｐＥＴｉｌｖＡ
ｂｙｄｉｇｅｓｔｉｏｎｗｉｔｈＢａｍＨⅠ ａｎｄＨｉｎｄⅢ
２．２　苏氨酸脱水酶基因序列的分析
　　对重组子 ｐＭＤｉｌｖＡ（Ｓ）的插入片段进行测序，
苏氨酸脱水酶基因序列分析显示，该片段全长为
１３１１ｂｐ，包含一个开放阅读框（ＯＲＦ），与谷氨酸棒
杆菌模式菌ＡＴＣＣ１３０３２的ｉｌｖＡ基因高度同源，核苷
酸相似度为 ９９６％，存在 ５个碱基差异，其中第
１１４７位碱基突变（Ｔ→Ｇ）导致了编码氨基酸的变
化，第 ３８３位氨基酸由苯丙氨酸变为缬氨酸
（Ｆ３８３Ｖ），其他核苷酸碱基的差异均导致了氨基酸
残基的同义突变。推测此 ＯＲＦ区编码４３６个氨基
酸，其编码的多肽链相对分子质量约为４６×１０４。
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＹＩＬＷ的ｉｌｖＡ基因的核酸序列已提交
ＧｅｎＢａｎｋ登记，登录号为：ＧＵ４５７４０８。
　　在谷氨酸棒杆菌的苏氨酸脱水酶分子中，第１～
３５７位氨基酸残基组成其活性区域，第３５８～４３６位
氨基酸残基构成其调节区域［１０］，对编码氨基酸序列
的分析可知，Ｌ 异亮氨酸生产菌 Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ
ＹＩＬＷ的突变位点，即第３８３位氨基酸位于苏氨酸
脱水酶的调节区域内（图２）。
２．３　重组菌株的诱导表达和表达产物分析
　　将重组工程菌 Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）经 ０．０５
ｍｍｏｌ／Ｌ（终浓度）ＩＰＴＧ诱导４ｈ后，离心收集菌体，
进行超声破碎，取破碎上清液采用Ｎｉ柱纯化得到目
图２　苏氨酸脱水酶单个亚基三级结构模型
Ｆｉｇ．２　Ｔｅｒｔｉａｒｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅｍｏｄｅｌｏｆｓｕｂｕｎｉｔ
ｏｆｔｈｒｅｏｎｉｎｅｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ
的蛋白，将菌液和纯化蛋白进行 ＳＤＳＰＡＧＥ蛋白电
泳分析，结果如图３所示。由图３可知：重组菌在相
对分子质量约为４６×１０４处有特异性蛋白条带，与
理论推测的相对分子质量相符，表明载体构建正
确，ｉｌｖＡ基因在 ＢＬ２１（ＤＥ３）中得到表达，通过比较
破碎沉淀和破碎上清液可知，目的蛋白主要存在于
破碎上清液中，且以可溶的活性蛋白形式存在。
Ｍ—Ｐｒｏｔｅｉｎｍａｒｋｅｒ；１—Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１；
２—ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴｉｌｖＡ；
３—ＩＰＴＧ诱导的ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴｉｌｖＡ；
４—含ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴｉｌｖＡ的破碎沉淀混合物；
５—破碎上清液；６—纯化后的蛋白
图３　ＳＤＳＰＡＧＥ分析重组苏氨酸脱水酶的表达
Ｆｉｇ．３　ＳＤＳＰＡＧＥａｎａｌｙｓｉｓｏｆｅｘｐｒｅｓｓｅｄＹｉｌｗＴＤ
２．４　重组苏氨酸脱水酶（ＹｉｌｗＴＤ）的酶学性质
２．４．１　酶的最适反应 ｐＨ、温度与 ｐＨ稳定性、热稳
定性
　　底物 Ｌ 苏氨酸浓度为 ３０ｍｍｏｌ／Ｌ，按方法
１．６．１测得重组酶ＹｉｌｗＴＤ的最适反应ｐＨ，结果见图
４。由图４可知：重组酶 ＹｉｌｗＴＤ的最适反应 ｐＨ为
８５ 生　物　加　工　过　程　　 第９卷　
６７；在ｐＨ稳定性方面，发现该酶在中性偏碱的条
件下稳定性较好，在ｐＨ为６～１１的条件下保温３０
ｍｉｎ仍具有６０％以上酶活力。
图４　ｐＨ对重组苏氨酸脱水酶ＹｉｌｗＴＤ活性的影响
Ｆｉｇ．４　ＥｆｅｃｔｓｏｆｐＨｏｎｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｔｈｒｅｏｎｉｎｅ
ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅＹｉｌｗＴＤａｃｔｉｖｉｔｙ
　　在ｐＨ６７条件下，不同温度测定的酶活力结果
见图５。由图５可知：重组酶 ＹｉｌｗＴＤ具有较宽的反
应温度范围，最适反应温度为３２℃。温度稳定性方
面，在２０～５０℃范围内可维持７０％以上酶活，温度
在５０℃以上，酶活力迅速下降，至８０℃时酶活力完
全丧失。
图５　温度对重组苏氨酸脱水酶ＹｉｌｗＴＤ活性的影响
Ｆｉｇ．５　Ｅｆｅｃｔｓｏｆｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｏｎｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ
ｔｈｒｅｏｎｉｎｅｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅＹｉｌｗＴＤａｃｔｉｖｉｔｙ
２．４．２　酶促动力学参数测定
　　底物Ｌ苏氨酸浓度范围为５～５０ｍｍｏｌ／Ｌ，加入
酶量为０７３μｇ，将反应速率和底物浓度求倒数，利用
双倒数作图法求得重组酶 ＹｉｌｗＴＤ的酶促动力学参
数，结果如图６所示。由图６可知：经计算获得的重
组酶ＹｉｌｗＴＤ对底物Ｌ 苏氨酸的米氏常数：Ｋｍ＝８３２
ｍｍｏｌ／Ｌ，最大反应速率：ｖｍａｘ＝３１８×１０
４Ｕ／ｍｇ。
２．４．３　重组酶底物的特异性
　　以 Ｌ 苏氨酸为底物时的催化活性设定为
图６　ＬｉｎｅｗｅａｖｅｒＢｕｋｅ作图法计算
重组酶ＹｉｌｗＴＤ酶促动力学参数
Ｆｉｇ．６　ＬｉｎｅｗｅａｖｅｒＢｕｒｋｅｐｌｏｔｏｆＹｉｌｗＴＤ
ｗｉｔｈｔｈｒｅｏｎｉｎｅａｓｓｕｂｓｔｒａｔｅ
１００％，在标准酶活测定条件下，分别考察重组酶
ＹｉｌｗＴＤ及野生型酶对酸性氨基酸 Ｌ 谷氨酸、Ｌ 天
冬氨酸，中性氨基酸Ｌ亮氨酸，含羟基氨基酸Ｌ丝
氨酸，芳香族氨基酸Ｌ 色氨酸的催化活性，结果如
表１所示。由表１可知：苏氨酸脱水酶对底物的专
一性较强，突变（Ｆ３８３Ｖ）对酶底物专一性影响较小，
只有以Ｌ丝氨酸为底物时，重组酶 ＹｉｌｗＴＤ及野生
型酶的酶活力可达到５０％以上，对其他几种底物的
酶活力均低于１３％，其中以Ｌ天冬氨酸为底物时均
没有检测到酮酸类产物的生成。
表１　Ｌ 苏氨酸脱水酶对底物的特异性
Ｔａｂｌｅ１　Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙｏｆｔｈｒｅｏｎｉｎｅｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ
底物
相对活性／％
野生型酶 重组酶ＹｉｌｗＴＤ
Ｌ苏氨酸 １００ １００
Ｌ丝氨酸 ５３４±１９ ５０９±１８
Ｌ谷氨酸 １２５±０４ １１４±０３
Ｌ亮氨酸 １１２±０３ １２２±０３
Ｌ色氨酸 ８９±０２ １００±０２
Ｌ天冬氨酸 ０ ０
２．４．４　Ｌ异亮氨酸对重组酶的反馈抑制作用
　　 反应体系中底物 Ｌ 苏氨酸的浓度为
３０ｍｍｏｌ／Ｌ，加入不同浓度的终产物Ｌ异亮氨酸，再
分别加入０７３μｇ的重组酶ＹｉｌｗＴＤ及野生型酶，按
标准酶活测定方法测定酶活，结果如图７所示。
　　由图７可知：加入低浓度 Ｌ 异亮氨酸时，不但
对酶没有抑制作用，反而有一定的激活作用，当 Ｌ
异亮氨酸浓度小于０６ｍｍｏｌ／Ｌ时，野生型酶和重组
酶ＹｉｌｗＴＤ的最大活力分别为１２０％、１３５％。对于野
生型酶而言，随着Ｌ 异亮氨酸浓度的增加，酶活力
９５　第１期 史建明等：谷氨酸棒杆菌ＹＩＬＷ苏氨酸脱水酶基因的克隆表达及酶学性质
图７　Ｌ 异亮氨酸浓度对重组酶活力的影响
Ｆｉｇ．７　ＥｆｅｃｔｓｏｆＬｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｎｔｈｅ
ａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｔｈｒｅｏｎｉｎｅｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅｉｎｖｉｔｒｏ
呈线性下降趋势，Ｌ 异亮氨酸浓度达到８ｍｍｏｌ／Ｌ
时，其酶活力完全丧失；而此时重组酶 ＹｉｌｗＴＤ仍剩
余６５％的活力。进一步增加 Ｌ 异亮氨酸浓度，重
组酶ＹｉｌｗＴＤ活力缓慢降低，当Ｌ异亮氨酸浓度达到
４５ｍｍｏｌ／Ｌ时，重组酶 ＹｉｌｗＴＤ活力完全丧失，表明
该突变（Ｆ３８３Ｖ）可以显著降低终产物 Ｌ 异亮氨酸
对苏氨酸脱水酶的反馈抑制作用。
　　基于变构酶的齐变模型原理［１１－１３］，终产物Ｌ异
亮氨酸和变构部位结合可以使苏氨酸脱水酶的Ｒ状
态和Ｔ状态这２种构象状态之间的平衡发生移动，使
酶的构象发生改变，从而影响催化部位的活性。同时
Ｍｏｒｂａｃｈ等［１４］对Ｈ２７８Ａ Ｌ３５１Ｓ、Ｄ３７８Ｇ、Ｖ３２３Ａ３种
突变酶的酶学性质进行了研究，结果表明３种突变均
可减弱终产物对酶的反馈抑制作用，其中 Ｈ２７８Ａ
Ｌ３５１Ｓ的双突变减弱作用最明显［１５］，而此突变位点位
于酶的活性区域。因此，对于突变如何改变酶结构及
如何影响抑制剂与调解中心的共价结合等问题，仍需
做进一步的研究。
３　结　论
　　１）应用ＰＣＲ技术从Ｌ异亮氨酸生产菌Ｃ．ｇｌｕ
ｔａｍｉｃｕｍＹＩＬＷ中扩增出苏氨酸脱水酶的编码基因
ｉｌｖＡ及其上游的部分序列，基因序列分析表明，与
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＡＴＣＣ１３０３２的 ｉｌｖＡ基因高度同源，核
苷酸相似性为９９６％，编码氨基酸残基序列高度保
守，仅是位于调节区域的３８３位苯丙氨酸突变为缬
氨酸，其余氨基酸残基一致。
　　２）在体外对重组酶的酶学特征进行研究，获得
了该酶的最适反应温度、热稳定性，最适反应 ｐＨ、
ｐＨ稳定性等酶学参数，并测定了重组酶对最适底物
苏氨酸的酶促动力学参数。
　　３）通过比较终产物 Ｌ 异亮氨酸对野生型酶和
重组酶ＹｉｌｗＴＤ的抑制作用，表明位于苏氨酸脱水酶
调节区域的突变（Ｐｈｅ→Ｖａｌ）可以显著降低终产物
Ｌ异亮氨酸对苏氨酸脱水酶的反馈抑制作用。
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０６ 生　物　加　工　过　程　　 第９卷