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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第11期
还 原 性 谷 胱 甘 肽（reduced glutathione，GSH）
是由谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸脱水缩合形成的
一种含有巯基的活性三肽，广泛存在于动植物细
胞中。GSH 具有多种生物学活性 ：作为抗氧化剂，
GSH 保护酶和其它蛋白质的巯基免受氧化［1，2］；促
进易代谢的低毒化合物形成，对部分外源毒性物质
具有解毒作用［3］；治疗肝损伤及抗衰老作用等［4，5］。
基于 GSH 所具有的上述生物学活性，其在临床医
学［6］、食品添加剂和运动营养学等行业的需求不断
增加，具有广阔的市场前景。
目前 GSH 的生产方法主要有萃取法、化学合
收稿日期 ：2013-04-27
作者简介 ：王硕，男，硕士，研究方向 ：发酵法生产还原型谷胱甘肽 ；E-mail ：shuowang87@126.com
通讯作者 ：张惠文，女，研究员，博士生导师，研究方向 ：资源微生物 ；E-mail ：hwzhang@iae.ac.cn
还原型谷胱甘肽发酵及分离纯化条件的优化
王硕1  谢跃武1  张惠文2  阎浩林1  徐明恺2 
（1. 沈阳药科大学，沈阳 110016 ；2. 中国科学院沈阳应用生态研究所 森林与土壤生态国家重点实验室，沈阳 110064）
摘 要 ： 旨在通过优化还原型谷胱甘肽的发酵及分离纯化条件，为 GSH 大规模的工厂化生产提供理论基础。首先通过筛选
获得一株 GSH 高产菌酿酒酵母 Y18，其胞内 GSH 含量为 9.05 mg/g 干菌体。进一步研究表明，在培养基中添加 L-半胱氨酸和缬氨酸，
以及发酵过程中补加葡萄糖可使 GSH 的总产量分别提高 62.0% 和 146.1%。此外，对 GSH 在水溶液中稳定性的研究发现偏酸性环
境（pH4.5）和氮气保护可显著降低 GSH 的损失率。最终通过对大孔树脂 D001×7 和 Sephadex G-10 的分离纯化条件的优化，获得
纯度为 98.1% 的 GSH，收率为 73.2%。
关键词 ： 酿酒酵母 还原型谷胱甘肽 发酵 分离纯化
Optimization Conditions of Fermentation and Separation and
Purification of Reduced-Glutathione
Wang Shuo1 Xie Yuewu1 Zhang Huiwen2 Yan Haolin1 Xu Mingkai2
（1. Shenyang Pharmaceutical University，Shenyang 110016 ；2. State Key Laboratory of Forest and Soil Ecology，Institute of Applied
Ecology，Chinese Academy of Sciences，Shenyang 110064）
Abstract:  The aim of the study is to provide theoretical basis in GSH large-scale production, by optimizing the conditions of its
fermentation and purification. Firstly, a GSH high-yield Saccharomyces cerevisiae Y18 was obtained, with the production of 9.05 mg GSH per
gram dry cells. Secondly, our results indicated that adding L-cysteine and Valine to the medium, or additional glucose during fermentation
process could increase GSH production by 62.0% and 146.1%, respectively. Moreover, the weak acidity condition（pH4.5）and nitrogen input
protected GSH from oxidation, and improved its stability. Finally, we obtained high-purity（98.1%）GSH and a promising recovery（73.2%）
after optimizing the conditions for separation and purification GSH in Macroporous resin D001×7 and Sephadex G-10 gel chromatography.
Key words:  Saccharomyces cerevisiae Reduced glutathione Fermentation Separation and purification
成法、酶法和发酵法，其中发酵法是生产 GSH 的主
要方法，而酿酒酵母［7］和产朊假丝酵母是工业生产
GSH 最常用的生产菌，若经过紫外诱变，氯化锌抗
性突变等处理，GSH 产量可提高一倍［8］。通常以热
水抽提法或乙醇提取法初提 GSH，能使细胞破壁率
达 95%［10］。而进一步分离纯化 GSH 的方法包括铜
盐法，双水相法和树脂法。其中树脂法以条件温和、
成本低，成为分离纯化 GSH 的主要方法［11，12］。但
树脂法目前仍然存在产品纯度不高，收率低等问题，
因此有必要进一步对树脂法的过程进行完善，为
GSH 大规模的纯化提供理论基础。
2013年第11期 181王硕等 ：还原型谷胱甘肽发酵及分离纯化条件的优化
本研究从优化发酵条件、提高 GSH 溶液稳定性
和探索合适的分离纯化条件 3 个方面对 GSH 的生产
过程进行系统的研究，旨在为 GSH 大规模的工厂化
生产提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种及培养基 菌种 ：酿酒酵母 Y12 ；酿酒
酵母 Y18 ；酿酒酵母 Y35 ；酿酒酵母 Y235 ；酿酒酵
母 Y239 ；产朊假丝酵母 Y54 ；产朊假丝酵母 Y90 ；
热带假丝酵母 Y20。以上菌种均来自中国科学院沈
阳应用生态研究所菌种保藏室。
YEPD 发酵培养基（g/L）：葡萄糖 20，蛋白胨
20，酵母粉 6，MgSO4·7H2O 3，K2HPO4 3，KH2PO4
3，（NH4）2HPO4 3，蒸馏水 1 L，pH 自然，115℃饱
和蒸汽灭菌 20 min。
1.1.2 主要试剂 GSH 标准品购自 Sangon 公司 ；L-
半胱氨酸购自北京化工厂北京试剂公司 ；葡萄糖购
自天津市大茂化学试剂厂 ；四氧嘧啶购自 Biotopped
公司 ；碳酸氢铵购自天津市博迪化工有限公司 ；大
孔树脂 D001×7 购自宏大化学试剂化工仪器厂 ；
Sephadex G-10 购自 Solarbio 公司。
1.1.3 仪器 电子分析天平购自梅特勒 -托利多仪器
（上海）有限公司 ；PerkinElmer Lambda25 UV/VIS 购
自 PerkinElmer 公司 ；10 L 发酵罐购自上海国强生
化工程装备有限公司，5804R 离心机购自 Eppendorf
centrifuge 公司，旋转蒸发仪购自 EYELA JAPAN 公司；
3.5 cm×50 cm 层析柱购自上海锦华层析设备厂。
1.2 方法
1.2.1 GSH 高产菌株的筛选 将 8 株酵母菌分别接
种于 YEPD 平板活化 ；挑取单菌落接种于 YEPD 液
体培养基，30℃培养过夜 ；次日以 1% 的接种量接
种于 500 mL 摇瓶培养基，30℃、180 r/min 的条件下
培养 32 h。超声波破壁，以四氧嘧啶法［13］测定各
菌株 GSH 胞内含量（以细胞干重为基准，mg/g）。
1.2.2 氨基酸对 GSH 产量的影响 向发酵培养基中
分别添加终浓度为 7.4 mmol/L［8］谷氨酸、L-半胱氨酸、
甘氨酸、丙氨酸、精氨酸、胱氨酸、赖氨酸、丝氨
酸和缬氨酸。以 1% 的接种量将经过活化的酿酒酵
母 Y18 接种于上述摇瓶培养基中，30℃、180 r/min
条件下培养 32 h。超声波破壁，测定各菌株 GSH 胞
内含量（以细胞干重为基准，mg/g）。
1.2.3 补加葡萄糖对 GSH 产量的影响 以 10 L 发
酵罐生产 GSH。发酵条件为 ：转速 180 r/min，罐内
压 0.3 MPa，溶氧量 10%。监测发酵液内葡萄糖含量
变化，当葡萄糖含量低于 0.15% 时，开始补加葡萄
糖并维持葡萄糖含量在 0.15%。每隔 2 h 记录发酵液
中葡萄糖含量、菌体含量和 GSH 胞内浓度，研究菌
体含量和 GSH 胞内浓度随时间变化的规律。
1.2.4 pH 对 GSH 稳定性的影响 取 200 mL 烧杯，
分为 10 组，每组 3 个重复。向每个烧杯中加入 50
mL 菌体抽提液，调节抽提液 pH，第一组 pH2.0，
其他各组依次增加 0.5 个 pH，于 4℃冰箱放置 24 h，
测定 GSH 含量。
1.2.5 氮气对 GSH 稳定性的影响 将 100 mL 玻璃
瓶分为 5 组，每组 3 个重复，分别加入菌体抽提液
30 mL，对照组不做氮气保护，其余 4 组依次以 0.1
mL/min，0.5 mL/min，1.0 mL/min 和 2.0 mL/min 的充
气量向溶液中充入氮气 2 min。于 4℃冰箱放置 24 h，
测定 GSH 含量。
1.2.6 pH 对大孔树脂 D001×7 吸附 GSH 的影响
取经过预处理的大孔树脂 10 g，置于 500 mL 锥形瓶。
调节菌体抽提液的 pH，第一组 pH2.0，其余各组依
次增加 0.5 个 pH，分别取抽提液 100 mL 置于锥形
瓶中，静置。每隔 20 min 测定抽提液中 GSH 的含量
直到 GSH 含量不再变化。
1.2.7 上柱流速对大孔树脂 D001×7 吸附 GSH 的影
响 大孔树脂 D001×7 的柱条件为 ：层析柱内径 3
cm，填料高度 15 cm，2 倍柱体积 pH4.5 的 PBS 平
衡。分别取提取液 100 mL，依次以 0.5 mL/min、1.0
mL/min、2.0 mL/min、3.0 mL/min 和 4.0 mL/min 的流
速进行上柱吸附，洗脱后测定不同流速下 GSH 的
收率。
1.2.8 洗脱液浓度对大孔树脂 D001×7 纯化 GSH 的
影响 将上柱经超纯水除杂的树脂平均分成 18 份。
依次以 50 mL 浓度为 0.05、0.1、0.2、0.3、0.4 和 0.5
mol/L 的碳酸氢铵溶液洗脱，测定各收集液中 GSH
含量，计算各组分的 GSH 收率。
1.2.9 水浴温度对 GSH 真空干燥收率的影响 配置
浓度为 300 μmol/L 的 GSH 溶液，取溶液 50 mL，分
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第11期182
别在水浴温度 60℃、65℃、70℃、75℃和 80℃，真
空度 -0.09--0.098 MPa 的条件下真空干燥，记录干
燥所需时间。将样品溶于 50 mL 超纯水，在 305 nm
处测定各组分 GSH 的吸光度，计算 GSH 含量。
1.2.10 洗 脱 液 流 速 对 Sephadex G-10 纯 化 GSH 的
影响 浓缩经大孔树脂处理的收集液至 4 mL。上
Sephadex G-10 凝胶层析柱。层析柱条件为 ：内径 1.0
cm，填料高度 45 cm，上样流速 0.5 mL/min。超纯
水洗脱，洗脱流速依次为 0.3、0.5、0.8、1.0 和 1.5
mL/min。测定收集液中 GSH 的收率，Bradford 法测
量蛋白含量。
2 结果
2.1 筛选GSH高产菌株
对 8 株酵母菌生产 GSH 的能力进行筛选的结果
（表 1）显示，酿酒酵母 Y18 的菌株 GSH 生产能力
明显高于其它菌株，总产量为 33.22 mg/L。所以确
定以酿酒酵母 Y18 作为 GSH 的生产菌株，进一步展
开 GSH 发酵及分离纯化条件的优化研究。
表 1 不同酵母菌的 GSH 产量
菌株
细胞干重
（g/L）
GSH 胞内浓度
（mg/g 干细胞）
GSH 总产量
（mg/L）
酿酒酵母 Y18 3.67±0.21 9.05±0.14 33.22±0.78
酿酒酵母 Y12 3.93±0.29 7.83±0.34 30.69±0.84
酿酒酵母 Y35 3.18±0.18 7.71±0.27 24.05±1.76
酿酒酵母 Y235 2.87±0.19 8.48±0.19 24.42±0.67
酿酒酵母 Y239 2.45±0.23 8.25±0.28 20.17±1.53
产朊假丝酵母 Y54 2.24±0.17 7.84±0.18 17.42±0.83
产朊假丝酵母 Y90 3.08±0.18 7.20±0.19 22.30±0.23
热带假丝酵母 Y20 3.91±0.17 5.09±0.39 19.59±1.89
2.2 氨基酸对GSH产量的影响
2.2.1 前体氨基酸对 GSH 产量的影响 如表 2 所示，
3 种前体氨基酸均促进 GSH 的合成。其中，L-半胱
氨酸对酵母菌的生长有微弱的抑制作用，但大幅度
提高 GSH 的胞内浓度，GSH 总产量最高，为 40.24
mg/L。与对照组相比，GSH 总产量提高 22.6%。
表 2 前体氨基酸对 GSH 产量的影响
前体氨基酸种类
细胞干重
（g/L）
GSH 胞内浓度
（mg/g 干细胞）
GSH 总产量
（mg/L）
不加氨基酸 3.55±0.30 9.25±0.36 32.83±2.01
谷氨酸 3.29±0.16 10.34±0.81 33.95±1.11
L-半胱氨酸 3.36±0.09 11.97±0.54 40.24±0.82
甘氨酸 3.84±0.23 9.97±1.39 38.06±3.18
2.2.2 非前体氨基酸对 GSH 产量的影响 如表 3 所
示，与对照组相比，丙氨酸、精氨酸和赖氨酸促进
菌体生长，但抑制 GSH 合成 ；而胱氨酸和丝氨酸能
促进 GSH 合成，但抑制菌体生长 ；仅有缬氨酸同时
促进菌体生长及胞内 GSH 合成，使 GSH 总产量提
高最为显著，与对照组相比 GSH 总产量提高 25.2%。
表 3 非前体氨基酸对 GSH 产量的影响
氨基酸种类
细胞干重
（g/L）
GSH 胞内浓度
（mg/g 干细胞）
GSH 总产量
（g/L）
不添加氨基酸 3.71±0.23 8.92±0.56 33.02±0.04
丙氨酸 3.89±0.28 8.77±0.56 34.07±1.83
精氨酸 4.52±0.35 8.54±0.39 38.62±3.77
胱氨酸 3.18±0.34 9.62±0.17 30.68±3.62
赖氨酸 4.17±0.11 7.98±0.28 33.28±1.22
丝氨酸 3.64±0.32 9.38±0.36 34.16±2.83
缬氨酸 4.29±0.16 9.66±0.12 41.42±1.13
2.2.3 添加 L-半胱氨酸和缬氨酸对 GSH 产量的影
响 基于上述试验，在培养基中添加氨基酸能明显
提高 GSH 总产量，其中以添加 L-半胱氨酸和缬氨酸
效果最佳。因此本试验进一步研究同时添加 L-半胱
氨酸和缬氨酸对 GSH 总产量的影响，结果如表 4 所
示，同时添加 L-半胱氨酸和缬氨酸能够显著地促进
菌体生长和胞内 GSH 合成，与对照组相比，GSH 总
产量提高 62.0%。
表 4 同时添加 L-半胱氨酸和缬氨酸对 GSH 发酵水平的影响
氨基酸种类
细胞干重
（g/L）
GSH 胞内浓度
（mg/g 干细胞）
GSH 总产量
（mg/L）
不添加氨基酸 3.59±0.30 9.12±0.26 32.70±0.42
只添加 L-半胱氨酸 3.42±0.22 11.33±0.29 38.73±2.29
只添加缬氨酸 4.34±0.34 9.55±0.32 41.59±2.06
添加 L-半胱氨酸和
缬氨酸
4.14±0.26 12.84±0.90 52.98±4.48
2.3 补加葡萄糖对GSH产量的影响
菌体含量与 GSH 胞内含量变化如图 1 所示，培
养 4 h 后，葡萄糖含量由 1.35% 迅速下降到 0.15%，
菌体生长速度逐渐减慢，GSH 胞内含量增长缓慢。
因此本试验在培养 6 h 后开始补加葡萄糖，并维持
培养基中的葡萄糖含量在 0.15% 左右，菌体浓度
和 GSH 胞内浓度均大幅提高。与未补加葡萄糖组相
比，经过 30 h 的培养，生产湿菌体 205.4 g，菌体含
量增加 1.5 倍，GSH 胞内浓度达 14.94 mg/g，提高了
2013年第11期 183王硕等 ：还原型谷胱甘肽发酵及分离纯化条件的优化
59.5%，GSH 总产量提高至原来的 4 倍。
2.4 GSH储存条件的优化
2.4.1 pH 对溶液中 GSH 稳定性的影响 如图 2-A
所示，GSH 在中性和碱性环境下不稳定，偏酸性环
境下理化性质比较稳定。在 pH 范围 3.0-5.5 的各组
中，GSH 损失均小于 15%。其中，保存于 pH4.5 缓
冲液中的 GSH 损失最小，24 h 后仅损失 8.5%。而
酸性过强则不利于 GSH 的保存，在 pH2.0 与 pH2.5
的组分中，GSH 的损失率随 pH 的进一步降低呈明
显的上升趋势，可能是因为在强酸性环境下肽链产
生了断裂。
2.4.2 氮气流速对溶液中 GSH 稳定性的影响 以氮
气作为保护气体研究 GSH 的储存条件，结果（图 2-B）
显示，与对照组相比，进行氮气保护的各组分 GSH
损失显著减少，且充气流速为 0.1 mL/s 与 0.5 mL/s
时 GSH 损失最少。随着充气流速的增加，GSH 损
失逐渐增高，可能是由于通入氮气的过程中增加了
GSH 与氧的碰撞几率。综合氮气用量和保护效果两
个因素，试验选择充入氮气的充气速度为 0.1 mL/s。
0
5
10
15
20
25
30
35
40
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30
0
5
10
15
20
25
30ᵚ㺕࣐㪑㨴㌆㧼փ⎃ᓖ㺕࣐㪑㨴㌆㧼փ⎃ᓖ㺕࣐㪑㨴㌆GSH㜎޵ਜ਼䟿ᵚ㺕࣐㪑㨴㌆GSH㜎޵ਜ਼䟿
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⎃ᓖ
g/L

ᰦ䰤h
G
SH
㜎޵
ਜ਼䟿
mg
/L

图 1 菌体含量和 GSH 胞内含量随时间变化关系
100
80
60
40
20
0
A
G
SH
ᦏཡ
⦷%

⧟ຳpH٬2 3 4 5 6 7 7.56.55.54.53.52.5
100B
80
60
40
20
0
G
SH
ᦏཡ
⦷%

ሩ➗㓴 ≞≄⍱䙏mL/min0.1 0.5 1.0 2.0
图 2 GSH 于不同 pH 条件（A）和不同氮气流速（B）下的稳定性
2.5 优化大孔树脂D001×7纯化条件
2.5.1 pH 对 GSH 吸附容量的影响 如图 3-A 所示，
在 pH3.0 与 pH4.5 环境下，GSH 的吸附容量最大，
分别为 430 mg/g 与 427 mg/g。鉴于 GSH 在 pH4.5 的
环境下更稳定，确定 GSH 的上柱环境为 pH4.5。
2.5.2 上样流速对大孔树脂吸附的影响 如图 3-B
所示，上样流速过快，GSH 还未完全吸附便开始流出，
GSH 收率低。当上样流速为 0.5、1.0 和 2.0 mL/min
时，GSH 收率分别为 90.5%、89.9% 和 90.3%，GSH
完全吸附。鉴于时间因素，试验选择的吸附流速为
2.0 mL/min。
2.5.3 洗脱液浓度对大孔树脂解吸的影响 如图 3-C
所示，0.1 mol/L 的碳酸氢铵作为洗脱液洗脱 GSH 的
效率最高，达 89.7%。因此确定洗脱液浓度为 0.1
mol/L 碳酸氢铵溶液。
2.6 水浴温度对GSH真空干燥收率的影响
如图 4 所示，水域温度在 75℃以上时，GSH 有
较大损失。水浴温度 60℃、65℃和 70℃三组 GSH
损 失 少， 收 率 分 别 为 99.8%、98.7% 和 97.9%。 与
60℃组分相比，70℃条件下真空干燥时间缩短 40
min，选择 70℃作为真空干燥的水浴温度。
2.7 洗脱液流速对Sephadex G-10纯化的影响
如表 5 所示，应用不同流速的超纯水洗脱 GSH，
GSH 的收率相当，均在 90% 左右。但洗脱流速过大，
杂蛋白不能与 GSH 得到有效分离。综合考虑洗脱效
果和时间因素，确定洗脱流速为 1.0 mL/min。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第11期184
表 5 洗脱流速对 GSH 纯化的影响
洗脱流速（mL/min） GSH 收率（%） 蛋白含量（mg/L）
0.3 90.63±1.55 33.83± 5.71
0.5 90.83±2.41 36.43± 10.10
0.8 91.27±2.95 38.47±16.45
1.0 89.47±1.70 36.30± 9.96
1.5 91.37±2.47 264.00±19.29
3 讨论
GSH 在医疗及食品行业中的应用日趋广泛。目
前，我国 GSH 的市场容量已经超过了 20 t。但我国
自行生产的 GSH 纯度不高，应用于食品、药品、化
妆品等大多数行业的 GSH 仍需进口。探索低成本，
高纯度的 GSH 生产方案并实现产业化，能够改善我
国 GSH 原料依赖进口的局面，具有重要的现实意义。
本研究通过筛选获得一株 GSH 高产菌株酿酒酵
母 Y18，其胞内 GSH 产量达 9.05 mg/g 干菌体。进
一步优化 GSH 的发酵条件发现，向培养基中添加 L-
半胱氨酸和缬氨酸并在发酵过程中补加葡萄糖能够
显著提高菌体生产 GSH 的能力，使 GSH 的总产量
提高 3 倍。
由于 GSH 的分离纯化过程均在水溶液环境下
进行，而 GSH 在水溶液中易氧化，因此适当优化储
存条件能够有效地减少 GSH 在分离纯化过程中的损
失，提高 GSH 的收率。本研究发现，GSH 在偏酸性
环境下以阳离子形式存在，理化性质较为稳定。而
充入氮气避免了 GSH 与空气中氧的接触，可有效防
止 GSH 被氧化，减少 GSH 的损失。
此外，传统 GSH 的分离纯化工艺通常以离子交
换法作为初步纯化步骤，而离子交换过程中的洗脱
液一般为无机酸、缓冲盐等。但 HCl 等挥发性无机
酸，因为能水解 GSH 使其收率降低 ；同时缓冲盐的
分子量与 GSH 相近，在后续纯化过程中，洗脱剂成
为新的杂质且难以除去，导致纯化工艺繁琐，成本高。
因此本试验通过摸索最终选择碳酸氢铵溶液作为大
孔树脂 D001×7 的洗脱液。碳酸氢铵在水溶解中能
够分解生成氨气、二氧化碳和水，不会引入新的杂
质，且碳酸氢铵的洗脱能力强，GSH 收率达 89.7%。
经过进一步分离纯化，最终获得纯度为 98.1%，收
率为 73.2% 的 GSH 纯品。本研究为 GSH 大规模的
工厂化生产提供理论基础。
4 结论
筛选获得一株 GSH 高产酿酒酵母 Y18，对其发
酵条件进行优化后，可使 GSH 产量提高 3 倍。进一
步对 GSH 在下游分离纯化过程中的稳定性及条件进
行优化，最终获得纯度为 98.1%，收率为 73.2% 的
GSH 纯品。
80
85
90
95
100
60 65 70 75 80⑙ᓖć
G
SH
᭦⦷
%
图 4 真空干燥水浴温度对 GSH 收率的影响
100
80
60
40
20
0
0.05 0.1 0.2⻣䞨≒≘⎃ᓖmol/L0.3 0.4 0.5
C
G
SH
ᦏཡ
⦷%

400
380
360
340
320
300
2.0
pH
2.5 3.5 4.5 5.5 6.5 7.57.06.05.04.03.0
420
430
460
A
吸
附
量
μg
/g

100
80
60
40
20
0
B
G
SH
ᦏཡ
⦷%

кṧ⍱䙏mL/min0.5 2.0 3.0 4.01.0
A ：pH 对 GSH 吸附容量的影响 ；B ：上样流速对 GSH 吸附的影响 ；C ：洗脱液浓度对 GSH 解吸的影响
图 3 大孔树脂 D001×7 纯化条件的优化
2013年第11期 185王硕等 ：还原型谷胱甘肽发酵及分离纯化条件的优化
参 考 文 献
［1］ Yin L, Han X, Yu Y, et al. Antioxidant effect of selenium-containing
dlutathione S-Transferase in rat cardiomyocytes［J］. Chemical
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（责任编辑 马鑫）