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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2016, 32(1):58-64
近年来随着石化原料的逐渐短缺和由此带来
的环境恶化等问题，利用可再生资源为原料加工生
产化学品可以从源头解决资源短缺和环境污染问
题，实现可持续发展。目前市场上销售的四甲基吡
嗪主要是化学法合成的，普遍存在污染环境问题。
而 生 物 发 酵 生 产 的 2，3，5，6-四 甲 基 吡 嗪（2，3，5，
6-Tetramethylpyrazine，TTMP）虽然价格昂贵，但消
费者更倾向于这种天然 TTMP 产品。直接从植物中
提取 TTMP，因植物中含量少提取率不高而没能实
现工业化，利用微生物发酵工程合成天然 TTMP 则
具有良好发展前景成为研究焦点。
本文将从 TTMP 的生产现状和合成机理出发，
收稿日期 ：2015-03-25
基金项目 ：国家自然科学基金项目（21376264）
作者简介 ：侯孝元，男，硕士，研究方向 ：微生物发酵与酶催化 ；E-mail ：hxyuan111@126.com
通讯作者 ：肖梓军，男，博士，副教授，研究方向 ：微生物技术 ；E-mail ：zjxiao@upc.edu.cn
利用发酵法生产四甲基吡嗪研究进展
侯孝元  顾如林  梁文龙  肖梓军
（中国石油大学（华东）生物工程与技术中心，青岛 266580）
摘 要 ： 2，3，5，6- 四甲基吡嗪（2，3，5，6-Tetramethylpyrazine，TTMP）是一种重要的食品香料添加剂，同时具有治疗心脑血
管疾病、呼吸系统疾病和肾小球疾病等的药用价值。回顾了微生物发酵法生产 TTMP 的研究进展，并分析了 TTMP 的产生机制，
总结了提高生产 TTMP 的有效途径，包括筛选内源性高产菌株、发酵过程优化、外源添加铵盐和分阶段的发酵控制等策略。提出
合成 TTMP 的过程是一个生化反应过程，是生物酶催化代谢产生乙偶姻和乙偶姻与铵离子自发生成 TTMP 两个阶段综合作用的结果，
利用分阶段温度控制的发酵策略可有效提高 TTMP 产量。对产物的提取和纯化进行了介绍，并根据目前的进展、面对的挑战和发
展趋势对发酵法生产 TTMP 研究前景进行了展望。
关键词 ： 2，3，5，6- 四甲基吡嗪 ；发酵 ；合成机理 ；高产策略
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.01.010
Research Progress on Production of Tetramethylpyrazine by
Fermentation
HOU Xiao-yuan GU Ru-lin LIANG Wen-long XIAO Zi-jun
（Centre for Bioengineering & Biotechnology，China University of Petroleum，Qingdao 266580）
Abstract: 2,3,5,6-tetramethylpyrazine（TTMP）as an important food flavor additive, it has additional medicinal values, such as in
cardiovascular and cerebrovascular health, respiratory system diseases and glomerular disease. In this paper, we reviewed the research progress
on fermentation production of TTMP, analyzed the synthesis mechanism of TTMP, and summarized the effective strategies to increase the yield
of TTMP, including the screening of endogenous high-yield strains, the optimization of fermentation process, the feeding of ammonium salt,
and multi-step fermentation control. We concluded that the production of TTMP can be divided into two stages, i. e. the enzymatic synthesis of
precursor acetoin and then the spontaneous condensation of TTMP from acetoin and ammonium. Further, the fermentation strategy with multiple-
step temperature control effectively increased the production yield. The extraction and purification of the product were introduced as well. The
future prospects of fermentation production of TTMP are discussed in light of the current progress, challenges, and trends in this field.
Key words: 2, 3, 5, 6-tetramethylpyrazine ；fermentation ；synthesis mechanism ；high-yield strategies
2016,32(1) 59侯孝元等：利用发酵法生产四甲基吡嗪研究进展
结合本课题组前期的研究成果，综述微生物发酵生
产 TTMP 取得的进展与成就，包括菌种的发现与改
造、发酵过程的培养基优化与过程控制、高效分离
提取工艺等方面，旨为后续有关提高 TTMP 产量的
研究究提供参考。
1 TTMP 的用途和生产现状
1.1 TTMP的用途
TTMP 是一类含氮的杂环化合物，具有烘烤和
坚果的特殊香味［1］，其香味阈值极低，被广泛应用
于食品添加剂。TTMP 天然存在于乳制品、豆制品、
榛子、醋、面包、酒精类饮料和咖啡等食品中［2，3］，
赋予其特殊香味。影响微生物发酵生产 TTMP 的一
种重要中间产物是乙偶姻，即 3- 羟基 -2- 丁酮，乙
偶姻具有令人愉悦的奶油香气，作为食品香味添加
剂被广泛应用［3］，但乙偶姻的分离提取较困难。
TTMP 不仅用作食品、饮料等行业的香味添加
剂，在医学上 TTMP 是中草药川芎根茎的主要活性
生物碱成分，具有扩张血管、抑制血小板黏附聚集
和血栓形成等良好的药理作用［4］，是重要的医药中
间体，引起国内外学者的广泛关注。随着对 TTMP
研究的深入，发现其在治疗心脑血管疾病、呼吸系
统疾病和肾小球疾病等方面具有一定疗效［5-8］。中
国白酒在制曲和堆积发酵中产生四甲基吡嗪，经蒸
馏带入酒中，赋予中国白酒以健康功能［9］。食醋在
发酵和储存过程也能产生吡嗪［10］，使其具有降血糖
血脂及促进钙的吸收等功效［11-13］。
1.2 微生物发酵生产TTMP现状
生产 TTMP 的方法主要有直接从植物中提取、
化学合成和生物合成 3 种。直接萃取法由于提取原
料来源有限，且在原料中 TTMP 含量少，提取产量
低，不适合工业化生产。TTMP 的化学合成法的化
学合成成本较低，但原料来源短缺和易造成环境污
染，且反应一般较剧烈，对设备要求也较高［14-18］。
微生物发酵法生产 TTMP，主要以糖为碳源，经微
生物发酵和化学反应制得天然 TTMP，已知能生产
TTMP 的菌种包括谷氨酸棒状杆菌突变菌株［19］、乳
酸杆菌［20］和芽孢杆菌及其突变菌株［21］，其中以芽
孢杆菌液态发酵产量最高，研究最多。生物合成法
优点在于原料来源广、反应条件温和、环境污染小、
产品绿色天然，缺点是产量较低、价格高。
利用微生物发酵生产 TTMP 的相关研究起步
较晚，生物合成途径生产 TTMP 的技术远未成熟。
1993 年，Yamaguchi 等［22］ 以 葡 萄 糖 为 碳 源 利 用
Bacillus natto 液态发酵产生的总吡嗪量为 42 mg/L。
Besson 等［23，24］通过向固体培养基中添加乙偶姻来
提高 TTMP 产量，虽然 TTMP 产量明显提高，最终
产量也仅为 0.58 g/L，对于实现工业化生产来说，
TTMP 产量仍很低。由此可见，直接利用野生菌发
酵生产 TTMP 的产量较低。为进一步提高微生物发
酵生产 TTMP 的能力，需要利用多种生物工程技术
来提高微生物生产 TTMP 的能力，这些生物工程技
术包括优良菌株的选育和诱变技术，以及优化培养
基组成和培养条件的发酵工程技术。
利用多种生物工程技术提高 TTMP 产量，经过
系统的研究后，Xiao 等［21］经诱变筛选获得一株突
变菌，用廉价的大豆胨和维生素代替蛋白胨和酵母
粉，在 5 L 发酵罐中发酵，并在培养基中加入磷酸
氢二铵（Diammonium phosphate，DAP），TTMP 产量
达到 4.33 g/L。有机氮源的替换和 DAP 的加入使发
酵生产 TTMP 的研究有了快速的发展。
2 合成机理研究
1962 年，Kosuge 等［25］ 首 次 在 枯 草 芽 孢 杆 菌
发酵液中检测到特殊香味物质，然后经过分离得到
的晶体经分析其结构为甲基取代的含氮杂环化合物
TTMP。Reineccius 等［26］在可可豆的发酵物中检测
到 TTMP，进一步验证了微生物具有代谢产生 TTMP
的能力。从首次发现微生物能够发酵生产 TTMP
后，关于微生物中 TTMP 生成机制就一直是研究的
焦点。
Kosuge 等［27］提出生物发酵液中 TTMP 是由芽
孢杆菌发酵产生的乙偶姻与氨基酸反应生成，但
对于氮以何种形式与乙偶姻反应并未涉及。Besson
等［23，24］通过向 Bacillus subtilis IFO 3013 的发酵液中
外源添加乙偶姻，经检测 TTMP 的生成速率和最终
产量明显提高，提出乙偶姻是合成 TTMP 的重要前
体。Adachi 等［28，29］通过向培养基中分别加入氨基
酸（甘氨酸、谷氨酸、缬氨酸、精氨酸或天冬氨酸）
和氯化铵作为唯一氮源，均可检测到 TTMP 的生成，
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.160
作者提出发酵体系中 TTMP 是由发酵产生的乙偶姻
与氨基酸的氨基部分形成，参与反应的可能是铵离
子。Huang 等［30］利用乙偶姻与醋酸铵反应模型体系，
利用同位素标记的方法对中间体二氢吡嗪进行定性，
提出 TTMP 是由乙偶姻和铵离子反应生成。目前普
遍接受的 TTMP 合成机理是微生物通过糖类代谢产
生乙偶姻后再与铵离子反应产生 TTMP。
关于乙偶姻与铵离子的反应机制一直存在争议，
争议的核心问题是发酵体系中微生物代谢产生的乙
偶姻与铵离子反应生成 TTMP 过程是否为酶促反应。
一些人认为此过程是酶促反应，但对与之相关的酶
或基因并未有报道。另一观点是，TTMP 生成过程
是一种生物化学 - 化学（Biochem-chem）反应过程，
即乙偶姻是在生物酶催化下合成的，但从乙偶姻到
TTMP 的生成是一种非酶催化的自发过程。Kim 等［20］
通过发酵和化学合成偶联方式实现乙偶姻与铵离子
反应合成 TTMP，验证了第二种观点［31］。吴建峰等［32］
利用 B. subtilis S12 产 TTMP 原位反应验证乙偶姻与
铵离子反应过程与生物酶无关。Xiao 等［33］利用两
步温控法，进一步验证乙偶姻与铵离子的反应为非
酶催化的热力学自发过程。
以上研究证实生物发酵生产 TTMP 是由乙偶姻
和铵离子反应产生的，因此发酵生产 TTMP 实际分
为两个阶段 ：第一阶段是微生物发酵产生前体乙偶
姻（图 1-The 1st step）；第二个阶段是乙偶姻与铵离
子反应生成 TTMP，该过程为自发的热力学过程（图
1-The 2nd step）。铵离子可经氨基酸降解产生［30］，
也可直接来源于外源添加的无机铵盐［21，32，34］。
除主要产物 TTMP 外，可检测到一些副产物
OXZ、2，3，5- 三 甲 基 吡 嗪 和 2- 乙 基 -3，5，6- 三 甲
基吡嗪［21，33，36］。两步温控的反应过程显示，生成
OXZ 的反应可逆，随反应进行生成的 OXZ 又分解
用来合成 TTMP，而且此可逆反应受温度影响明显，
当温度较高时，基本检测不到 OXZ 的生成［33］。根
据发酵生产 TTMP 的反应机制，提高微生物发酵生
产 TTMP 的方法有两种 ：一是获得优良菌株，提高
前体乙偶姻的积累量 ；二是向发酵液中添加铵盐提
高乙偶姻转化率和四甲基吡嗪的产率。
3 高产策略
3.1 提高发酵液中前体乙偶姻的量
最早关于提高 TTMP 产量主要从发酵培养基优
化和培养条件优化两方面进行。发酵培养基主要考
虑碳源和氮源的优化，微生物对碳源的利用具有选
择性，选择合适碳源能加快细胞生长与代谢产物合
成。氮源对微生物的生长发育具有重要作用，它们
主要用来合成细胞中的含氮物质。培养条件主要从
pH、温度和溶氧量 3 个方面优化，pH 是影响微生
物生长的重要环境参数 ；温度不仅影响微生物的生
长，而且对代谢过程中的关键酶活性也有重要影响，
从而影响代谢产物的合成 ；溶氧量对细胞生长、代
谢途径和产物的生成产生影响，溶氧量高有利于代
谢产生更多乙偶姻，减少副产物乙醇、乳酸等的产生。
glucose
EM
pyrurate a-acetolactate
diacetyl
BDH 2,3-butanediol
amino acid
NH4
+
ammonium
NH
OHO
NH2
N
O
NH2
N
N
N
N
O
O
NH2
OH
N
O
OH
N
O
N
O
TTMP 2,4,5-trimethyl-
3-oxazoline
2,4,5-trimethyl-
oxazole
OXZ
OH
O
ALS,AHAS
POX,PDC
or PDH
ALDC
POX,PDC
or PDH
reductase
NOD
OH
O
The 2nd step
The 1st step
EM ：Embden-Meyerhof ；ALS ：α-acetolactate synthase ；AHAS ：acetohydroxy
acid synthase ；POX ：pyruvate oxidase ；PDC ：pyruvate decarboxylase ；PDH ：
pyruvate dehydrogenase ；NOD ：nonenzymatic oxidative decarboxylation ；
ALDC ：α-acetolactate decarboxylase ；BDH ：2，3-butanediol dehydrogenase
图 1 TTMP 和副产物合成途径［33，35］
2016,32(1) 61侯孝元等：利用发酵法生产四甲基吡嗪研究进展
上述方法主要是通过影响生物本身生理代谢，
提高乙偶姻的量来增加 TTMP 的产量。虽然可以提
高发酵液中乙偶姻的量，但改变不明显。外源添加
前体乙偶姻可以有效提高 TTMP 的产量［23，24］，但乙
偶姻价格较高，且高浓度的乙偶姻对细胞具有毒性，
破坏细菌原有代谢平衡，而且外源添加的乙偶姻利
用率不高［24］，因此筛选和诱变来获得内源性积累前
体乙偶姻的菌种至关重要。
大部分 TTMP 合成菌株是一类产芽孢的杆菌属，
受先前关于用芽孢杆菌进行吡嗪发酵研究报告的启
发［23，24］，Xiao 等［21］采取生理富集的策略来筛选菌
株，首先将菌悬液 80℃热处理 10 min，然后涂布
进行初筛，最后诱变处理复筛获得 TTMP 高产菌株
Bacillus sp. RX3-17，TTMP 产 量 达 到 4.33 g/L。Zhu
等［37］ 利用类似方法加热处理酒曲后筛选，从中
筛得一株内源性积累前体乙偶姻的菌株 B. subtilis
XZ1124，其 TTMP 的产量达到 4.08 g/L，再次证明
热处理方法筛选产芽孢类 TTMP 高产菌株的有效性。
上述筛选内源前体乙偶姻积累菌株的策略是根
据芽孢耐受高温的特性，热处理后再筛选可减少工
作量。筛选得到的菌株前体乙偶姻是逐渐积累的，
避免外源添加对细胞毒性较大的缺点。Xiao 等［38］
综述了提高发酵生产乙偶姻产量的策略，主要从菌
种筛选，基因工程，培养基优化，发酵过程控制等
方面论述提高乙偶姻产量的方法，对提高微生物合
成 TTMP 产量具有重要指导意义。
3.2 增加铵离子来源
TTMP 分子结构中的氮来源于铵离子，因此提
高发酵体系中铵离子的浓度有利于促进 TTMP 的合
成。培养基中加入的有机氮源，在微生物发酵过程
产生少量的铵离子，不能满足乙偶姻向 TTMP 转化
时的需求，因此需要外源添加无机铵盐，例如硫酸铵、
碳酸铵、硝酸铵、醋酸铵、草酸铵和磷酸铵等，可
提高乙偶姻的利用率。不同的铵盐对产量的影响效
果不同，研究表明当加入磷酸铵盐时，对 TTMP 生
成速率和产量影响最大［21，39，40］。发酵培养基中加
入过多铵盐对细胞生长和糖的利用不利，需要确定
合适的铵盐加入量。利用铵盐的补加策略，在发酵
合成乙偶姻的后期获得大量乙偶姻时，加入适量的
铵盐可避免对细胞生长的抑制。
选择合适的铵盐有两层意义，一是满足细胞生
长的需求以及与乙偶姻反应的需要，二是稳定和调
节反应过程的 pH。Huang［34］发现磷酸铵中的磷酸
根在乙偶姻与铵离子反应形成席夫碱的过程作为质
子供体和受体，而且过量的磷酸根可以维持反应液
的 pH 稳定在中性，更有利于 TTMP 的形成。
3.3 分阶段控制策略
虽 然 发 酵 过 程 添 加 乙 偶 姻 和 铵 盐 可 以 提 高
TTMP 的产量，但两种物质的加入在一定程度上破
坏微生物原有的代谢平衡，引起微生物数量的减少，
从而引起乙偶姻积累量的降低，使 TTMP 的产量降
低，而两阶段策略解决了上述矛盾。分阶段策略包
括糖补加策略、铵盐补加策略、分阶段 pH 控制策
略和两步温度控制策略。
乙偶姻是微生物的初级细胞代谢产物，生产
TTMP 菌株以糖为碳源，已知菌种主要以葡萄糖和
蔗糖为碳源，因此提高培养基中糖浓度有利于乙偶
姻的积累，然而细胞对糖的浓度有耐受范围，高浓
度糖导致细胞生长环境渗透压增高，抑制细胞生长。
糖浓度因素限制了更高浓度乙偶姻的获得，但分批
量的加入糖，使细胞快速增值和代谢，积累前体乙
偶姻，发酵后期积累一定量乙偶姻时补加无机铵盐，
使乙偶姻快速转化为 TTMP，提高乙偶姻的有效利
用率和 TTMP 产量。Hao 和 Xu［41］和徐岩和朱朱峰［42］
以枯草芽孢杆菌利用上述糖补加策略和铵盐补加策
略 ：首先在培养基中分批添加葡萄糖使菌体能够发
酵产生大量乙偶姻，在发酵液中加入磷酸铵盐，补
充铵离子促进 TTMP 合成，经过补加策略乙偶姻的
积累量和 TTMP 的产量分别提高了 2.4 倍和 6.8 倍。
研究发现，乙偶姻与铵离子反应生成 TTMP 过
程在 pH 为中性时转化率和产量最高，而不同微生
物 其 最 适 生 长 pH 不 同。 如 Bacillus subtilis CCTCC
M208157 菌株在 pH5.5 时生长最快，乙偶姻的生成
速度快，积累量高。Zhu 等［43］控制 pH5.5 时发酵获
得最大乙偶姻积累量，再调节 pH 至 7.0，实现乙偶
姻向 TTMP 的快速转化，最终获得 TTMP 产量为 7.43
g/L，产量提高 22.2%［43］。利用两阶段 pH 控制策略，
可明显提高前体乙偶姻的积累量和 TTMP 的产量。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.162
上述策略虽提高 TTMP 产量，但因发酵后期菌
体还有活性，不可避免的引起酶催化下乙偶姻的降
解，且低温乙偶姻和铵离子的反应速率低，铵盐的
加入影响乙偶姻的积累等导致 TTMP 产量变化较小。
TTMP 生物合成机制的研究显示从乙偶姻到 TTMP
的反应是自发的非酶催化反应，乙偶姻与铵离子的
反应是在热动力学作用下进行的，因此升高温度可
加快反应，缩短反应时间，增加 TTMP 产量。Xiao
等［33］ 利用两步温度控制 策 略， 以 Bacillus subtilis
CICC 10211 菌株在 37℃下发酵积累乙偶姻，当发酵
29 h 后，微生物开始消耗乙偶姻，此时停止发酵过程，
向发酵液中加入磷酸氢二铵（按乙偶姻与铵离子比
为 1∶3），升高反应温度（65℃至 95℃），反应温度
95℃时，得到 TTMP 含量为 8.34 g/L 的发酵液，这
是有报道芽孢杆菌发酵生产 TTMP 的最高水平，检
测显示随温度升高反应速率和产量都增加，但温度
提高容易引起 TTMP 的挥发和能量消耗。
3.4 添加氧化剂
经过上述多种方法，TTMP 产量得到大幅度提
高，但乙偶姻与铵离子反应生成 TTMP 的产率低。
导致产率低的原因可能是在 TTMP 的生成过程存在
中间体 2，3，5，6- 四甲基 -2，5- 二氢吡嗪，需要氧化
反应脱去两个氢才能生成 TTMP。此过程可能为歧
化反应，二氢吡嗪部分氧化为 TTMP，另一部分转
化为还原产物，但在此过程通入氧气并不能增加氧
化产物的比例［31］。加入较强氧化剂，可能会增加
TTMP 的产量，因此在两步温控反应第二阶段，向
发酵液中加入强氧化剂双氧水检测 TTMP 产量的变
化，结果表明强氧化剂双氧水的加入可以明显增加
产物 TTMP 的量。通过以上不同高产策略的实施，
TTMP 产量有所提高，不同菌株 TTMP 生产能力比较，
见表 1。两步温度控制的发酵策略是目前最有效的
提高 TTMP 产量的方法。
表 1 不同高产策略下 TTMP 的产量
菌株 加入铵盐 提高产量方法 产量 /（g·L-1） 参考文献
B. subtilis CICC 10211 67.7 g/L of DAP Added hydrogen peroxide 12.28 This study
B. subtilis CICC 10211 67.7 g/L of DAP Temperature controlled two-step method 8.34 ［33］
B. subtilis CCTCC M208157 30 g/L of DAP DAP feeding fermentation 7.46 ［39］
B. subtilis CCTCC M208157 30 g/L of DAP pH-controlled two-step fermentation 7.43 ［42］
B. subtilis CCTCC M208157 30 g/L of DAP Normal fermentation 4.08 ［37］
Bacillus sp. CCTCC M206043 30 g/L of DAP Glucose fed-batch fermentation 4.33 ［21］
B. subtilis CCTCC M208157 3%（W/W）of DAP 10%（w/w）of Glucose two-step fermentation 3.01a ［41］
B. subtilis IFO 3013 ND Add 90 g/kg acetoin 2.5b ［24］
B. subtilis IFO 3013 ND Add 60 g/L acetoin 0.58 ［23］
Lactococcus lactis ssp. Lactis biovar.
diacetyilactis FC1
ND Normal fermentation 0.54 ［20］
Corynebacterium glutamicum MB-1923 ND Normal fermentation 3 ［19］
ND ：not added. aThe unit was g/kg dry substrate. bThe unit was g/kg initial dry weigh
4 TTMP 的分离提取
乙偶姻容易溶于水和有机溶剂的独特性质，使
其下游过程很难找到一种高效的分离方法，相对于
乙偶姻的分离提取，TTMP 的纯化更简单，因此将
发酵液中的乙偶姻转化为易分离的 TTMP，不仅避
免乙偶姻回收困难，而且增加了产品价值，这种方
法称作 FDR［38］（Fermentation-Derivatization-Recovery）。
TTMP 溶解度对温度很敏感，当温度为 37℃时，
溶解度为 4.77 g/L，当温度为 4℃时，TTMP 在水中
的溶解度为 1.06 g/L，低温时溶解度较小，因此从复
杂的发酵液中分离得到 TTMP 的方法相对比较简单。
直接将反应结束后的反应液降温析出晶体，过滤并
用冰水洗涤即可得到纯度达到 99% 的 TTMP。该方
法得到的 TTMP 纯度高，但总的收率较低，主要是
过滤洗涤晶体过程，滤出液中仍溶解有较多 TTMP，
这部分产品可再经蒸发、结晶、过滤等步骤回收。
TTMP 易挥发，反应液经蒸馏得到的馏分，利用冷
冻干燥回收 TTMP，可以获得更高的回收率，但处
2016,32(1) 63侯孝元等：利用发酵法生产四甲基吡嗪研究进展
理方法复杂，需要大量能量，不适宜工业生产。
5 展望
TTMP 作为香味添加剂和医药中间体，需求量
越来越大。目前，基于化石原料的化学合成法是
TTMP 工业生产的主要方法，面临资源短缺和环境
污染问题，而随着微生物发酵生产 TTMP 研究的不
断发展，天然 TTMP 产品产量会不断增加，产品更
受消费者青睐，发展前景更广阔。
虽然经过众多研究人员不断研究，微生物发酵
生产 TTMP 的产量有所提高，但还不适用于大规模
工业化生产。限制性因素主要有微生物发酵产生的
乙偶姻量少、乙偶姻向 TTMP 转化率低和 TTMP 回
收率低，要克服这些瓶颈问题，主要从以下方面考
虑。（1）提高菌株内源性乙偶姻积累量。菌株对乙
偶姻的耐受性有限，不利于乙偶姻的积累，因此筛
选内源性高产乙偶姻菌种，利用基因工程获得乙偶
姻高产菌株来提高发酵产生的乙偶姻量是研究重点。
（2）提高乙偶姻有效转化率。乙偶姻和铵根离子反
应生成 TTMP 时最高产量也仅为理论产量的 53%，
需进一步探究转化率低的原因，提高乙偶姻有效利
用率获得更高产量的 TTMP。（3）提高回收率。已
知 TTMP 分离提取方法回收率不高，造成产品浪费。
微生物生产的主要弊端是发酵液成分复杂，产物不
易分离纯化，因此优化培养基组成、开发高效率低
成本的分离纯化方法是提高 TTMP 回收率，降低生
产成本，促进 TTMP 大规模工业化生产前体。
目前微生物发酵生产 TTMP，主要是以葡萄糖
为碳源，因此开发能够利用其它糖（如木糖）为碳
源的菌株，利用价值更高。
参 考 文 献
［1］ Masuda H, Mihara S. Olfactive properties of alkylpyrazines and
3-substituted 2-alkylpyrazines［J］. J Agric Food Chem, 1988, 36
（3）：584-587.
［2］ Burdock GA. Encyclopedia of food and color additives, Volume
3［M］. 1st edition. New York ：CRC Press, Inc, 1997 ：2769-
2770.
［3］ Fan W, Xu Y, Qian M. Identification of aroma compounds in
Chinese “Moutai” and “Langjiu” liquors by normal phase liquid
chromatography fractionation followed by gas chromatography/
olfactometry［M］// Qian MC, Shellhammer TH. Flavor Chemistry
of Wine and Other Alcoholic Beverages. Washington ：Oxford
University Press Inc, 2012 ：303-338.
［4］ 蒋跃绒 , 陈可冀 . 川芎嗪的心脑血管药理作用及临床应用研究
进展［J］. 中国中西医结合杂志 , 2013, 33（5）：707-711.
［5］ Guo SK, Chen KJ, Qian ZH, et al. Tetramethylpyrazine in the
treatment of cardiovascular and cerebrovascular diseases［J］.
Planta Med, 1983, 47（2）：89.
［6］ Watanabe H. Candidates for cognitive enhancer extracted from
medicinal plants ：paeoniflorin and tetramethylpyrazine［J］.
Behav Brain Res, 1997, 83（1-2）：138-141.
［7］ Chang FC, Huang YT, Lin HC, et al. Beneficial effects of combined
terlipressin and tetramethylpyrazine administration on portal
hypertensive rats［J］. Can J Physiol Pharm, 1999, 8 ：618-624.
［8］ Tsai TH, Liang CC. Pharmacokinetics of tetramethylpyrazine in rat
blood and brain using microdialysis［J］. Int J Pharm, 2001, 216
（1-2）：61-66.
［9］ 吴建峰 . 中国白酒中健康功能性成分四甲基吡嗪的研究［J］.
酿酒科技 , 2007（1）：117-120.
［10］ Xu W, Xu Q, Chen J, et al. Ligustrazine formation in Zhenjiang
aromatic vinegar ：changes during fermentation and storing
process［J］. J Sci Food Agric, 2011, 91（9）：1612-1617.
［11］ Ebihara K, Nakajima A. Effect of acetic acid and vinegar on blood
glucose and insulin responses to orally administered sucrose and
starch［J］. Agric Biol Chem, 1988, 52（5）：1311-1312.
［12］ Kondo S, Tayama K, Tsukamoto Y, et al. Antihypertensive effects
of acetic acid and vinegar on spontaneously hypertensive rats［J］.
Biosci Biotechnol Biochem, 2001, 65（12）：2690-2694.
［13］ Kishi M, Fukaya M, Tsukamoto Y, et al. Enhancing effect of dietary
vinegar on the intestinal absorption of calcium in ovariectomized
rats［J］. Biosci Biotechnol Biochem, 1999, 63（5）：905-910.
［14］ Weitz HM, Fischer RH. Manufacture of pyrazines ：US, 4064124
［P］. 1977-12-20.
［15］ Sato K. Process for preparing pyrazines ：US, 4097478［P］.
1977-3-31.
［16］ Chang CD, Perkins PD. Process for making alkyl pyrazines ：US,
4855431［P］. 1989-8-8.
［17］ Amrani HM, Cerny C, Fay LB. Mechanisms of formation of
alkylpyrazines in the Maillard reaction［J］. J Agric Food Chem,
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.164
1995, 43（11）：2818-2822.
［18］ Shoji T, Nakaishi T, Mikata M. Process for producing pyrazine
compounds ：US, 5693806［P］. 1997-12-2.
［19］ Demain AL, Jackson M, Trenner NR. Thiamine-dependent
accumulation of tetramethylpyrazine accompanying a mutation in
isoleucine-valine pathway［J］. J Bacteriol, 1967, 2 ：323-326.
［20］ Kim KS, Lee HJ, Shon DH, et al. Optimum conditions for the
production of tetramethylpyrazine flavor compound by aerobic fed-
batch culture of Lactococcus lactis subsp. Lactis biovar. diacetilactis
FC1［J］. J Microbiol Biotechnol, 1994, 4（4）：327-332.
［21］ Xiao ZJ, Xie NZ, Liu PH, et al. Tetramethylpyrazine production
from glucose by a newly isolation Bacillus mutant［J］. Appl
Microbiol Biotechnol, 2006, 73（3）：512-518.
［22］ Yamaguchi N, Toda T, Teramoto T, et al. Studies on pyrazine
formation by Bacillus natto. V. Effect of sugars on microbiological
pyrazine formation by Bacillus natto in synthetic liquid medium
［J］. Nippon Shokuhin Kogyo Gakkaishi, 1993, 12 ：841-848.
［23］ Larroche C, Besson I, Gross JB. High pyrazine production
by Bacillus subtilis in solid substrate fermentation on ground
soybeans［J］. Process Biochem, 1999, 34（6-7）：667-674.
［24］ Besson I, Creuly C, Gross JB, et al. Pyrazine production by Bacillus
subtilis in solid-state fermentation on soybeans［J］. Appl
Microbiol Biotechnol, 1997, 47（5）：489-495.
［25］ Kosuge T, Kamiya H. Discovery of a pyrazine in a natural
product ：tetramethylpyrazine from cultures of a strain of Bacillus
subtilis［J］. Nature, 1962, 193（4817）：776.
［26］ Reineccius GA, Keeney PG, Weissberger W. Factors affecting
the concentration of pyrazines in cocoa beans［J］. J Agric Food
Chem, 1972, 20（2）：202-206.
［27］ Kosuge T, Adachi T, Kamiya H. Isolation of tetramethylpyrazine
from cultures of Bacillus natto and biosynthetic pathways of
tetramethylpyrazine［J］. Nature, 1962, 195（4846）：1103.
［28］ Adachi T, Kamiya H, Kosuge T. Studies on the metabolic products
of Bacillus subtilis. ii. the production of tetramethylpyrazine by
natto［J］. Yakugaku Zasshi, 1964, 84（5）：451-452.
［29］ Adachi T, Kamiya H, Kosuge T. Studies on the metabolic
products of Bacillus subtilis. III. relation between amino acids and
tetramethylpyrazine production［J］. Yakugaku Zasshi, 1964, 84
（6）：543-545.
［30］ Huang TC, Fu HY, Ho CT. Mechanistic studies of tetramethylpyra-
zine formation under weak acidic conditions and high hydrostatic
pressure［J］. J Agric Food Chem, 1996, 44（1）：240-246.
［31］ Rizzi GP. Formation of pyrazines from acyloin precursors under
mild conditions［J］. J Agric Food Chem, 1988, 2 ：349-352.
［32］ 吴建峰 , 徐岩 . 白酒细菌酒曲固态培养条件下 B. subtilis S12
产四甲基吡嗪的合成机制［J］. 食品与生物技术学报 , 2014,
33（1）：8-15.
［33］ Xiao Z, Hou X, Lyu X, et al. Accelerated green process of
tetramethylpyrazine production from glucose and diammonium
phosphate［J］. Biotechnol Biofuels, 2014, 7（7）：106-113.
［34］ Huang TC. Combined effects of a buffer and solvent on
tetramethylpyrazine formation in a 3-hydroxy-3 butanone/
ammonium hydroxide system［J］. Biosci Biotech Biochem, 1997,
61（6）：1013-1015.
［35］ Xiao Z, Lu JR. Generation of acetoin and its derivatives in
foods［J］. J Agric Food Chem, 2014, 62（28）：6487-6497.
［36］ Fu HY, Ho CT. Mechanistic studies of 2-（1-hydroxyethyl）-2,
4, 5-trimethyl-3-oxazoline formation under low temperature in
3-hydroxy-2-butanone/ammonium acetate model systems［J］. J
Agric Food Chem, 1997, 45（5）：1878-1882.
［37］ Zhu B, Xu Y, Fan W. High-yield fermentative preparation of
tetramethylpyrazine by Bacillus sp. using an endogenous precursor
approach［J］. J Ind Microbiol Biotechnol, 2010, 2 ：179-186.
［38］ Xiao Z, Lu JR. Strategies for enhancing fermentative production of
acetoin ：A review［J］. Biotechnol Adv, 2014, 2 ：492-503.
［39］ Zhu B, Xu Y. A feeding strategy for tetramethylpyrazine production
by bacillus subtilis based on the stimulating effect of ammonium
phosphate［J］. Bioprocess Biosyst Eng, 2010, 33（8）：953-959.
［40］ 朱兵峰 , 徐岩 . 一种用于枯草芽孢杆菌发酵生产四甲基吡嗪
的补料策略［J］. 酿酒科技 , 2011（2）：17-22.
［41］ Hao F, Wu Q, Xu Y. Precursor supply strategy for tetramethylpyra-
zine production by Bacillus subtilis on solid-state fermentation of
wheat bran［J］. Appl Biochem Biotechnol, 2013, 169（4）：
1346-1352.
［42］ 徐岩 , 朱兵峰 . 一种生产四甲基吡嗪的方法及其生产菌株 ：
中国 , CN101955980B［P］. 2013-5-22.
［43］ Zhu B, Xu Y. Production of tetramethylpyrazine by batch culture
of Bacillus subtilis with optimal pH control strategy［J］. J Ind
Microbiol Biotechnol, 2010, 37（8）：815-821.
（责任编辑 狄艳红）