全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第3期
经典的植物学分类方法是形态鉴定方法，由于
表型性状易受环境条件的影响，亲缘关系相近的物
种之间在形态上差异性较小，利用表型性状鉴定有
时会造成品种鉴定的准确性不够，因而很难完整而
正确地揭示一些物种之间的亲缘关系。分子生物学
的迅猛发展及实验技术的突破，使人们可以在基因
组水平上对生物进行指纹分析，进而形成了分子分
类技术［1］。利用现代分子标记技术进行分类和鉴定
可以从本质上为植物分类和鉴定提供依据，同时可
收稿日期 ：2012-06-26
基金项目 ：中国林业科学研究院亚林所基本科研业务费专项资金项目（RISF61253），林业公益性行业科研专项（201004009）
作者简介 ：江锡兵，男，博士，助理研究员，研究方向 ：经济林育种与栽培 ；E-mail ：jxb912@gmail.com
美洲黑杨与大青杨杂种无性系分子鉴定
江锡兵1，2  张志毅2  龚榜初1
（1. 中国林业科学研究院亚热带林业研究所，富阳 311400 ；2. 北京林业大学林木育种国家工程实验室
林木花卉遗传育种教育部重点实验室，北京 100083）
摘 要 ： 采用 AFLP 标记技术，利用 EcoR I +2 / Mse I +3 引物组合对美洲黑杨与大青杨 12 个杂种无性系进行分子鉴定，结
果表明，从 32 对引物组合中筛选出 10 对扩增条带较多的引物组合，扩增得到总条带数在 7-52 条之间，多态性条带数在 2-28 条
之间，条带多态性比例分布范围为 23.5%-41.6%，多态性条带数和多态性比例均较低，表明各个参试样品之间的亲缘关系较近 ；
UPGMA 聚类分析结果与 12 个无性系的系谱关系一致，表明亲本相同的无性系具有较高的相似系数 ；利用 6 个引物组合的 9 条多
态性条带绘制了 12 个无性系的指纹图谱，为美洲黑杨与大青杨杂种无性系鉴定以及品种保护提供依据。
关键词 ： 杨树 杂种 AFLP 分子鉴定 指纹图谱
Molecular Identification of Hybrid Clones Between Populus deltoides
Bartr. and P. ussuriensis Kom.
Jiang Xibing1，2 Zhang Zhiyi2 Gong Bangchu1
（1. Research Institute of Subtropical Forestry，CAF，Fuyang 311400 ；2. National Engineering Laboratory for Tree Breeding，NDRC ；Key
Laboratory of Genetics and Breeding in Forest Trees and Ornamental Plants，MOE，Beijing Forestry University，Beijing 100083）
Abstract:  Molecular identification of 12 hybrid clones were carried out using primer combinations of EcoR I + 2 / Mse I + 3 by adopting
AFLP marker technology. The results were as followeds: 10 primer combinations with more amplification bands were selected from 32 primer
combinations, the total number of bands were between 7 and 52, number of polymorphism bands were from 2 to 28, polymorphism level of those
primer combinations were from 23.5% to 41.6%, and lower level of polymorphism bands and proportion showed that the relationships of the
samples were closed. The results of UPGMA cluster analysis and pedigree relations of 12 clones were the same, which indicated that clones with
the same parents had higher genetic similarity coefficient. The fingerprinting map of 12 hybrid clones were draw using 9 polymorphism bands
from 6 primer combinations, which would provide bases of identification and protection for hybrid clones.
Key words:  Poplar Hybrid AFLP Molecular identification Fingerprinting map
以鉴别形态分类的准确性。
杨树作为重要经济栽培树种，育种学家选育出
了大量的优良无性系在世界范围内广泛交流应用，
然而，仅仅利用形态鉴定优良无性系之间的差别存
在着极大的局限性，因此，构建指纹图谱进行无性
系鉴定和良种登记显得尤为重要。指纹图谱鉴别无
性系具有准确迅速等优点，意大利的 Castiglione ［2］
利用 RAPD 标记技术构建了 32 个杨树无性系的指纹
图谱，结果表明利用这一技术可以有效区分那些形
2013年第3期 103江锡兵等 ：美洲黑杨与大青杨杂种无性系分子鉴定
态学上无法鉴别的无性系。尹佟明等［3］利用 AFLP
标记技术对 42 个美洲黑杨无性系进行了指纹分析，
发现根据每一无性系的特征谱带组合可以鉴别不同
的无性系。
本研究以美洲黑杨与大青杨 12 个杂种无性系为
材料，其中 7 个在生长量或抗寒性方面表现优良 ［4］，
采用 AFLP 标记技术从分子水平上对无性系进行鉴
别，构建其指纹图谱，旨在为杨树杂种无性系鉴定
以及新品种审定、保护奠定理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料
本研究所用材料为李善文［5］通过人工杂交获得
的 12 个美洲黑杨与大青杨杂种无性系，12 个无性
系获得于 3 个杂交组合，无性系编号及其杂交组合
父母本来源，如表 1 所示。
表 1 杂种无性系编号及其父母本来源
无性系编号 杂交母本 母本来源 杂交父本 父本来源
136、141、146、147、153、163 I-69 杨 P. deltoides cv. ‘Lux’ 山东临沂 大青杨 3 号 P. ussuriensis cv. ‘U3’ 吉林露水河
181、183 大青杨 4 号 P. ussuriensis cv. ‘U4’ 吉林露水河 T66 P. deltoides cv. ‘T66’ 山东临沂
190、191、192、193 大青杨 4 号 P. ussuriensis cv. ‘U4’ 吉林露水河 T26 P. deltoides cv. ‘T26’ 山东临沂
1.2 方法
1.2.1 样品 DNA 提取纯化 取 12 个杂种无性系材
料的新鲜叶片各 5 g，标号，在液氮中迅速研磨成粉
末，采用天根生化科技（北京）有限公司提供的植
物基因组 DNA 提取试剂盒（操作方法见说明书）提
取 12 份材料的基因组 DNA，风干后溶于 TE 缓冲液；
用 RNA 酶进行纯化处理后在 1% 琼脂糖凝胶上进行
电泳，并测定样品 DNA 浓度，根据测定结果，将所
有样品 DNA 稀释至相应浓度，-20℃ 保存备用。
1.2.2 酶切和接头连接 采用内切酶 EcoR I 和 Mse I
对 DNA 样品进行双酶切，并加入 EcoR I 接头和 Mse
I 接头的混合物对酶切产物进行连接，酶切连接反应
体系参照李博方法［5］，37℃ 恒温酶切连接≧ 4 h。
1.2.3 预扩增 将酶切连接产物稀释若干倍作为预
扩增模板，预扩增采用 E00 + M00 的引物组合（表 1），
引物合成于上海英骏生物技术有限公司（Invitrogen），
反应体系参照李博方法［6］。PCR 扩增程序 ：94℃ 3
min ；94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，30 个循环 ；
72℃ 5 min，4℃ forever。预扩增完成后，取 5 μL 预
扩增产物加水 95 μL，稀释 20 倍，置于 4℃ 备用，
其余预扩增产物在 -20℃ 下保存，备用。
1.2.4 选择性扩增 以稀释后的预扩增产物为模板
进行选择性扩增，选择性扩增采用 EcoR I+3/MSe I+2
的引物组合，引物同样合成于上海英骏生物技术有
限公司（Invitrogen），反应体系参照李博方法［6］。
PCR 扩增程序：94℃ 3 min；（94℃ 30 s，65℃ 30 s（-
0.7℃ / cycle），72℃ 1 min，13 个循环 ；94 ℃ 30 s，
56℃ 30 s，72℃ 1 min，30 个循环 ；72℃ 5 min，4℃
表 2 AFLP 分子标记引物信息
引物类别 引物名称 引物序列信息 引物类别 引物名称 引物序列信息
接头 EcoR I F ：CTCGTAGACTGCGTACC EcoR-63 GACTGCGTACCAATTCGAA
R ：AATTGGTACGCAGTC 反向选择扩增引物 Mse-33 GATGAGTCCTGAGTAAAAG
Mse I F ：GACGATGAGTCCTGAG Mse-34 GATGAGTCCTGAGTAAAAT
R ：TACTCAGGACTCAT Mse-38 GATGAGTCCTGAGTAAACT
预扩增引物 E00 GACTGCGTACCAATTC Mse-40 GATGAGTCCTGAGTAAAGC
M00 GATGAGTCCTGAGTAA Mse-42 GATGAGTCCTGAGTAAAGT
正向选择扩增引物 EcoR-40 GACTGCGTACCAATTCATC Mse-44 GATGAGTCCTGAGTAAATC
EcoR-51 GACTGCGTACCAATTCCTA Mse-47 GATGAGTCCTGAGTAACAA
EcoR-60 GACTGCGTACCAATTCCTC Mse-56 GATGAGTCCTGAGTAACCA
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第3期104
forever。选择性扩增后的产物在 4 ℃下保存，备用。
1.2.5 电泳及银染 聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染程
序参照李博方法［6］。
1.2.6 统计分析 统计 AFLP 扩增条带，清晰易于
辨认的条带记录为“1”，空缺时记录为“0”。应用
Nei 等［7］方法计算遗传相似系数 Gs = 2Nij /（Ni+Nj），
其中 Ni、Nj、Nij 分别表示第 i 个材料的扩增条带
数、第 j 个材料的扩增条带数、第 i 和第 j 个材料
扩增的共有条带数 ；利用 NTSYS-pc 2.1 软件按照
UPGMA 方 法 进 行 聚 类 分 析， 绘 制 聚 类 图［8］；选
取清晰的 AFLP 条带绘制 12 个杂种无性系的指纹
图谱。
2 结果
2.1 引物筛选
采用 EcoR I+3/Mse I+2 的引物组合，从 32 对引
物组合中筛选出 10 对扩增条带较多的引物组合对无
性系材料进行选择性扩增。筛选出的 10 对引物组
合的扩增产物经聚丙烯酰胺电泳后得到总条带数在
7-52 条之间，多态性条带数在 2-28 条之间，条带
多态性比例分布范围为 23.5%-41.6%（表 3，图 1）。
平均条带数最多的引物组合是 E51-CTA / M44-TC，
共得到 52 条。平均条带数最少的引物组合为 E51-
CTA / M38-CT，仅有 7 条。多态性条带数最多的引
物组合为 E40-ATC / M33-AG，共 28 条。多态性条
带数最少的引物组合为 E51-CTA / M38-CT，仅有 2
条。在所有引物组合中，E51-CTA / M42-GT 扩增所
得条带多态性比例最低，仅为 23.5%，而 E63-GAA /
M33-AG 扩增所得条带多态性比例最高，为 41.6%。
2.2 聚类分析
在所有扩增条带中，选取 83 条 AFLP 多态性条
带，用 NTSYS-pc 2.1 软件按照 UPGMA 方法进行聚
类分析，绘制了 12 份美洲黑杨与大青杨杂种优良无
性系的亲缘关系树状图（图 2）。从聚类图中可以看
出 12 个无性系可以分为 3 组，其中 136-163 聚为一
组，181、183 聚为一组，190-193 聚为一组。136、
141、146、147、153 和 163 等 6 个杂种无性系是美
洲黑杨 I-69 与大青杨 3 号杂交的全同胞子代，具有
较近的亲缘关系。聚类结果显示该组合内又分为 3
组，其中，136 和 153，146、147 和 163 在相似系数 0.82
水平上各自聚成一组，然后两组在 0.79 水平上聚
为一组。而 141 单独聚为一组，与其它个体在 0.74
水平上聚为一类。无性系 181 和 183 是大青杨 4 号
与美洲黑杨 T66 的杂交子代，而无性系 190、191、
192、193 则是大青杨 4 号与美洲黑杨 T26 的杂交子
代。两组由于具有共同的母本，在聚类图上显示在
0.65 水平聚为一起。两组个体具有相同的母本，但
是聚类结果显示亲缘关系相对全同胞杂交子代较远，
说明父本的差异对它们的亲缘关系具有一定的影响。
表 3 不同引物组合的 AFLP 条带统计
引物组合
平均条带数
（条）
多态性条带数
（条）
多态比例
（%）
E40-ATC/M33-AG 47 28 38.2
E51-CTA/M38-CT 7 2 28.5
E51- CTA/M42-GT 17 4 23.5
E51- CTA/M47-AA 28 8 28.5
E51- CTA/M56-CA 16 4 25.0
E51- CTA/M40-GC 15 4 26.6
E51- CTA/M44-TC 52 19 36.5
E60- CTC/M34-AT 12 4 33.3
E63-GAA/M33-AG 12 4 41.6
E63- GAA/M40-GC 15 6 40.0
E51-CTA/M40-GC E63-GAA/M40-GC
500
bp
400
300
200
100
图 1 AFLP 选择性扩增结果
2.3 遗传相似系数分析
根据 10 对引物组合选择性扩增产物的电泳结
果，分析 12 个美洲黑杨与大青杨杂种的遗传相似系
数（表 4）。12 份材料由 3 个杂交组合的子代构成，
美洲黑杨 I-69 与大青杨 3 号杂交子代包括无性系
2013年第3期 105江锡兵等 ：美洲黑杨与大青杨杂种无性系分子鉴定
136、141、146、147、153 和 163，这 6 个无性系间
遗传相似系数变化范围在 0.673 0-0.826 9 之间，平
均为 0.784 5。大青杨 4 号与美洲黑杨 T66 杂交子代
181 与 183 遗传相似系数为 0.807 6。大青杨 4 号与
美洲黑杨 T26 的杂交子代为 190、191、192、193，
这 4 个子代间遗传相似系数变化在 0.711 5-0.884 6
之间，平均 0.804 5。3 个组合间，I-69 与大青杨 3
号杂交组合内个体平均相似系数最低，暗示该组合
可能相对于其它杂交组合具有更丰富的遗传变异。
在所有个体间，相似系数最小的是 183 与 153，为
0.173 0，相似系数最大的是 191 与 192，为 0.884 6。
在以大青杨 4 号为母本的 2 个组合中，183 与 190、
192 的相似系数最低为 0.557 6。这可能是由于不同
父本基因组差异造成的。
Coefficient
0.47 0.58 0.68 0.78 0.88
136
153
146
163
147
141
181
183
190
191
192
193
图 2 基于 AFLP 数据的 12 个杂种无性系聚类图
表 4 12 个杂种无性系遗传相似系数
无性系 136 141 146 147 153 163 181 183 190 191 192 193
136 1.0000
141 0.6730 1.0000
146 0.8076 0.7115 1.0000
147 0.7307 0.7500 0.8076 1.0000
153 0.8269 0.7692 0.8269 0.8269 1.0000
163 0.7692 0.7884 0.8461 0.8461 0.7884 1.0000
181 0.4230 0.4423 0.4230 0.3076 0.2884 0.3846 1.0000
183 0.2692 0.3269 0.2692 0.1923 0.1730 0.2692 0.8076 1.0000
190 0.6346 0.5000 0.6346 0.5576 0.5769 0.5961 0.6346 0.5576 1.0000
191 0.5961 0.5384 0.5576 0.5192 0.5384 0.5576 0.6730 0.5961 0.8076 1.0000
192 0.7115 0.5769 0.6730 0.5576 0.5769 0.6346 0.7115 0.5576 0.8461 0.8846 1.0000
193 0.4615 0.5192 0.4230 0.4615 0.4038 0.5000 0.7307 0.6923 0.7115 0.8269 0.7500 1.0000
2.4 指纹图谱构建
根据选择性扩增结果，选择 6 对引物扩增出的
9 条多态性条带绘制了 12 个美洲黑杨与大青杨杂种
的指纹图谱（图 3）。6 对引物组合分别为 E40-M33、
E51-M38、E51-M40、E51-M44、E51-M56、E60-
M34。从图中可以看出，在该图谱中每份材料都具有
独特的带型，从而可以与其他材料互相区分。
E40-M33 260 bp
136 141 146 147 153 163 181 183 190 191 192 193
E51-M33 460 bp
E51-M40 115 bp
E51-M44 112 bp
E51-M44 100 bp
E51-M56 253 bp
E51-M56 249 bp
E51-M56 226 bp
E60-M34 259 bp
3 讨论
利用分子标记构建指纹图谱用于鉴别无性系与
传统的表型鉴定方法相比，具有不受环境干扰、快
速准确等优势。胡晓丽等［9］对 12 个三倍体毛白杨
和二倍体毛白杨无性系进行 AFLP 分子标记鉴定，
采用 EcoR I + 2 / Mse I + 3 引物组合，不同引物组合
扩增结果的多态性比例分布范围为 15.7%-32.4%。
本研究采用 EcoR I + 3 / Mse I + 2 的引物组合，从 32
对引物组合中筛选出 10 对扩增条带较多的引物组
合进行选择性扩增。多态性比例最高的引物组合是
E63-GAA / M33-AG，为 41.6%。多态性比例最低的
引物组合是 E51-CTA / M42-GT，为 23.5%。本研究
结果显示，引物扩增多态性比例相比胡晓丽等人的图 3 12 个杂种无性系 AFLP 指纹图谱
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第3期106
研究结果较高，可能是由于扩增引物选择性碱基数
不同造成的，也可能是本研究选择的杂交亲本具有
相对较远的亲缘关系造成的。
聚类分析结果显示所有供试个体被聚为 3 组，
聚类结果与其系谱关系完全一致。大青杨 4 号作为
母本分别与美洲黑杨 T66 以及 T26 进行杂交，第一
个杂交组合包括无性系 181 和 183，后者包括 190、
191、192、193 等 4 个无性系。聚类图显示两组杂
交子代在 0.65 水平聚为一类，表明两组个体虽然具
有相同的母本，但是聚类结果显示亲缘关系相对全
同胞杂交子代较远，说明父本的差异对它们的亲缘
关系有较大影响。
李宽钰等［10］对黑杨派、白杨派和青杨派 DNA
多态性的研究结果显示白杨派 4 个树种遗传相似系
数 在 0.606 9-0.821 5 之 间， 平 均 为 0.662 7。 李 善
文［4］计算得到白杨派全部样本间平均遗传相似系
数是 0.8273。本研究计算得到了 12 份美洲黑杨与
大青杨杂种的遗传相似系数，数据显示相似系数在
0.173 0-0.884 6 之间，平均 0.660 4。相似系数变化
范围与先前研究相比较宽，可能是由于供试材料不
同造成的。此外，美洲黑杨 I-69 与大青杨 3 号杂
交组合内个体平均相似系数在 3 个组合中最低。暗
示该组合可能相对于其他杂交组合具有更为丰富的
遗传变异，有利于下一步选择育种工作的开展。在
所有个体间，相似系数最小的是 183 与 153，仅为
0.173 0，相似系数最大的是 191 与 192，为 0.884 6。
在以大青杨 4 号为母本的两个组合中，183 与 190、
192 的相似系数最低，为 0.557 6，这可能是由于不
同父本基因组差异造成的。
RAPD、AFLP、SSR 等众多分子标记技术都被
用来构建指纹图谱［2，3，11，12］。RAPD 标记带型丰富，
但是重复性较差。SSR 标记重复性好，但是条带不
够丰富并且引物开发需要有已知序列，难以推广到
基因组信息未知的树种。AFLP 标记技术则具有带型
丰富，重复性好，引物开发不依赖已知序列等优点。
胡晓丽［9］与本研究分别使用了 3 对和 6 对引物即可
以分别将试验所用无性系材料进行准确区分和鉴定。
因此，相对于其它分子标记技术，AFLP 是构建指纹
图谱较好的分子标记系统。
4 结论
本研究采用 AFLP 标记技术对美洲黑杨与大青
杨 12 个杂种无性系进行分子鉴定，10 对引物组合
扩增得到总条带数在 7-52 条之间，多态性条带数在
2-28 条之间，条带多态性比例分布范围为 23.5%-
41.6% ；UPGMA 聚类分析将 12 个无性系在不同水平
上聚为 3 大类，结果与其系谱关系一致 ；根据 6 个
引物组合的 9 条多态性条带绘制了 12 个无性系的指
纹图谱。
参 考 文 献
［1］ 桂君 , 谭晓风 . 植物分子分类与鉴定综述［J］. 生命科学研究 ,
1998, 2（4）：253-257.
［2］ Castiglione S, Wang G, Damiani G, et al. RAPD fingerprints for
identification and for taxonomic studies of elite poplar（Populus
spp.）clones［J］. Theor Appl Genet, 1993, 87（1-2）：54-59.
［3］ 尹佟明 , 孙晔 , 易能君 , 等 . 美洲黑杨无性系 AFLP 指纹分析［J］.
植物学报 , 1998, 40（8）：778-780.
［4］ 江锡兵 . 美洲黑杨与大青杨杂种无性系遗传变异研究［D］. 北
京 ：北京林业大学 , 2011.
［5］ 李善文 . 杨树杂交亲本与子代遗传变异及分子基础研究［D］.
北京 ：北京林业大学 , 2004.
［6］ 李博 . 毛白杨与毛新杨转录组图谱构建及若干性状的遗传学联
合分析［D］. 北京 ：北京林业大学 , 2009.
［7］ Nei M, Li WH. Mathematical model for studying genetic variation in
terms of restriction endonucleases［J］. Proc Natl Acad Sci USA,
1979, 76 ：5269-5273.
［8］ 宋跃朋 , 江锡兵 , 等 . 杨树 Genomic-SSR 与 EST-SSR 分子标记
遗传差异性分析［J］. 北京林业大学学报 , 2010, 32（5）：1-7.
［9］ 胡晓丽 , 周春江 , 岳良松 . 三倍体毛白杨无性系的 AFLP 分子
标记鉴定［J］. 北京林业大学学报 , 2006, 28（2）：9-14.
［10］ 李宽钰 , 黄敏仁 , 王明庥 , 等 . 白杨派、青杨派和黑杨派的
DNA 多态性及系统进化研究［J］. 南京林业大学学报 , 1996,
20（1）：6-11.
［11］ Fossati T, Grassi F, Sala F, et al. Molecular analysis of natural
populations of Populus nigra L. intermingled with cultivated
hybrids［J］. Mol Ecol, 2003, 12（8）：2033-2043.
［12］ Rahman MH, Dayanandan S, ajora OP. Microsatellite DNA markers
in Populus tremuloides［J］. Genome, 2000, 43（2）：293-297.
（责任编辑 李楠）