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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第10期
L-半 胱 氨 酸（L-cysteine，C3H7NO2S， 分 子 量
121.12）是唯一的含巯基氨基酸，肽链之间以二硫
键（S-S）连接［1］，化学性质活泼。L-半胱氨酸可作
为呼吸系统药物，面团性质改良剂和美白用品等广
泛应用于医药、食品和化妆品行业［2］。
收稿日期 ： 2014-04-24
作者简介 ：赵婧楠，女，硕士，研究方向 ：生物催化与基因克隆 ；E-mail ：zhaojingnan0218@163.com
通讯作者 ：李志敏，女，博士，教授，研究方向 ：生物化工，发酵工程，代谢工程，微生物生理和代谢调控 ；E-mail ：lizm@ecust.edu.cn
Pseudomonas sp. F-12 发酵优化及转化合成半胱氨酸的
研究
赵婧楠  李志敏  叶勤
（华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室，上海 200237）
摘 要 ： 通过不同发酵策略对 Pseudomonas sp. F-12 以 DL-2-氨基 - △ 2-噻唑啉 -4-羧酸（DL-ATC）为底物生产 L-半胱氨酸的
过程进行优化，以分批发酵和指数流加发酵的形式进行生产，将发酵过程中的 DL-ATC 浓度分别控制在 5 g/L 和 15 g/L。结果表明
15 g/L DL-ATC 分批发酵生产 L-半胱氨酸得到最高酶活为 149.1 U/mL，比活为 70.9 U/mg DCW ；采用 15 g/L DL-ATC 两阶段指数流
加发酵，可使最高酶活达到 313.3 U/mL，提高为分批发酵的 2.1 倍。同时在两阶段发酵过程中，能减少 DL-ATC 用量为 5 g/L。两
阶段发酵过程采用不同流加策略，证明菌体得率对酶活水平有显著影响。首次考察了 Pseudomonas sp. F-12 全静息细胞转化合成 L-
半胱氨酸的主要影响因素。结果表明 Pseudomonas sp. F-12 的最适转化 pH 为 8.0，最适转化温度为 30℃。加入甲苯等有机溶剂改变
细胞膜通透性，使得半胱氨酸产量比对照组提高 7.16 倍，最高摩尔转化率达到 93.3 %。不同金属离子对转化影响不同，0.1 mmol/
L Fe2+ 对转化反应有促进作用，0.1 mmol/L Co2+、Zn2+、Ni2+ 等重金属离子有抑制作用。研究结果为微生物法发酵及全细胞转化合成
半胱氨酸的后续工业化奠定了基础。
关键词 ： 假单胞菌 L-半胱氨酸 DL-2-氨基 - △ 2-噻唑啉 -4-羧酸（DL-ATC） 发酵 生物转化
Study on Fermentation and Conversion of L-cysteine by
Pseudomonas sp. F-12
Zhao Jingnan Li Zhimin Ye Qin
（State Key Laboratory of Bioreactor Engineering，East China University of Science and Technology，Shanghai 200237）
Abstract: L-cysteine has been widely applied in food and pharmaceuticals. In this study, different fermentation strategies of Pseudomonas
sp. F-12 transforming DL-ATC to L-cysteine were investigated. The results showed that the highest enzyme activity of 15 g/L DL-ATC batch
fermentation was 149.1 U/mL, specific activity was 70.9 U/mg DCW. The highest enzyme activity of two phase fermentation using 15 g/L DL-
ATC was 313.3 U/mL, 2.1 times higher than the batch fermentation. The amount of DL-ATC was reduced to 5 g/L. In this study, the major factors
on the biotransformation of L-cysteine by Pseudomonas sp. F-12 were investigated. The optimal reaction conditions for cells were 30℃, pH
8.0. The addition of organic solvents could change cellular permeability and enhance the production of L-cysteine by 7.16 times. The maximum
conversion of L-cysteine was 93.3%. 0.1 mmol/L Fe2+ benefitted the reaction, while 0.1 mmol/L Co2+, Zn2+, Ni2+ and other heavy metal ions
inhibited transformation.
Key words: Pseudomonas sp. F-12 L-cysteine DL-ATC Fermentation Bioconversion
目前我国半胱氨酸的工业生产主要采用毛发
水解法，但该工艺在制备过程中产生大量废酸和废
气，造成严重环境污染［3］。1977 年，日本学者 Sano
等［4］发现嗜硫氮杂环戊烯假单胞菌（Pseudomonas
thiozolinophilum）可以转化 DL-2-氨基 -Δ2-噻唑啉 -4
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第10期208
羧 酸（DL-2- Amino-Δ2-thiazoline-4-carboxylic Acid）
合成 L-半胱氨酸。相比毛发水解法，微生物转化法
具有工艺简单、环境友好等优点。其转化途经已进
行详细研究，如图 1 所示［5-7］。日本已能在工业规
模利用微生物法转化合成半胱氨酸，而我国仍然较
多采用毛发水解法，因此开展微生物法生产 L-半胱
COOH
NH2
ATC racemase
D-ATC L-ATC
L-ATC hydrolase
(AtcB)
N-carbamyl-L-cysteineL-NCC
S-carbamyl-L-cysteineL-SCC S-carbamyl-L-cysteineamidohydrolase
N-carbamyl-L-cysteine
amidohydrolaseAtcC
L-cysteine
H2O
N
S
COOH
COOH
NHCONH2
HS
COOH
NH2
HS
NH3 + CO2H2O
COOH
H2NOCS
NH2
NH2
N
S
图 1 DL-ATC 转化半胱氨酸的途径
氨酸的研究十分有必要。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种 假单胞菌 F-12（Pseudomonas sp. F-12），
本研究室筛选保存［8］。
1.1.2 材料与试剂 DL-ATC（分析纯）购自天津试
剂二厂，葡萄糖为食品级别。其他试剂为市售分析纯。
1.1.3 培 养 基 （1） 种 子 培 养 基（g/L）：DL-ATC
15，KH2PO4 1，MgSO4 0.5，FeSO4 0.01，MnSO4 0.007。
其中 MnSO4，FeSO4 溶液过滤灭菌加入，其余培养
基 121℃，灭菌 20 min。（2）5 L 罐分批发酵培养基
（g/L）：DL-ATC 15，KH2PO4 1，MgSO4 0.5，FeSO4
0.01。MnSO4 0.007。其中 MnSO4，FeSO4 过滤灭菌加入，
其余培养基 121℃，灭菌 20 min。（3）5 L 罐两阶段
发酵培养基（g/L）：葡萄糖 2，KH2PO4 1，NH4Cl 2，
MgSO4 0.5，FeSO4 0.01，MnSO4 0.007。 其 中 FeSO4
和 MnSO4 过 滤 灭 菌 加 入。 补 料 葡 萄 糖 为 1 mol/L，
25% 的氨水调节 pH7.0。
1.2 方法
1.2.1 种子培养条件 将 -20℃甘油管保存的假单胞
菌 500 μL 接种于的 250 mL 摇瓶，装 30 mL 种子培
养基。30℃，220 r/min 摇床培养 30 h。将一级种子
液按 1%-2% 的接种量，接种于 500 mL 摇瓶，装液
量为 100 mL，30℃，220 r/min 摇床培养 12 h。
1.2.2 5 L 罐分批发酵 5 L 发酵罐，装 2 L 发酵培
养基，按接种量 10% 进行接种。培养条件为温度
30℃，通气量 2 vvm，搅拌转速初始 600 r/min，之
后根据溶氧逐步提高。1 mol/L H2SO4 控制发酵过程
pH6.8-7.0。每 1 h 取样，测定菌浓和发酵产物，留
样待测酶活。
1.2.3 5 L 罐两阶段指数流加发酵 两阶段法生产半
胱氨酸，第一阶段为菌体高密度生长阶段，以指数
流加的方式流加葡萄糖，使菌体密度达到最大。第
二阶段加入 5 g/L 或 15 g/L DL-ATC 诱导酶活。
发酵罐装液量 2 L，接入二级种子 200 mL，培
养条件为温度 30℃，初始搅拌转速 600 r/min，初始
通气量 2 vvm。菌体生长阶段以 25% 氨水调节 pH 值，
流加葡萄糖的浓度为 1 mol/L。第二阶段以 1 mol/L
H2SO4 加入调节 pH 值。
1.2.4 DL-ATC 浓度对菌体生长及酶活影响试验
5 L 罐 发 酵 收 集 发 酵 液 100 mL，4℃、12 000 r/min
离心 20 min。将离心得到的菌体利用种子培养基洗
涤两次，再重悬于 20 mL 的种子培养基中得到浓缩
菌液。将浓缩菌液以 2% 的接种量加入到含有不同
浓度 DL-ATC 的摇瓶中，30℃、220 r/min 培养 12 h，
每 2 h 取样 1 次，每组试验两个平行对照。
2014年第10期 209赵婧楠等 ：Pseudomonas sp. F-12 发酵优化及转化合成半胱氨酸的研究
1.2.5 假单胞菌 F-12 转化细胞的制备 将 -20℃保
存的菌株接种到装有 30 mL 种子培养基的三角瓶
中，30℃、220 r/min 培养 30 h。将培养好的一级种
子液按 2% 接种量接种到装有 100 mL 培养基的 500
mL 三角瓶中，30℃、220 r/min 培养 12 h。发酵液
6 000 r/min、4℃离心 10 min，弃上清液，将菌体用
1 mol/L 的磷酸缓冲液离心洗涤 2 次，得到转化反应
所需的静息细胞。
1.2.6 pH 对细胞转化反应的影响 用磷酸氢二钠 -
柠檬酸缓冲体系配制 pH 值为 4.0、5.0、6.0、7.0 的
转化液，甘氨酸-氢氧化钠缓冲配制 pH 值为 8.0、
9.0、10.0 的转化液。利用 1 mol/L、pH8.0 的磷酸缓
冲液将静息细胞配制成 OD 为 8.9 的细胞悬液，置于
水浴摇床（100 r/min）进行反应，每 2 h 取样 1 mL，
12 000 r/min、4℃离心 10 min，取上清测定 L-半胱
氨酸含量。
1.2.7 温度对细胞转化反应的影响 配制 pH 为 8.0，
DL-ATC 浓度为 10 g/L 的转化液。利用上述转化液将
发酵获得的静息细胞配置成 OD 为 9.0 的细胞悬液，
分别在 30℃、37℃、42℃、45℃水浴条件下进行转化，
每 2 h 各取样 1 mL，测定半胱氨酸含量。
1.2.8 细胞渗透剂对转化反应的影响 将培养细
胞离心重悬，在菌液中分别加入 1 mL 甲苯、吐温
80、氯仿、CTAB（十六烷基三甲基溴化铵），将各
类有机试剂与细胞充分混匀，30℃混合培养 20 min，
12 000 r/min 离 心 10 min 弃 去 上 清， 加 1 mL pH8.0
的磷酸缓冲溶液重悬。取处理过的菌液作转化，转
化液中 DL-ATC 浓度 10 g/L。
1.2.9 金属离子对转化反应的影响 考察了 Mg2+、
Fe2+、Co2+、Al3+、Ca2+、Zn2+、Ni2+、Mn2+ 对转化的影响，
配制含上述 8 种金属离子（0.1 mmol/L）的 DL-ATC
转化液。加入静息细胞，置于水浴摇床进行转化，
每 2 h 取样 1 次，测定半胱氨酸含量。
1.2.10 分析方法
（1）菌体浓度采用浊度法测定。将培养的菌
液按适当比例进行稀释，使用 721 型分光光度计在
600 nm 下检测发酵液的光密度（OD600）。
（2）发酵液中残留的 DL-ATC 采用岛津 LC-20A
型高效液相色谱仪测定［9］。色谱柱为 C18 柱（150
mm×4.6 mm，Wondasil，Japan），检测器为紫外检
测器（SPD-20A），波长 260 nm，柱温 30℃，流动
相为 1∶1 的超纯水和乙腈，流速为 0.6 mL/min。
（3）酶活测定。在转化过程中有 3 种酶存在，
这 3 种酶结合在一起形成半胱氨酸合成酶，其活性
能反应完整细胞的转化能力［10］。检测表观半胱氨酸
合成酶活性的方法 ：细胞放置于 1.5 mL 离心管中，
4℃，12 000 r/min 离心 5 min，加入 0.1 mol/L 磷酸
缓冲液（pH8.0）洗涤 2 次，重悬于包含 10 g/L DL-
ATC 的 0.1 mol/L 磷酸缓冲液（pH 8.0），42℃ 水浴
15 min， 加 入 200 μL 10%（W/V） 盐 酸 停 止 反 应，
利用酸式茚三酮法测定半胱氨酸含量［11］。一个酶活
单位定义为在上述标准条件下 1 min 产生 1 μg L-半
胱氨酸所需的酶量。单位菌体质量的酶活力定义为
比活。
（4）半胱氨酸含量的测定。取待测发酵液于
4℃，12 000 r/min，离心 10 min，弃上清，沉淀用
25 mL 溶有 10 g/L DL-ATC 的磷酸缓冲溶液（pH8.0）
重悬。42℃水浴摇床（100 r/min）中，反应 10-12 h，
每 2 h 取样 1 mL。将样品 12 000 r/min，室温离心 10
min，取上清煮沸 1 min，相同条件离心，再取上清
利用酸式茚三酮法测定半胱氨酸含量。
2 结果
2.1 5 L罐15 g/L DL-ATC分批及两阶段发酵
5 L 罐 15 g/L DL-ATC 分批发酵曲线如图 2 所示。
整个发酵过程为 10 h，发酵 8 h 溶氧迅速跳升，9 h
达到最高 OD 5.38。在 0-4 h 基本检测不到酶活的产
生，说明此阶段 DL-ATC 用于菌体生长，没有诱导
0 2 4 6 8 10
0
20
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)/E
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U/mL/DCW
Fermentation timeh
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Enzyme activity
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14
DL-ATC
OD600
O
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60
0/D
L-
AT
C
g/L
图 2 假单胞菌 F-12 15 g/L DL-ATC 分批发酵
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第10期210
出转化的酶。5 h 之后开始产生酶活。在溶氧跳升点
后 1 h，酶活产生最大值为 148.1 U/mL，比活为 70.9
U/mg DCW。在发酵过程中，溶氧和菌浓可作为重要
指标判断出酶活情况。溶氧跳升说明碳氮源物质供
给不足，跳升后菌体浓度基本不再增加，此时 DL-
ATC 消耗完全，产物积累最多，因此在溶氧跳升点
产生酶活最大值。
分批发酵可知菌体生长和诱导酶活均依赖于
唯 一 的 碳 氮 源 DL-ATC。 因 此 若 要 降 低 成 本， 菌
体 生 长 阶 段 可 采 用 较 廉 价 的 碳 氮 源 如 葡 萄 糖。
Pseudomonas sp. F-12 在以 DL-ATC 为碳氮源的分批
培养情况下，最大 OD 值仅为 5.38。由分批试验可
知，Pseudomonas sp. F-12 产生酶活与菌体浓度相关，
若要获得较高的酶活需要提高菌浓。考虑降低成本，
同时希望获得更高的酶活，故采用两阶段策略进行
发酵。两阶段发酵第一阶段以葡萄糖为碳源，以氨
水为氮源高密度发酵产生菌体 ；第 2 阶段一次性补
加 DL-ATC 进行诱导。
如图 3 所示，葡萄糖作为碳源时菌体增加较快，
在 16 h 菌体达到最大 OD 29.1。生长阶段初期，生
长速率会超过 0.2 h-1 以上，之后随限制性因素增加，
代谢副产物大量积累，增长速率逐渐放缓。菌体达
到最大 OD 加入 DL-ATC 进行诱导。诱导阶段溶氧
逐渐下降，4 h 后溶氧跳升发酵结束。在诱导后 3 h，
酶活最高，达到 313.3 U/mL。指数流加发酵得到的
最大单位酶活为分批发酵的 2.1 倍，有效提高了体
积酶活，但是比酶活并未显著升高。主要原因是菌
体生长阶段利用葡萄糖代谢，积累酸性物质，此酸
性物质会影响菌体转化活力［8］。诱导后期，由于溶
氧条件限制及代谢废物的积累导致菌体的比生长速
率明显下降，大量菌体自溶，利用 DL-ATC 能力降低，
因此菌体相对比活并无提高。
2.2 摇瓶试验对比不同浓度DL-ATC对生长和酶活
的影响
摇瓶考察不同 DL-ATC 浓度对菌体生长和产酶
的影响。由图 4 可知，DL-ATC 浓度对于菌体生长
有一定影响。在 20 g/L DL-ATC 发酵 6 h 下，菌体得
到最高菌浓 OD600 为 5.67。在 5 g/L、10 g/L 和 15 g/L
DL-ATC 浓度下，菌浓最高值 OD600 分别为 5.33，5.34
和 5.65，为 20 g/L DL-ATC 的 94%，94.5% 和 99.6%，
其 结 果 相 差 不 大。 由 图 5 可 知， 在 DL-ATC 浓 度
10 g/L 时，酶活的诱导效果最好，达到 13.12 U/mL。
5 g/L、15 g/L 和 20 g/L DL-ATC 浓度诱导的酶活分别
为 12.86 U/mL，12.73 U/mL，11.43 U/mL。酶活为 10
g/L DL-ATC 诱导的 98%，97% 和 87%。摇瓶试验成
功地将 DL-ATC 由原来的 15-20 g/L 降低为 5-10 g/L。
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DL-ATC
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g/L ĉ ĊDL-ATC shot
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U/mL
图 3 假单胞菌 F-12 15 g/L DL-ATC 指数流加发酵
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
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3.5
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Timeh
5 g/L 10 g/L 15 g/L 20 g/L
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A
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5 g/L 10 g/L 15 g/L 20 g/L
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U/mL
Timeh2 4 6 8 10 12 14
图 4 不同 DL-ATC 浓度对菌体浓度及酶活影响曲线
2014年第10期 211赵婧楠等 ：Pseudomonas sp. F-12 发酵优化及转化合成半胱氨酸的研究
2.3 5 L罐5 g/L DL-ATC分批及两阶段发酵
5 L 罐 Pseudomonas sp. F-12 的 分 批 发 酵，DL-
ATC 的量减少为 5 g/L。发酵趋势与 15 g/L DL-ATC
差别不大，酶活测定结果见图 5。
合成可与补碱消耗量相耦联分析。Pseudomonas sp.
F-12 利用葡萄糖的过程中，会产生有机酸，造成 pH
的下降。补入的氨水可以中和生成的有机酸，使发
酵液保持恒定的 pH。消耗氨水的量越多，说明副产
物有机酸产生越多。在策略一得率 0.296 的情况下，
消耗氨水量较少，为 153.7 g。在策略二得率 0.241
的情况下，氨水消耗为 208.4 g，说明此时有机酸产
生量多。初步推断发酵过程中产生的未知有机酸，
对于酶活有较大的影响。
2.4 转化合成研究
发酵获得全细胞后，研究不同 pH，转化温度，
底物浓度，不同表面活性剂及不同金属离子对其转
化合成半胱氨酸的影响。
不同 pH 和温度对全细胞转化反应有显著影响
（图 8）。反应时间为 8 h，pH 值为 8.0 时合成 L-半
胱氨酸为 1.65 g/L。当 pH 值大于 9.0 时，L-半胱氨
0
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0
TimehVolumetric activityU/m
L
Sp
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U/mgDCW Volumetric activitySpecific enzyme activity
1 2 3 5 6
图 5 假单胞菌 F-12 5 g/L DL-ATC 分批发酵过程中的酶活
表达
5 L 罐 5 g/L DL-ATC 分批发酵菌体 OD 达到最大
值为 3.19。 3-5 h 比生长速率迅速升高，同时酶活
逐渐增高。溶氧跳升后酶活达到最大为 95.5 U/mL，
比 活 为 91.5 U/mg DCW。 相 比 较 15 g/L DL-ATC 与
5 g/L DL-ATC 发酵情况，5 g/L DL-ATC 菌体浓度为
3.19，为 15 g/L DL-ATC 最大菌体浓度的 59.3%。5 g/L
DL-ATC 分批发酵最大酶活为 95.5 U/mL，为 15 g/L
DL-ATC 最大酶活 148.1 U/mL 的 64.5%，而比酶活
5 g/L DL-ATC 分批发酵高于 15 g/L DL-ATC 分批发酵，
说明 5 L 罐分批发酵降低 DL-ATC 浓度可行。
两阶段发酵降低 DL-ATC 浓度进行诱导，以两
种控制不同比生长速率的策略考察对于酶活的影响。
第一种策略以比生长速率 0.2 h-1 控制菌体生长，再
以 5 g/L DL-ATC 进行诱导。第二种策略以比生长速
率 0.27 h-1 控制菌体生长，再以 5 g/L DL-ATC 进行
诱导，结果如图 6 和图 7。
第 1 种策略下的菌体最高 OD 为 21.2，平均比
生长速率为 0.233 h-1，得率为 0.296。第 2 种策略
菌体最高 OD 为 24.5，平均比生长速率为 0.235 h-1，
得率为 0.241。两种情况比生长速率基本一致，但得
率有较大差别。第一种情况体积酶活为 62.99 U/mL，
比活为 16.4 U/mg DCW。第 2 种情况下体积酶活为
60.4 U/mL，比活为 6.63 U/mg DCW。得率不同，积
累的代谢副产物有机酸的量不同，因此两种不同得
率的情况酶活有较大差别。得率的高低和副产物的
0 5 10 15 20 25
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DL-ATC
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图 6 假单胞菌 F-12 5 g/L DL-ATC 指数流加发酵（策略 1）
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
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Fermentation timeh
Dissolved oxygen
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ATC
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g/LDL-ATC shot
图 7 假单胞菌 F-12 5 g/L DL-ATC 指数流加发酵（策略 2）
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第10期212
酸产量显著下降。pH 值小于 6.0 时，几乎没有 L-半
胱氨酸生成。pH9.0 转化合成半胱氨酸的量要大于
pH7.0，说明 Pseudomonas sp. F-12 在碱性条件下的
转化水平要优于中性及酸性条件。Pseudomonas sp.
F-12 最适转化 pH 值为 8.0（图 8-A），与此前文献报
道的冻融细胞最适转化 pH 一致［12，13］。
考察在 30、37、42、45℃条件下合成 L-半胱氨
酸的情况（图 8-B）。转化温度为 30 和 37℃时，L-
半胱氨酸产量呈持续上升趋势。转化温度为 42℃和
45℃时，L-半胱氨酸产量在 8 h 时达到最大值，随后
半胱氨酸转化量下降。分析原因为本试验使用静息
细胞，未经冻融，细胞内物质没有破裂渗出，细胞
内绝大多数酶在 30-37℃为最适转化温度，转化温
度在 42℃以上，超过细胞体内酶的耐受范围，因此
转化时间缩短且转化量较低。由前期试验可知冻融
细胞的最适转化温度为 42℃，本试验证明静息细胞
与冻融细胞在转化温度上有较大差别。
作用。
金属离子对转化过程有不同程度的激活或抑
制作用。试验考察了 Mg2+、Fe2+、Co2+、Al3+、Ca2+、
Zn2+、Ni2+、Mn2+ 对转化的影响（表 2）。过高金属离
子浓度会极大影响转化反应进行，而过低的浓度则
不能体现出金属离子的影响，目前已知报道中多以
浓度 0.1 mmol/L 为标准［14］。
相比较空白对照，Fe2+ 对转化反应的促进效果
最 显 著， 为 空 白 对 照 的 1.5 倍。Co2+、Zn2+、Ni2+、
Al3+ 等重金属离子对生物体往往具有毒性，这几种
金属离子对于 DL-ATC 转化 L-半胱氨酸具有明显抑
制作用。在 0.1 mmol/L 浓度下 Mn2+、Ca2+、Mg2+ 等
金属离子对转化反应影响不明显。
表 1 表面活性剂对 L-半胱氨酸合成的影响
表面活性剂 添加量（mL） 相对转化量（%）
对照（无表面活性剂） 0 100
氯仿 1 115
甲苯 1 716
吐温 80 1 90
CTAB 1 186
表 2 不同金属离子对 L-半胱氨酸合成的影响
金属离子 添加量（mmol/L） 相对转化量（%）
对照（无金属离子） 0 100
Mg2+ 0.1 84
Fe2+ 0.1 153
Co2+ 0.1 24
Al3+ 0.1 52
Ca2+ 0.1 84
Zn2+ 0.1 30
Ni2+ 0.1 27
Mn2+ 0.1 95
3 讨论
半 胱 氨 酸 在 工 业 具 有 广 泛 用 途， 日 本 微 生
物法已能实现工业化生产，其摩尔转化率能达到
100%。而我国微生物酶法仍处在实验室阶段。南开
大学刘忠等［15］以 DL-ATC 为唯一氮源筛选到假单
胞菌 TS1138，鉴定其产物为 L-半胱氨酸。怀丽华
等［16，17］采用 5 L 发酵罐对 TS1138 菌株的补料分批
发酵动力学及合成途径的代谢控制进行了研究。周
昌平等［18］对酶促反应条件进行探讨，菌体 42℃下
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
0 2 4 6 8 10 12
TimehCysteineg/L pH6.0 pH7.0 pH8.0 pH9.0 pH10.0
0.5
0.0
1.0
1.5
2.0
2.5
A
B
0 2 4 6 8 10
TimehCysteineg/L 30°C 37°C 42°C 45°C
图 8 转化液 pH 值（A）和温度（B）对 L-半胱氨酸合成
的影响
表面活性剂显著降低表面张力，改变细胞通透
性，使细胞内的酶系更易渗出，从而促进转化反应。
不同表面活性剂对转化反应作用不同（表 1）。甲苯
的促进效果最为显著，为空白对照的 7.16 倍，最高
摩尔转化率达到 93.3%。CTAB 的促进作用弱于甲苯，
产量达空白对照的 1.86 倍。氯仿对转化略有促进
2014年第10期 213赵婧楠等 ：Pseudomonas sp. F-12 发酵优化及转化合成半胱氨酸的研究
转化 2.5 h，产物的质量浓度可达 6 g/L。浙江大学吴
敏［19］等以假单胞菌酶法转化 DL-ATC 合成 L-半胱
氨酸，筛选到的菌株进行原生质体诱变后，最高转
化量为 10 g/L，摩尔转化率达到 76.5%。这些研究
仍然与工业化微生物法生产半胱氨酸具有较大差距，
因此优化发酵过程，提高产量、转化率和降低成本
具有深远意义。
在 本 试 验 中 Pseudomonas sp. F-12 分 批 发 酵 以
DL-ATC 为唯一碳氮源，DL-ATC 既可作为反应底物
也可作为酶活的诱导物，在发酵过程中能很快诱导
出转化的酶活体系。发酵过程中平均比生长速率达
到 0.305 h-1，比生长速率较高，酶活相对较高，说
明菌体活力能明显影响酶活。
两阶段发酵采用指数流加的方式控制菌体生长
阶段葡萄糖流加量，以葡萄糖作为限制性底物。结
果表明，Pseudomonas sp. F-12 细胞具有快速代谢葡
萄糖的能力，如葡萄糖浓度超过 2 g/L，其发酵液中
可检测到未知有机酸的存在。菌体在利用葡萄糖的
过程中，过多的葡萄糖会导致副产物积累。
静息细胞转化反应，通过渗透处理可以促使底
物进入细胞内与酶进行充分反应，同时也有利于转
化产物被运输到到细胞外。加入表面活性剂或有机
溶剂使得细胞渗透性增大，加快物质运输的能力。
本研究通过在转化过程中加入渗透剂，增加细胞通
透性，并且将细胞悬液置于摇床充分振荡，可有效
增加细胞与渗透剂的接触，提高转化量 7.16 倍以上。
在金属离子对于转化反应的影响过程中，可以在现
结果基础上采用不同浓度梯度金属离子进行转化。
提高 Fe2+ 离子浓度，测定其能促进反应的浓度范围。
降低 Co2+、Zn2+、Ni2+、Al3+ 离子浓度，测定抑制范围。
4 结论
研究了不同发酵策略对 Pseudomonas sp. F-12 发
酵生产 L-半胱氨酸的影响。分批发酵控制 DL-ATC
浓度在 15 g/L，最大体积酶活达到 148.1 U/mL。两
阶段发酵过程中，利用 15 g/L DL-ATC 进行诱导最
高体积酶活为 313.3 U/mL，提高酶活为分批发酵的
2.1 倍。利用 5 g/L DL-ATC 进行诱导最高体积酶活为
62.99 U/mL，最高比酶活为 16.4 U/mg DCW。较多代
谢副产物的情况下，酶活受到一定影响，说明代谢
产生的未知有机酸对于菌体诱导产生酶活有抑制作
用。考察了转化液 pH 值、浓度，转化温度，不同
渗透剂及金属离子等因素对于转化反应的影响。在
转化液 pH 8.0，加入 1 mL 甲苯的条件下，转化量提
高至原来的 7.16 倍，摩尔转化率达到 93.3%，是目
前国内报道的较高转化水平。
参 考 文 献
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（责任编辑 李楠）