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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(8):206-212
薯 蓣（Dioscorea opposite Thunb） 是 薯 蓣 科
（Dioscoreaceae）薯蓣属（Diosorea L.）单子叶缠绕藤
本植物，广泛分布于热带至温带地区，是西非、东
南亚和南美的主要粮食和经济作物。小花盾叶薯蓣
（Dioscorea parviflora C. T. Ting），又名苦良姜，是云
南省特有的薯蓣种类，主要分布于金沙江河谷流域。
收稿日期 ：2014-11-19
基金项目 ：国家自然科学基金项目（31101416），云南大学生命科学学院科学研究与人才培养开放基金项目（2013S205），云南省烟草公司
项目（2011YN60，2012YN10，2012YN36，2012YN13）
作者简介 ：张鹏远，男，博士研究生，研究方向 ：植物病毒及分子生物学 ；E-mail ：acception@yeah.net
通讯作者 ：王建光，男，博士，副教授，硕士生导师，研究方向 ：植物病毒学 ；E-mail ：jgwangyn@yeah.net
薯蓣褪绿坏死花叶病毒 CP 基因的原核表达及
抗血清的制备
张鹏远  任龙辉  王建光  陈壮壮  钟宇  陈穗云
（云南大学生命科学学院，昆明 650091）
摘 要 ： 薯蓣褪绿坏死花叶病毒（yam chlorotic necrotic mosaic virus，YCNMV）是马铃薯 Y 病毒科柘橙病毒属暂定成员。采
用 RT-PCR 方法，以 Sprimer/M4 简并引物对扩增获得的 YCNMV 分离物 3 端基因组序列为参考序列，根据该序列设计 CP 基因特
异引物获得 YCNMV CP 基因并插入 pET-30a 表达载体中，在 BL21（DE3）菌株中诱导表达。获得的融合蛋白经 Ni +-NTA 柱纯化后
免疫新西兰大白兔，制备抗血清。结果表明，连接在表达载体中的 CP 基因序列及表达的蛋白氨基酸序列与预期的 CP 基因核苷酸
和氨基酸序列同源性均为 99.65%。聚丙烯酰胺凝胶电泳结果表明，获得的融合蛋白大小约为 44 kD，与预期蛋白大小相符。制备
的抗血清经 Western blotting 和 ID-ELISA 检测表明，获得的多克隆抗体效价较高，能可靠、灵敏、特异地与 YCNMV 病毒颗粒结合，
可应用到该病毒的检测中。
关键词 ： 薯蓣褪绿坏死花叶病毒 ；外壳蛋白 ；原核表达 ；抗血清
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.08.030
Prokaryotic Expression of CP Gene of Yam Chlorotic Necrotic Mosaic
Virus and Preparation of Its Antiserum
Zhang Pengyuan Ren Longhui Wang Jianguang Chen Zhuangzhuang Zhong Yu Chen Suiyun
（School of Life Science，Yunnan University，Kunming 650091）
Abstract ： Yam chlorotic necrotic mosaic virus（YCNMV）is a new tentative species of genus Macluravirus in the family Potyviridae.
Referring to the 3-terminal sequence amplified with degenerate primers Sprimer/M4 by RT-PCR, we designed the specific primer pair of CP
gene of YCNMV. The PCR product of CP gene was inserted into the pET30a prokaryotic expression vector, which was subsequently expressed
in BL21（DE）strain by induction. Fusion protein was purified with Ni+ -NTA affinity column and was used to immunize New Zealand white
rabbits to produce the antiserum. Results showed that the CP gene ligated in the prokaryotic expression vector shared 99.65% homology with
the template CP gene in both nucleotide and protein sequence. SDS-PAGE results indicated that the CP fusion protein was about 44 kD in
size, which was in accord with the prediction. The antiserum was tested by both ID-ELISA method and Western blotting, which showed that the
polyclonal antibody had a relatively high level of titer, and reliably, sensitively and specifically bound with the YCNMV virus particles. These
results indicate that the antiserum is suitable for YCNMV detection.
Key words ： yam chlorotic necrotic mosaic virus ；coat protein ；prokaryotic expression ；antiserum
2015,31(8) 207张鹏远等：薯蓣褪绿坏死花叶病毒 CP基因的原核表达及抗血清的制备
因其薯蓣皂甙含量较高，具有较高的药用价值，近
年来，大量的小花盾叶薯蓣野生资源受到严重破坏。
为了提高商品价值，该品种在云南省已形成规模化
种植。但薯蓣常以营养繁殖方式连续多年进行栽
培，薯蓣病害发生严重，尤其以病毒病的发生更为
明显［1］。
薯蓣褪绿坏死花叶病毒（yam chlorotic necrotic
mosaic virus，YCNMV）是近年来从云南小花盾叶
薯蓣分离到的一个新病毒，属于马铃薯 Y 病毒科
（Potyviridae）柘橙病毒属（Macluravirus）成员［2，3］。
目前，柘橙病毒属共收录有 7 个病毒，其中 6 个确
定种，1 个暂定种，YCNMV 被国际病毒命名委员会
（ICTV）确定为该病毒属的暂定成员［3］。
国际上检测植物病毒主要从病毒生物学特征
（例如，病毒颗粒形态、长度、宿主范围及感病植株
症状等）、血清学以及分子生物学角度进行鉴别［4］。
但薯蓣样品常存在着复合侵染情况［5］，单纯从植物
病征难以进行准确有效的判断 ；同时，薯蓣叶片含
有大量的皂苷、多糖等物质，对 RNA 的提取技术及
成本要求较高，为该病毒的检测带来很多困难。因
此，为了能快速有效的检测该病毒及进一步确定该病
毒的分类学地位，本实验克隆 YCNMV 病毒的 CP 基
因，并通过基因工程的方法构建原核表达载体，获
得该病毒的 CP 融合蛋白，经免疫注射新西兰白兔
制备抗血清，旨在建立起相对敏感、特异、可靠的
血清学检测体系，为该病毒的检测提供帮助。
1 材料与方法
1.1 材料
实验用毒源由本实验室采自云南永胜县，并保
存于实验室无虫温室大棚内由专人负责管理与维护。
pET-30a 原核表达载体由本实验室保存于 -80℃冰箱；
DH5α 菌 株、BL21（DE3） 菌 株、rTaq 酶、Easysee
Western Marker 等购自北京全式金生物技术有限公
司 ；EcoR V、Hind III 内切酶以及 T4 连接酶等购自
Fermentas 公司 ；DL5000 Marker、质粒抽提试剂盒、
胶 纯 化 回 收 试 剂 盒、M-MLV Reverse Transcriptase、
Ribonuclease Inhibitor、IPTG、pMD19-T simple 克 隆
载体及 X-Gal、LA Taq DNA 聚合酶购自 TaKaRa 公
司 ；40% 丙烯酰胺购自北京鼎国生物公司 ；羊抗
兔 IgG 购 自 ABcam ；Tris-base、EDTA-Na2+、 甘 油、
Tryptone、Yeast extract 及透析袋等其他常用试剂均
购自 Sigma 公司 ；Ni-NTA+ Agarose 亲和纯化柱购自
QIAGEN 公司 ；引物由上海捷瑞生物工程有限公司
及 Invitrogen 上海合成部进行合成 ；菌液送南京金斯
瑞生物科技有限公司测序。
1.2 方法
1.2.1 薯蓣总 RNA 的提取及 cDNA 的合成 薯蓣
总 RNA 按照 RNeasy Plant mini（QIAGEN 公司）试
剂盒所述方法提取，以 NanoDrop 检测 OD260/280 并在
1.5% 浓度的变性琼脂糖凝胶电泳以确定提取 RNA
的 质 量， 符 合 标 准 的 样 品 于 -80℃ 冻 存 备 用。 以
M4T（5-GTTTTCCCAGTCACGAC（T）15-3）引物进
行反转录，共两步。反转录第一步体系如下 ：1 μL
M4T 引物 ；5 μL 模板 RNA（185 ng/μL）；共计 6 μL
反应液于 70℃孵育 10 min 后冰浴急冷 2 min。第二
步体系如下 ：6 μL 第一步反应液 ；2 μL 5×M-MLV
Buffer ；0.5 μL dNTP Mixture（10 mmol/L each）；0.25
μL RNase Inhibitor（40 U/μL）；0.5 μL M-MLV 反 转
录酶（200 U/μL）；0.75 μL RNase free ddH2O，以上
共计 10 μL 反应液，于 42℃反应 1 h，70℃反应 15
min，反应产物于 -80℃冰箱冻存。
1.2.2 pET30a-CP 原核表达载体的构建 根据前期
工作中以 Sprimer/M4 引物对［6］扩增获得的 YCNMV
病毒 3 端序列（数据未提供），由上海捷瑞生物工
程公司合成如下引物 ：CP-F ：5-GCAGATATCATGG
ATCTTACAGCGCCAG-3；CP-R：5-GCAAAGCTTTTA
ATATAAGGCTGGACGC-3（下划线部分分别为 EcoR
V 及 Hind III 酶切位点）。以稀释 10 倍后的 cDNA 为
模板，采用 TaKaRa 公司 LA Taq DNA 聚合酶按照
使用说明书上所述体系进行 PCR 扩增。扩增产物
经 1.5%（W/V）琼脂糖凝胶 100 V 电泳 60 min 分离
后，以 TaKaRa 公司胶纯化回收试剂盒精确切取目
的条带回收，具体操作参照试剂盒所述步骤进行。
纯化产物与 pMD19-T simple 按照说明书所述比例于
16℃过夜连接后转化 DH5α 感受态细胞，经蓝白斑
筛选及菌液 PCR 进行初步验证后，提取阳性单克隆
质粒送南京金斯瑞公司测序以验证质粒序列。将验
证序列无误的质粒及 pET-30a 空载体以 EcoR V 及
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.8208
Hind III 按说明书所述体系分别进行双酶切后纯化
回收目的片段与酶切后的 pET30a 载体，T4 连接酶
进行连接后，将 pET30a-CP 载体转化到 BL21（DE3）
感受态细胞，再经过菌液 PCR 及 pET30a-CP 质粒
测序验证无误后，获得含有 pET30a-CP 载体的表达
菌株。
1.2.3 CP 基因的诱导表达体系的优化及蛋白纯化
转化后的表达菌先以不同浓度 IPTG、不同诱导时间
进行诱导以摸索最佳诱导表达条件并对该融合蛋白
的溶解性进行分析。最终诱导表达产物经 10% SDS-
PAGE 电泳后，以考马斯亮蓝 G-250 染色检测结果。
诱导表达的蛋白使用 Ni+-NTA Agarose 亲和纯化柱进
行纯化后，分别以 70、100、200 和 300 mmol/L 咪
唑梯度洗脱，确定最佳洗脱条件。洗脱蛋白以透析
袋和 PBS 缓冲液（pH7.4）进行透析，透析蛋白经
NanoDrop 检测浓度及质量后冻存于 -80℃冰箱。
1.2.4 抗血清的制备、效价检测及 Western blotting
检测 纯化后的蛋白经过定量检测后，免疫 2 只新
西兰白兔（2-2.5 kg），每 2-3 周进行一次皮下免疫
（免疫抗原 400 μg/ 次），共免疫 4 次，待效价大于
1∶50 000 时进行采血制备抗血清，冻存于 -80℃冰
箱备用。获得的抗血清以 ABcam 公司的羊抗兔 -HRP
作为二抗，以 ID-ELISA 检测其效价（效价 = 样品
OD/ 空 白 OD≥2.1， 即 P/N≥2.1 时 的 最 高 稀 释 度，
包被抗原浓度 5 μg/mL，100 μL/孔），并通过 Western
blotting 检测其与抗原蛋白结合的特异性情况［7］。
1.2.5 样品植株的 ID-ELISA 检测 将样品叶片以
1∶10 000（W/V）的比例，以包被缓冲液 PBST 进
行稀释后，研磨，经短暂离心后取上清 100 μL/孔加
入到酶标板中，以制备的兔抗作为一抗，辣根过氧
化物酶标记的羊抗兔 IgG 为二抗进行 ID-ELISA 检测，
最后以 TMB 显色并测定 OD 值，计算 P/N。
2 结果
2.1 YCNMV CP基因的克隆及原核表达载体的构建
以 RNeasy Plant mini（QIAGEN）试剂盒可获得
高质量的总 RNA（图 1），可以用于后续试验。以设
计的 CP 基因特异引物 CP-F 及 CP-R 可扩增到 800
bp 左右的特异性条带，该条带与预期大小相符（图
2）。将该条带切胶纯化并插入到 pMD19-T simple 克
隆载体中，测序结果表明，该分离物 CP 基因核苷
酸序列为 867 nt，序列能通读，能正确翻译氨基酸
序列，连接在载体中的 CP 基因序列与预测的 CP 基
因核苷酸和氨基酸序列同源性均为 99.65%（图 3 和
图 4），即获得的 CP 基因序列与预期序列基本一致。
该克隆载体经双酶切后，将 CP 基因插入到 pET-30a
原核表达载体，测序结果表明，核苷酸序列与之前
测定序列一致。说明已成功构建了 YCNMV-CP 基因
的原核表达载体。
28S
M 1
18S
5S
M ：TaKaRa DL5000 DNA Marker ；1 ：RNA 样品
图 1 薯蓣总 RNA 样品琼脂糖凝胶电泳
5000
3000
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1000
750
500
250
100
M 1
M ：TaKaRa DL5000 DNA Marker ；1 ：CP 基因 RT-PCR 产物
图 2 CP 基因 RT-PCR 扩增产物琼脂糖凝胶电泳
2.2 YCNMV CP基因的原核表达及蛋白纯化
将成功构建的 pET30a-CP 原核表达载体转化
BL21（DE3）菌株进行诱导表达，初步确立诱导表
达体系为 0.8 mmol/L IPTG，以 28℃诱导 6 h，同时
分析融合蛋白的溶解性。SDS-PAGE 结果（图 5）表
明，表达的融合蛋白多数以包涵体的形式集中在沉
淀部分，而上清中仅存在相对较少的表达蛋白。诱
2015,31(8) 209张鹏远等：薯蓣褪绿坏死花叶病毒 CP基因的原核表达及抗血清的制备
导表达产物经离心后，上清液中的融合蛋白经 Ni+-
NTA 亲 和 层 析 柱 纯 化 后， 以 PBS 缓 冲 液（pH7.4）
进行透析，以 NanoDrop 检测，单次纯化蛋白浓度为
0.192-0.231 mg/mL。
2.3 抗血清效价检测及Western blotting检测
制备的抗血清通过 ID-ELISA 检测效价，结果表
明该抗血清在稀释 1∶256 000 时，P/N=2.2，表明该
抗血清效价为 1∶256 000，可以用于后续检测（表
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图 3 连接到 pMD19-T Simple 上的 CP 核苷酸序列与模板序列比对结果
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.8210
1）。Western blotting（图 6）分析表明，制备的抗体
仅与抗原蛋白产生特异条带，而免疫前血清（CK-）
在相同位置无条带。
2.4 不同地区薯蓣病叶样品的ID-ELISA检测
以制备的抗血清对采自云南省境内丽江、鹤庆、
维西、映华、禄丰及永胜等地共计 101 个表现出褪绿、
坏死等症状的薯蓣病叶样品研磨液进行 ID-ELISA 检
测（图 7）并测定其吸光度值。检测出映华（6 株）、
禄丰（2 株）及永胜（5 株）等 3 地共计 13 个样品
ID-ELISA 结果显示为阳性（P/N≥2.1）。筛选出的阳
性样品经电镜及 RT-PCR 检测后证实该样品内确实
含有 YCNMV 病毒。
3 讨论
薯蓣褪绿坏死花叶病毒（YCNMV）是近年来在
小花盾叶薯蓣中新发现的柘橙病毒属病毒，属于马
铃薯 Y 病毒科。目前仅见该病毒侵染薯蓣，尚未发
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图 4 载体中 CP 蛋白与模板 CP 蛋白氨基酸序列比对
44
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M L P S 1 2
M ：Low protein marker ；L ：表达菌裂解液 ；P ：沉淀 ；S ：上清 ；
1，2 ：纯化的蛋白样品
图 5 纯化蛋白溶解度及纯度的 SDS-PAGE 电泳分析
40
60
kD
M CK 1 2 3
M ：Easysee Western Marker ；CK ：免疫前血清 ；1-3 ：稀释 10 倍后的不同纯
化 CP 蛋白样品
图 6 CP 蛋白抗血清的 Western blotting 检测
表 1 ID-ELISA 抗血清效价测定结果
稀释梯度 OD/A450 稀释梯度 OD/A450
500 2.86 32×103 1.07
1×103 2.67 64×103 0.69
2×103 2.60 128×103 0.41
4×103 2.41 256×103 0.35
8×103 2.02 512×103 0.25
16×103 1.56 空白 0.16
2015,31(8) 211张鹏远等：薯蓣褪绿坏死花叶病毒 CP基因的原核表达及抗血清的制备
现该病毒侵染其他物种的报道，鲜见与该病毒相关
的其他研究报道。薯蓣是我国一种重要的药材，同
时也是深受群众喜爱的一种食材。因此近年来在云
南省大理、禄丰等多地已经形成规模化种植。但由
于薯蓣是多年生草本缠绕植物，常采用无性繁殖的
方式年复一年地进行种植，这为该型病毒的繁殖、
扩散提供了良好的条件，同时也对薯蓣的品质与产
量带来了不利影响。因此，构建针对该型病毒稳定、
可靠的血清学检测体系对后续检测、研发、抗病等
工作极为重要。
本实验以 RT-PCR 及克隆的方法，构建了含有
YCNMV CP 基因的原核表达载体。通过对该型病毒
CP 基因进行的序列比对及分析发现，该型病毒分
离物仅在 CP 蛋白 N 端第 17-19 位氨基酸残基中存
在与其亲缘关系较近的 Chinese yam necrotic mosaic
virus（CYNMV）中的“DKG”结构域相似的“SKG”
结构域［8］，该结构域是否也与先前报道的存在于
马铃薯 Y 病毒科中高度保守的“DAG”行使相同或
相似功能尚不得而知。其他保守序列，如“NGTS”
（140-143 aa） 及“AFDF”（217-220 aa）［9］ 均 在 该
型病毒 CP 蛋白中出现。
外源基因在大肠杆菌内进行原核表达时，由于
多种因素的存在，如短时间内形成高浓度多肽，导
致蛋白无法正确折叠等，极易使表达的蛋白形成包
涵体并沉淀［10］。这对后续的蛋白纯化工作造成了很
大影响，导致单次纯化的蛋白量大大减少。通过对
表达蛋白的溶解状态分析，以及不同诱导表达体系
的摸索，实验确立了优化后以较低温度（28℃）、较
长时间（6 h）及较高浓度 IPTG（0.8 mmol/L）进行
诱导表达的体系，促进了 CP 融合蛋白在大肠杆菌
内的可溶性表达。
在抗血清的制备方面，目前，通过电镜负染观
察已发现球状、杆状、线状等多种不同类型病毒复
合侵染同一株小花盾叶薯蓣的情况（数据未提供），
且对于含有大量多糖多酚类物质的植株来说很难提
纯病毒［11，12］。因此，以纯化病毒粒子来制备抗血清
的传统方案并不适用。目前，已有诸多通过表达病
毒 CP 基因融合蛋白免疫动物以制备抗血清的研究
报道［13-17］证明，该方法可靠、有效。本研究通过
进行 RT-PCR、构建原核表达载体、诱导 pET30a-CP
融合蛋白的表达及纯化、制备抗血清、后续检测筛
选等相关工作，成功制备出可用于检测 YCNMV 的
抗血清并应用到样品筛查中，为后续的研究奠定了
基础。
4 结论
通过构建原核表达载体的方法获得了能够正确
表达 YCNMV CP 基因的大肠杆菌表达菌株。该表达
菌表达的融合蛋白经纯化后免疫新西兰大白兔，制
备效价较高的抗血清，检测表明该抗血清可以有效
地检测到病样中的 YCNMV 病毒，初步建立起了可
用于检测 YCNMV 的 ELISA 检测体系。
参 考 文 献
［1］ 梁艳丽 , 赵庆云 , 杨燕 , 等 . 盾叶薯蓣细胞工程技术研究进
展［J］. 中国农学通报 , 2004, 20（4）：30-32.
［2］ Wang JG, Zou XJ, Zheng HY, et al. Molecular characterization of
a new macluravirus from yam in Yunnan, China［J］. Archives of
Virology, 2009, 154（8）：1379-1380.
［3］King AM, Adams MJ, Lefkowitz EJ, et al. Virus taxonomy ：
classification and nomenclature of viruses ：Ninth Report of the
International Committee on Taxonomy of Viruses［M］. San Diego ：
Elsevier, 2012.
1 2 3 4 5 Blank CK+ CK-
1-5 ：不同地点采集的薯蓣样品，其中 1 号样品检测为阳性，其余为阴性 ；Blank ：空白对照 ；CK+ ：
CP 纯化蛋白，阳性对照 ；CK- ：健康本氏烟叶片研磨液，阴性对照
图 7 不同地区样品的 ID-ELISA 检测结果
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.8212
［4］ 张京宣 , 曹秀芬 , 宋涛 , 等 . 植物病毒检测技术研究进展分
析［J］. 花卉中草药 , 2011（30）：79-80.
［5］李明军 , 张峰 , 陈明霞 , 等 . 怀山药病毒病的研究［J］. 中草药 ,
2004, 34（11）：3-5.
［6］Chen J, Adams MJ. A universal PCR primer to detect members of the
Potyviridae and its use to examine the taxonomic status of several
members of the family［J］. Archives of Virology, 2001, 146（4）：
757-766.
［7］Hirano S. Western blot analysis. In Nanotoxicity［M］. Totowa ：
Humana Press, 2012.
［8］Kondo T, Fujita T. Complete nucleotide sequence and construction
of an infectious clone of Chinese yam necrotic mosaic virus suggest
that macluraviruses have the smallest genome among members of the
family Potyviridae［J］. Archives of Virology, 2012, 157（12）：
2299-2307.
［9］Shukla DD, Ward CW, Brunt AA. The potyviridae［M］.
Wallingford ：Cab International, 1994.
［10］Vallejo LF, Rinas U. Strategies for the recovery of active proteins
through refolding of bacterial inclusion body proteins［J］.
Microbial Cell Factories, 2004, 3（1）：1-12.
［11］洪霓 , 王国平 , 于济民 , 等 . 苹果茎沟病毒的分离纯化及血清
学检测［J］. 中国农业科学 , 1997, 30（5）：6-12.
［12］洪霓 . 苹果褪绿叶斑病毒提纯及抗血清制备技术研究［J］.
中国果树 , 1999（1）：15-18.
［13］陈立伟 , 宗晓娟 , 王文文 , 等 . 樱桃病毒 A 外壳蛋白基因克隆
及其原核表达［J］. 中国农学通报 , 2012, 28（13）：195-199.
［14］王亚娇 , 任堂雨 , 刘艳 , 等 . 小麦矮缩病毒外壳蛋白基因的原
核表达 , 抗体制备及应用［J］. 植物病理学报 , 2013, 43（4）：
362-367.
［15］陈文华 , 韦传宝 , 贾玉成 , 等 . 大豆花叶病毒 CP 基因原核表
达与抗血清制备［J］. 生物技术通报 , 2009（10）：98-101.
［16］杨宇 , 韦传宝 , 华俊雅 , 等 . 大蒜 A 病毒 CP 基因的原核表达
及抗血清制备［J］. 生物技术通报 , 2011（7）：139-142.
［17］王洪星 , 龚殿 , 孙玉娟 , 等 . 高粱花叶病毒外壳蛋白的原核表
达及其抗血清制备［J］. 生物技术通报 , 2013（1）：167-171.
（责任编辑 马鑫）