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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(5):206-213
收稿日期 ：2014-08-14
基金项目 ：山东省科技发展计划（2011GGB01160）
作者简介 ：戴琨，女，硕士研究生，研究方向 ：微生物酶技术 ；E-mail ：daikun1989@126.com
通讯作者 ：王瑞明，博士，教授，研究方向 ：微生物酶技术 ；E-mail ：ruiming3k@163.com
乙酸对重组大肠杆菌 BL21 产酶的影响及作用机理研究
戴琨  王腾飞  郝昭程  汤丹丹  刘红娟  王瑞明
（齐鲁工业大学生物工程学院，济南 250353）
摘 要 ： 旨在研究发酵过程中产生的乙酸对重组大肠杆菌 BL21（DE3）/pET15b-TreS 的生长以及重组海藻糖合酶基因表达
的影响，并对其作用机理进行探讨。通过外源添加乙酸（钠）的方法，研究了乙酸钠对重组菌 BL21（DE3）/pET15b-TreS 生长曲
线的影响 ；利用环境扫描电子显微镜，观察了重组菌形态的变化情况 ；通过测定菌液的电导率值变化、菌液上清中 OD260 的变化，
研究了乙酸（钠）对菌体细胞膜渗透性、完整性的影响 ；通过测定菌液上清中 β-半乳糖苷酶的活性检测了乙酸钠对菌体细胞内膜
的影响 ；利用荧光分析法检测了乙酸对菌体膜蛋白构象的影响 ；采用 SDS-PAGE 电泳研究了乙酸钠对菌体重组海藻糖合酶表达量
的影响。结果表明，乙酸（钠）会对重组菌的生长产生一定的抑制作用，可以导致菌体细胞的表面出现凹陷、皱缩 ；并会影响细
胞膜的渗透性、完整性，使得一些细胞内容物发生泄漏 ；影响细胞膜上的膜蛋白构象，对膜的结构造成一定程度的破坏 ；对重组
海藻糖合酶的表达产生影响。乙酸（钠）对重组菌菌体的生长及重组海藻糖合酶基因的表达有影响，并且菌体细胞膜是其作用的
一个靶点。
关键词 ： 乙酸 ；重组大肠杆菌 ；抑菌机理 ；细胞膜 ；海藻糖合酶
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.05.032
Study on Effects of Acetic Acid on Enzyme Production of the
Recombinant Escherichia coli BL21 and Its Action Mechanism
Dai Kun Wang Tengfei Hao Zhaocheng Tang Dandan Liu Hongjuan Wang Ruiming
（Department of Biology Engineering，QILU University of Technology，Ji’nan 250353）
Abstract: Our objective is to study the effects of acetic acid from fermentation on the growth of the recombinant Escherichia coli BL21
（DE3）/pET15b-TreS as well as the expression of the recombinant trehalose synthase gene, and the action mechanism was also discussed.
Firstly, we studied the effect of acetic acid on the growth of recombinant Escherichia coli by experiments with adding acetic acid（sodium
acetate）, and observed the morphological changes of recombinant bacteria by using environmental scanning electron microscope. Then, the
effects of acetic acid（sodium acetate）on the permeability and the integrity of cell membrane were studied through the determination of
electrical conductivity of the broth and the changes of OD260 of the supernatant. The activity of β-galactosidase in the supernatant was measured
to determine the effect of sodium acetate on intracellular membrane, and then the influence of acetic acid on the conformation of membrane
protein by using fluorescence analysis were detected. Finally, the effect of sodium acetate on the expression of the recombinant trehalose synthase
gene by SDS-PAGE was studied. Results showed that the acetic acid（sodium acetate）could have certain inhibition effects on the recombinant
bacteria growth, and caused cell surface to be depressed and shrinkage. The permeability and integrity of cell membranes were affected by the
acetic acid（sodium acetate）, leading some substances in cells to leak out. And experiments also revealed that the acetic acid could make
effects on the conformation of the membrane protein in the cell membrane, which caused a certain degree of damages to the membrane structure.
SDS-PAGE analysis suggested that the sodium acetate had impacts on the expression of the recombinant trehalose synthase gene. The acetic acid
（sodium acetate）was confirmed to affect the cell growth and the expression of the recombinant trehalose synthase gene, and the cell membrane
was a target of its function.
Key words: acetic acid ；Recombinant Escherichia coli ；antimicrobial mechanism ；cell membrane ；trehalose synthase
2015,31(5) 207戴琨等：乙酸对重组大肠杆菌 BL21 产酶的影响及作用机理研究
目前，随着重组 DNA 技术与发酵培养技术的迅
速发展，利用基因工程菌获得所需产品的技术日趋
成熟。由于大肠杆菌具有遗传特性较清楚、易培养、
发酵周期短并能实现目的基因的高效表达等特性，
因而被广泛应用于基因工程菌的构建［1］。而重组菌
的高细胞密度发酵是获得高外源蛋白产量的一种重
要手段，能够提高单位时间单位体积的外源蛋白产
率，重组大肠杆菌的高密度培养一般指培养液中菌
体干细胞重量（dry cell weight，DCW）达 50 g/L 以上［2］。
利用重组大肠杆菌进行高密度发酵可以有效地提高
外源基因表达产物的产量，但是，大肠杆菌在进行
高密度发酵时会产生代谢副产物乙酸，Han［3］认为
细菌在低比生长速率条件下通过氧化代谢作用产生
的能量足以满足合成和异化作用的需求，不会产生
乙酸，而在高比生长速率时，大肠杆菌仅靠氧化代
谢不能提供足够的能量，必须通过乙酸生成途径储
备 ATP 和 NADH2。乙酸的生成需要两个关键性的酶，
磷酸转乙酰酶（Pta）和乙酰激酶（Ack），它们催化
葡萄糖代谢中从乙酰辅酶 A 生成乙酸的两步酶促反
应［4］。然而，乙酸的产生和积累不仅会影响菌体生长，
还会对菌体生长和重组基因的表达产生抑制［5］。
EL-Mansi［6］和 Luli［7］假设的乙酸抑制机理为 ：
乙酸在中性 pH 环境中以离子化（CH3COO
-）和质
子化（CH3COOH）两种形式存在，质子化的乙酸具
有弱的亲脂性可以穿过细胞质膜进入胞内，在胞内
（pH7.5）解离成 CH3COO
- 和 H+，这样就降低了膜内
的 pH 值，使膜内外的 pH 差（ΔpH）减小，减弱了
质子推动力，产生的能量就被大大减少了，扰乱了
细胞的正常代谢和生理活性。而阴离子增加了细胞
内部渗透压，并干扰甲硫氨酸的合成［8］。有试验证
明，培养时 pH 越低，乙酸未解离形式含量越高，
乙酸抑制作用就越强［9-10］。
此外，研究表明，乙酸会影响数种蛋白和基因，
特别是那些涉及大肠杆菌转录及翻译机制、一般应
激反应和调节的蛋白和基因［11］。而且，乙酸对产重
组蛋白的细胞抑制作用比对野生型的细胞抑制作用
更强［12］，同时细胞诱导表达蛋白后产生乙酸的临界
比生长速率更低［13］。
在利用重组大肠杆菌 BL21（DE3）/pET15b-TreS
进行高密度发酵生产海藻糖合酶的过程中，发酵液
中会有大量代谢副产物乙酸的积累，而且会影响海
藻糖合酶的酶活。根据这些检测结果，本研究采取
外源添加的方法，研究乙酸对重组大肠杆菌的生长
及外源海藻糖合酶基因表达的影响，并分析其对细
胞的抑制机理，包括对细胞膜、目的蛋白表达量的
抑制作用，旨在为了解发酵过程中乙酸对菌体作用
的机理，以控制培养条件，降低对菌体生长及产物
产量的影响。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验菌株 大肠杆菌 BL21（DE3）/pET15b-Tres
（本实验室构建菌种）。
1.1.2 培养基 LB 液体培养基（%）：酵母浸粉 0.5，
蛋白胨 1.0，NaCl 1.0。
M9 乳 糖 诱 导 培 养 基（%）：Na2HPO4·12H2O
1.72，KH2PO4 0.3，NaCl 0.05，NH4Cl 0.1，MgSO4 0.05，
CaCl2 0.001，乳糖 0.5。
β-半 乳 糖 苷 酶 反 应 缓 冲 液（%）：NaCl 0.8，
KCl 0.02，Na2HPO4·12H2O 0.29，KH2PO4 0.024，
MgSO4·7H2O 0.025，β-巯基乙醇 0.39。
氨苄青霉素（Amp）：50 mL 无菌水中加入 0.5 g
氨苄西林钠（0.5 g/ 瓶）。
其他试剂均为分析纯。
1.1.3 仪器 振荡培养箱（哈尔滨市东联电子技术
开发有限公司）；立式自动电热压力蒸汽灭菌锅（上
海申安医疗器械厂）；标准型净化工作台（苏州安泰
技术有限公司）；电子天平（上海天平仪器厂）；隔
水式恒温培养箱（上海亚荣生化仪器厂）；往复式水
浴恒温振荡器（江苏正基仪器有限公司）；DDS-11A
电导率仪（上海第二分析仪器厂）；紫外可见分光
光度计（北京普析通用仪器有限公司）；ChampGel5
500 生物电泳凝胶成像分析系统（SAGECREATION）；
F-4500 荧光分光光度计（日立）；5804R 高速冷冻离
心机（德国 Eppendorf 公司）。
1.2 方法
1.2.1 菌 种 的 活 化 培 养 配 制 LB 液 体 培 养 基 经
121℃灭菌 20 min 后，冷却，于培养基中加入 Amp（终
浓度为 100 mg/L）后接菌，37℃、180 r/min 的条件
下培养 24 h。取菌液在加有 Amp 的固体培养基上进
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.5208
行划线培养，挑取生长状况较好的单个菌落进行液
体培养基扩增。
1.2.2 对生长曲线的影响 取活化后的大肠杆菌
BL21（DE3）/pET15b-TreS 按 1% 的接种量分别接种
于 9 个 100 mL 加有 Amp 的 LB 培养基中，加入灭菌
的乙酸钠溶液，使其终浓度分别为 0、0.5、1、2、4、5、
10、20 和 30 g/L，于 37℃、180 r/min 的条件下培养，
并在不同的时间点取样测 OD 值，绘制生长曲线。
1.2.3 对细胞显微特征的影响 将培养至对数生长
期的重组菌于 5 000 r/min，4℃条件下离心 10 min，
弃上清，收集菌体，用无菌生理盐水洗涤 3 次，并
稀释至菌体浓度约为 107 CFU/mL。
取制备的重组菌菌悬液 20 mL，分别加入乙酸
（使其终浓度分别为 6.25 g/L 和 25 g/L）、乙酸钠溶液
（使其终浓度分别为 6.72 g/L 和 26.88 g/L），同时设
置无菌生理盐水对照组，37℃孵育 2 h。将对照组和
试验组的重组菌菌液离心收集菌体，洗涤后用 2.5%
的戊二醛于 4℃条件下固定 2 h 后涂片，使样品自然
风干。制备的样品用环境扫描电子显微镜观察重组
菌形态的变化情况。
1.2.4 对菌体细胞膜通透性的影响 将培养至对数
期的重组菌菌体，用无菌水稀释至菌液浓度为 107
CFU/mL，取稀释后的菌液 27 mL，加入 3 mL 抑菌
成分，分别为乙酸（终浓度分别为 ：3.125、6.25、
12.5 和 25 g/L）、乙酸钠（终浓度分别为：3.36、6.72、
13.44 和 26.88 g/L），同时设置无菌水对照组，置于
37℃恒温水浴振荡器中，然后分别在 0、10、20、
30、40、50 和 180 min 时测定其电导率值。
1.2.5 对菌体细胞膜完整性的影响 将培养至对数
期的重组菌菌体，用生理盐水稀释至菌体浓度为 107
CFU/mL 左右，取稀释后的菌液 45 mL，加入 5 mL
不同浓度的抑菌成分，分别为乙酸（终浓度分别为：
3.125、6.25、12.5 和 25 g/L）、乙酸钠（终浓度分别为：
3.36、6.72、13.44 和 26.88 g/L），并设置空白对照组，
然后置于 37℃恒温水浴振荡器中，分别在不同时间
点取样，并在 6 000 r/min 的条件下，离心 5 min，取
上清用紫外分光光度计测其在 260 nm 处的吸光值。
1.2.6 对细胞内膜的渗透性影响 培养重组菌至对
数生长期，取菌液 10 mL 进行离心，菌体用无菌生
理盐水洗涤两次，转移至 100 mL 的 M9 乳糖诱导培
养基中，于 37℃恒温振荡培养 10 h，然后离心，收
集菌体，用 β-半乳糖苷酶反应缓冲液重悬至 OD600
为 0.2 左右。
取 9 mL 反应缓冲液重悬的菌液，分别加入 1
mL 不同浓度的乙酸钠（终浓度分别为 ：3.36、6.72、
13.44 和 26.88 g/L） 混 匀，37 ℃ 孵 育 2 h 后 离 心 菌
体，取上清 4.5 mL，再加入 500 μL 1 mg/mL 的邻硝
基苯 -β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG），置于 37℃恒温
水浴中，孵育 2 h 后，于 420 nm 的波长下测其吸光
值［14］。
1.2.7 荧光分析法测乙酸对菌体膜蛋白构象的影
响 将重组菌培养至对数生长期，离心、洗涤菌体，
用生理盐水重悬，浓度约为 107 CFU/mL，分别在 5
mL 灭菌的 EP 管中加入 1 mL 的菌悬液，然后加入
1 mL 不同浓度的冰乙酸（乙酸的终浓度依次为 0、
3.125、6.25、12.5 和 25 g/L），于 37℃恒温水浴锅中
保温 1h 后，置于日立 F-4500 荧光分光光度计上进
行检测。
1.2.8 对蛋白质合成的影响 将重组菌培养至对数
生长期，按 1% 接种量分别接种于 100 mL 加 Amp
的 LB 液体培养基中，同时分别加入 0.1 g/L 灭菌的
乙酸钠溶液，使得乙酸钠的终浓度分别为 0.5、1、2、
3、4 和 5 g/L，并设置对照组，培养 8 h 后，加入乳
糖诱导，诱导 12 h 后，收集菌体，并进行洗涤，将
洗涤后的菌体用 pH7.4 的磷酸缓冲液悬浮至吸光值
相同，经超声破碎后离心取上清，进行 SDS-PAGE。
配制浓度为 5% 的浓缩胶和浓度为 12% 的分离胶进
行蛋白电泳，取上清液样品 20 μL 与 20 μL 上样缓
冲液混合，于沸水中煮沸 10 min 后，进行点样。
2 结果
2.1 对生长曲线的影响
在一定范围内，菌液的细胞浓度与吸光度值
（OD 值）成正比，试验中采用 OD600 来衡量重组大
肠杆菌的细胞密度。因此，通过测定 OD 值的变化
来间接地表示乙酸钠对重组菌生长的抑制情况。
乙酸根对重组大肠杆菌生长曲线的影响结果
（ 图 1） 显 示， 在 培 养 基 中 加 入 乙 酸 钠 对 BL21
（DE3）/pET15b-Tres 的生长会产生影响，菌体的生
长明显受到抑制，使得菌体生长的延滞期延长，且
2015,31(5) 209戴琨等：乙酸对重组大肠杆菌 BL21 产酶的影响及作用机理研究
抑制作用随浓度的增大而增强，而乙酸钠浓度为 0.5
g/L 时，对菌体生长的抑制较弱，其他浓度下，0-6
h 内，生长较缓慢。在 6 h 之后，较低浓度（乙酸钠
浓度低于 5 g/L）下，菌体生长受到的抑制减弱，而
在较高浓度（乙酸钠浓度为 10、20 和 30 g/L）下，
菌体生长被严重抑制，生长依然缓慢。
子运动速率降低，电导率也降低。相同浓度的菌液
加入不同浓度的乙酸钠后，电导率也变得不同，浓
度为 13.44 g/L 时，电导率最大。浓度继续升高电导
率先降低后升高，可能是由于电解质解离程度高使
得乙酸根由于外界压力进入细胞内部，导致其先下
降，而其他浓度的乙酸钠加入后，会使得电导率有
所升高，这说明乙酸根导致了细胞膜的通透性发生
变化，内容物电解质泄露到胞外，其电导率的变化
程度相差不大。而图 3-B 显示，加入乙酸后，菌液
的电导率均升高，初始电导率随浓度的增大而增大，
升高程度也随浓度增大而略有增大，说明细胞膜的
破坏程度略有增加。
2.4 对菌体细胞膜完整性的影响
通过测定经不同处理后的菌液上清在 260 nm 处
的吸光度值变化推测菌体细胞膜的完整性变化情况。
0
1
2
3
4
0 2 4 6 8 10 12 14
O
D
60
0 ᰦ䰤h0 g/L 0.5 g/L 1 g/L 2 g/L 4 g/L5 g/L 10 g/L 20 g/L 30 g/L
图 1 不同浓度乙酸钠对重组菌生长曲线的影响
2.2 对细胞显微特征的影响
经电子显微镜观察对照组的重组大肠杆菌的形
态，如图 2 中 A-1、A-2 所示，其细胞形态比较完整、
饱满。而试验组中用不同浓度的乙酸、乙酸钠处理
过的重组菌，形态发生了不同的变化。其中，用浓
度为 6.25 g/L 和 25 g/L 的乙酸处理过的菌体形态如
图 2-B、2-C 所示，用浓度分别为 6.72 g/L 和 26.88 g/L
的乙酸钠溶液处理过的菌体形态如图 2-D、2-E 所
示。图 2-B 显示，菌体基本形态没有较大变化，只
出现较小的褶皱，而图 2-C 中显示菌体出现皱缩，
菌体的形态受到较大影响。乙酸钠处理后的细胞
（图 2-D、2-E）显示，细胞会发生凹陷，随着乙酸
钠浓度的增大，细胞受损情况加重。
2.3 对菌体细胞膜通透性的影响
通过测定菌液电导率的变化可以反映细菌细胞
膜通透性的变化情况。重组菌经不同浓度的乙酸、
乙酸钠处理后其菌液电导率的变化情况（图 3-A）
表明，菌体加入无菌水的空白对照组电导率很低，
而且变化不大，而实验组加入不同浓度的乙酸钠后，
菌液的电导率发生了不同的变化。乙酸钠是一种强
电解质，强电解质溶液的电导率随着浓度的增加而
升高，当浓度增加到一定程度后，解离度下降，离
A-1 A-2
B C
D E
A-1，A-2 ：对照组 ；B ：6.25 g/L 的乙酸处理试验组 ；C ：25 g/L 的
乙酸处理试验组 ；D ：6.72 g/L 的乙酸钠处理实验组 ；E ：26.88 g/L
的乙酸钠处理试验组
图 2 环境扫描电子显微镜观察乙酸（钠）对重组菌形态结
构的影响
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.5210
重组菌经不同浓度的乙酸（钠）处理后菌液上清的
OD260 变化情况（图 4-A）表明，空白对照组的菌
液上清 OD260 没有升高，且变化较小，而实验组的
OD260 变化比较大，且高于对照组，说明实验组的菌
体细胞膜完整性受到影响，有 DNA 等物质的泄露 ；
由于乙酸钠是强电解质，浓度太高会抑制其电解率，
而浓度为 26.88 g/L 和 6.72 g/L 时，趋势相似，变化
程度接近，推测其电解率相近。而浓度为 13.44 g/L
和 3.36 g/L 时，OD260 值变化不大；浓度为 13.44 g/L 时，
可能是由于乙酸钠的电离及乙酸根的水解程度较
大，会有大量的质子化的乙酸根进入细胞，对膜的
完整性影响较小，而浓度为 3.36 g/L 时，浓度较低
则对膜完整性的影响较小。乙酸添加情况（图 4-B）
表明，前 200 min，变化情况较复杂，无明显的趋势，
之后可以看到试验组的 OD260 高于对照组，且随浓
度增大而升高，说明乙酸会影响菌体细胞膜的完整
性，导致 DNA 等大分子物质的泄露，且随浓度升高
作用增强。
2.5 对细胞内膜的渗透性影响
通过测定菌液上清中的 β-半乳糖苷酶的活性，
来检测胞内大分子渗透至胞外的情况，进而说明细
胞内膜的受损情况。菌液添加乙酸钠作用后，离心
菌体，取上清测定 β-半乳糖苷酶的酶活性，结果（图
5）显示，加入乙酸钠作用于菌体后，上清中 β-半乳
糖苷酶的酶活高于对照组，说明乙酸根对于细胞内
膜有一定的破坏作用，导致 β-半乳糖苷酶渗漏到胞
外，而不同浓度的乙酸钠对其作用效果相差不大。
2.6 荧光分析法测乙酸对菌体膜蛋白构象的影响
通过荧光分析法检测乙酸对菌体上的膜蛋白及
细胞膜结构的影响，结果（图 6）表明，KI 作用后，
荧光强度降低，说明能与细胞膜表面的蛋白质色氨
酸 Trp 残基结合，同时荧光强度逐渐降低，由此可
以推断，色氨酸 Trp 残基位于细胞膜的表面和内部，
当细胞膜结构发生变化时，膜内部的 Trp 残基就会
暴露出来与 KI 结合。图 7 结果显示，随着乙酸浓度
的增大，Trp 残基的荧光强度相应的依次减少，表明
乙酸对 Trp 的荧光特性具有淬灭作用。而激发峰的
0
1
2
3
4
5
6
7
0 50 100 150 200
⭥ሬ⦷μs·cm×103 ᰦ䰤/minオⲭሩ➗ 1 2 3 4
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1.0
A
B
0 50 100 150 200
⭥ሬ⦷μs·cm×103 ᰦ䰤/minオⲭሩ➗ 5 6 7 8
1-4 ：分别对应乙酸钠浓度为 26.88、13.44、6.72 和 3.36 g/L ；5-8 ：分别对
应乙酸的浓度为 25、12.5、6.25 和 3.125 g/L
图 3 不同浓度乙酸钠（A）及乙酸（B）对菌体细胞膜通
透性的影响
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0 100 200 300 400 500 600
O
D
26
0 ᰦ䰤/minオⲭ 1 2 3 4
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
A
B
0 100 200 300 400 500 600ᰦ䰤/minOD 260 オⲭ 5 6 7 8
1-4 ：分别对应乙酸钠浓度为 26.88、13.44、6.72 和 3.36 g/L ；5-8 ：分别对
应乙酸的浓度为 25、12.5、6.25 和 3.125 g/L
图 4 不同浓度乙酸钠（A）及乙酸（B）对重组菌细胞膜
完整性的影响
2015,31(5) 211戴琨等：乙酸对重组大肠杆菌 BL21 产酶的影响及作用机理研究
位置和图形基本上没有变化，这表明乙酸能够改变
细胞膜的结构，使位于细胞膜内的 Trp 残基暴露于
细胞膜外。
的表达量会增大，推测是由于乙酸根进入胞内，会
作为碳源参与到菌体的代谢中，因而其表达量增大，
但随着浓度的继续增大，乙酸的抑制作用也会表现
出来，海藻糖合酶的表达量则随着乙酸钠浓度的增
大而减小，说明乙酸钠会对海藻糖合酶的表达产生
抑制。
0.8
0.9
1.0
1.1
1.2
1.3
1.4
0 50 100 150 200
O
D
42
0 ᰦ䰤/minオⲭ 1 2 3 4
1-4 ：分别对应乙酸钠的浓度为 26.88、13.44、6.72 和 3.36 g/L
图 5 乙酸钠对细胞内膜通透性的影响
1300
1200
1100
1000⴨ሩᕪᓖ 900800700600
500
400
300
200
100
0
350 400 450⌒䮯nm
KI 的浓度由上到下依次为 ：0、0.01、0.02、0.05 和 0.1 mol/L
图 6 KI 对重组菌膜蛋白荧光特性的影响
1300
1200
1100
1000
900
800
700
600
500
400
300
200
100
0
350 400 450⌒䮯nm⴨ሩᕪᓖ
添加乙酸的浓度由上到下依次为 ：0、3.125、6.25、12.5 和 25 g/L
图 7 乙酸对重组菌膜蛋白荧光发射强度的影响
120
kD
1 2 3 4 5 6 7 M
100
80
60
50
40
30
20
12
海藻糖合酶
M：标准蛋白；1-7：分别对应加入乙酸钠的浓度为 0、0.5、1、2、3、4 和 5 g/L
图 8 乙酸钠作用后的重组菌蛋白 SDS-PAGE 电泳图谱
3 讨论
在利用重组大肠杆菌进行高密度发酵的过程中，
发酵液中会有代谢副产物乙酸的积累，乙酸的存在
抑制工程菌的生长及外源基因的表达［15］。乙酸对重
组大肠杆菌的抑制作用已有报道，本研究根据实验
中出现的这一现象，进行了更加深入的理论基础研
究，对乙酸的抑制作用机理进行了探讨。
研究中发现，在加入乙酸钠的环境中，菌体会
出现一定的适应期，较低浓度（0.5、1 和 2 g/L）的
乙酸钠对菌体影响较小，并且可能是由于质子化的
乙酸根进入细胞后，可以作为碳源参与到细胞内的
代谢中，供菌体生长所用，所以会对菌体生长稍有
促进 ；而在较高乙酸钠浓度下，菌体细胞或其代谢
过程可能会被破坏，因而菌体生长受到严重抑制。
本研究首先研究了乙酸、乙酸钠对重组大肠杆菌细
胞形态及显微特征的影响，发现菌体会发生皱缩或
者凹陷，有些菌体周围可以看出类似发生了内容物
的外泄，这可能是由于乙酸、乙酸钠引起了菌体细
胞膜的破坏，进而导致了菌体形态的变化甚至内容
物的外泄。
根据上述现象，通过实验进一步研究了乙酸、
2.7 对蛋白质合成的影响
图 8 显示，加入低浓度的乙酸钠，海藻糖合酶
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.5212
乙酸钠对于菌体细胞膜的影响，细菌的细胞膜具有
一定的流动性，当细菌细胞膜遭到破坏，使得其半
透性及流动性降低时，细胞的内环境稳定性会被破
坏，从而导致内部的电解质（如 K+）外渗，培养液
的电导率上升［16］。细菌细胞膜是细菌的结构组分，
不仅是细胞的保护屏障，也是在细胞的生命活动中
有着复杂功能的重要结构。当细胞膜遭到破坏时，
首先细胞内的小分子物质外渗出来，然后是 DNA 和
RNA 等一些大分子的外渗，而 DNA 和 RNA 在 260
nm 处有强吸收，因此，对 260 nm 吸收物质的检测
被广泛应用于测定细胞膜的完整性［17］。测定处理后
菌液电导率的变化反映了细菌细胞膜通透性的变化，
通过测定处理后菌液上清在 260 nm 处的吸光度值变
化推测菌体细胞膜的完整性变化，而这两个实验结
果比较复杂，分析可能涉及到乙酸、乙酸钠的解离
和水解问题，但结果说明菌体细胞膜的通透性与完
整性都会受到一定的影响。
细菌在受到乳糖诱导后均可产生 β-半乳糖苷酶，
β-半乳糖苷酶是位于细胞内的水解酶，能使乳糖水
解成半乳糖和葡萄糖。邻硝基苯 β-D-半乳吡喃糖
苷（ONPG）是乳糖的类似物，β-半乳糖苷酶可以将
ONPG 水解成半乳糖和黄色的邻 - 硝基苯酚，因此
可以通过颜色的变化测知 β-半乳糖苷酶的活性［18］。
实验通过测定菌液上清中的 β-半乳糖苷酶的活性，
来检测胞内大分子渗透至胞外的情况，进而说明细
胞内膜的受损情况，不同浓度的乙酸钠对其作用后
会有影响，但差别较小。
蛋白质分子中因含有色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）
和苯丙氨酸（Phe）等氨基酸残基而产生内源性荧
光。在大多数情况下，可以认为蛋白质所显示的荧
光主要来自色氨酸残基，其变化直接反映了蛋白质
中色氨酸残基本身及其周围环境的变化。当某些小
分子如药物等物质与蛋白质结合时，导致其荧光强
度下降，称为荧光淬灭作用［19］。根据 Trp 的激发波
长 Ex，固定 Ex，通过日立 F-4500 荧光分光光度计
在 310-450 nm 范围内扫描即可确定 Trp 在重组大肠
杆菌膜蛋白中的发射波长 Em。
为了确定 Trp 在重组大肠杆菌膜中的位置，需
要将猝灭剂 KI（1 mol/L）稀释成不同浓度（0、0.01、
0.02、0.05 和 0.1 mol/L）加入，检测对 Trp 发射波长
Em 的峰位和峰高的影响。如果 Em 迅速降低，则表
明该氨基酸残基位于表面，如果 Em 变化不大，则
表明该氨基酸残基位于膜内，如果 Em 逐渐降低，
就表明该氨基酸残基的位置有两种可能，可能是在
膜内也有可能是在膜外［20］。结果表明乙酸能够改变
细胞膜的结构，使位于细胞膜内的 Trp 残基暴露于
细胞膜外。这个结论比较明确地说明了乙酸会对细
胞膜产生影响，进而影响其功能。
在研究乙酸钠对蛋白合成的影响时，可以看到
明显的趋势，低浓度下乙酸钠的添加会促进海藻糖
合酶的表达量，而高浓度的乙酸钠又会起到抑制作
用。其原因可能是乙酸根会影响 DNA 的复制或表达，
也可能是乙酸钠使菌体细胞膜受到损坏，导致一部
分酶发生了外泄造成的。
在研究过程中，采用的是菌液中外源添加乙酸、
乙酸钠的方法，由于乙酸在溶液中的存在形式有乙
酸分子形式及乙酸根形式，则试验中分别对两种形
式进行了研究，添加乙酸、乙酸钠至所需的浓度后，
菌液的 pH 变化与对照组相差较小，因此主要考虑
了乙酸、乙酸根的影响。
据已有的研究表明，某些抑菌剂可与细菌染色
体 DNA 发生相互作用，导致 DNA 的复制、转录以
及表达受到抑制［21，22］。本试验中乙酸会影响海藻
糖合酶的表达量，这可能是由于乙酸对胞内 DNA、
RNA 等产生抑制作用直接影响其表达量，也可能是
由于随着乙酸浓度的增大，重组菌细胞的通透性、
结构等发生变化，导致部分蛋白发生泄露，因而影
响了目的蛋白的含量。具体的机制还需要今后做进
一步研究，进行验证。
4 结论
根据发酵过程中的检测初步研究了乙酸（钠）
对重组大肠杆菌的抑制作用及部分作用机理。通过
外源添加乙酸（钠）的方法，对重组菌的生长曲线、
细胞膜通透性、细胞膜结构、细胞超微结构、蛋白
表达等方面进行了研究，结果表明，乙酸（钠）作
用于重组菌后，可使其生长受到抑制，且随浓度的
不同而发生变化 ；细胞膜的通透性会有所增加，细
胞膜的完整性及膜的结构受到破坏，导致部分细胞
内容物发生泄露 ；菌体正常形态发生变化 ；重组海
2015,31(5) 213戴琨等：乙酸对重组大肠杆菌 BL21 产酶的影响及作用机理研究
藻糖合酶的表达受到影响。
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）