全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(7):193-200
糖化酶，又称葡萄糖淀粉酶［Glucoamylase，系
统命名为淀粉 α-1，4- 葡聚糖葡萄糖水解酶，α-1，
4-Glucanglucohydrolase（EC.3.2.1.3）］， 是 一 种 具 有
外切活性的酶，它能把淀粉、糊精、糖原等从非还
原性末端水解 α-1，4- 葡萄糖苷键，而得到终产物 β-D-
葡萄糖，也能缓慢水解 α-1，6- 葡萄糖苷键或 α-1，
3- 葡萄糖苷键，转化为葡萄糖［1-3］。糖化酶在工业
上具有重要的用途，例如，低热量啤酒的酿造，酒
精工业中谷物的水解，淀粉糖工业中生产葡萄糖、
高葡萄糖糖浆，农用化学品及药物合成等［4-6］。糖
化酶来源广泛，已报道的产糖化酶真菌有 23 个属，
35 个种，细菌有 3 属 3 种［7］。由于黑曲霉能几乎
100% 水解淀粉产生葡萄糖，其产生的糖化酶转苷酶
活性较低［8］。因此，工业生产用的糖化酶主要来自
收稿日期 ：2014-10-21
基金项目 ：“十二五”基础前沿专项（Y1J4061201）
作者简介 ：张 亮，男，硕士研究生，研究方向 ：生物工程 ；E-mail ：929850607@qq.com
通讯作者 ：花尔并，男，博士，教授，研究方向 ：药物合成，E-mail ：huarb@tust.edu.cn ；王华明，男，博士，教授，研究方向 ：新型工业
酶及表达系统，E-mail ：wang_hm@tib.cas.cn
粉红黏帚霉糖化酶基因的克隆、表达及酶学性质分析
张亮1，2  花尔并1  王华明2
（1. 天津科技大学生物工程学院，天津 300457 ；2. 中国科学院天津工业生物技术研究所，天津 300308）
摘 要 ： 用黑曲霉（Aspergillusniger）G1 为宿主菌表达粉红黏帚霉（Gliocladiumroseum）糖化酶。运用 PCR 技术从粉红粘帚
霉中扩增得到一个疑似糖化酶基因序列（约 1.8 kb），并将其连接到载体 pGm 上组建成重组质粒 pGm-3440。将重组质粒转化到黑
曲霉 G1 菌株中，经 amdS 筛选及 PCR 验证获得表达糖化酶的黑曲霉重组工程菌。重组菌的发酵结果显示，糖化酶基因在黑曲霉中
得到了分泌表达，用国标法（QB/T 1803-1993）测得重组糖化酶活性达 292 U/mL。进一步对其酶学性质进行分析发现，该重组酶
最适温度和 pH 分别为 50℃和 5.0，该酶的耐热性较差，pH 稳定性较好。
关键词 ： 糖化酶 ；粉红黏帚霉 ；黑曲霉 G1 ；分泌表达
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.07.029
Cloning，Expression and Characterization of Glucoamylase from
Gliocladium roseum
Zhang Liang1，2 Hua Erbing1 Wang Huaming2
（1. College of Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457 ；2.Tianjin Institute of Industrial Biotechnology，
Chinese Academy of Sciences，Tianjin 300308）
Abstract: Glucoamylase from Gliocladium roseum was secretively expressed in Aspergillus niger G1 strain. A putative glucoamylase gene
（about 1. 8 kb）was amplified by PCR using genomic DNA of G. roseum as template. The amplified products were ligated into the clone vector
pGm to construct recombinant plasmid pGm-3440. The recombinant plasmid transformed into A. niger G1 strain, and amdS screening and PCR
validation confirmed that an engineering Aspergillus strain of expressing glucoamylase was obtained. Fermentation of recombinant strain indicated
that secretive expression of the glucoamylase gene was available in A. niger, and its enzyme activity was measured by method defined in national
standard（QB/T 1803-1993）, and it reached 292 U/mL. Further enzymatic analysis demonstrated that the optimum pH and temperature for the
recombinant enzyme were 5. 0 and 50℃, respectively. Meanwhile, it had poor thermal resistance, but promising pH stability.
Key words: glucoamylase ；Gliocladium roseum ；Aspergillus niger G1 ；secretive expression
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.7194
于黑曲霉。近些年，科学家们对糖化酶的研究主要
集中在新基因、固定化、耐热机制、基因的调控转
录及糖化酶的新应用等方面［9-11］。
黑曲霉是一种酶系丰富、代谢产物复杂的丝状
真菌。黑曲霉表达系统具有优于大肠杆菌表达系统
和酿酒酵母表达系统的独特优点。大肠杆菌在高表
达外源蛋白时容易形成包涵体，缺少真核细胞的一
些翻译后的修饰，其表达产物往往不具有生物活性，
且包涵体的分离纯化也比较困难。酿酒酵母分泌蛋
白的能力较弱，且往往会过度糖基化，表达真核生
物蛋白通常没有活性。黑曲霉具有较强的蛋白质分
泌能力，并具有与哺乳动物相似的糖基化修饰系
统，可以对表达的蛋白进行正确的翻译后加工与修
饰［12，13］。另外，黑曲霉已被美国政府认定为食品药
品的安全生产菌株，其发酵工艺及下游分离纯化技
术已相当成熟［14］。因此，黑曲霉作为一种重要生产
菌株被广泛用于发酵工业。已报道的黑曲霉产品包
括柠檬酸、葡糖酸、没食子酸、蛋白酶及淀粉酶等。
粉红黏帚霉（Gliocladiumroseum）异名粉红螺
旋聚孢霉（Clonostachysrosea），是一种重寄生真菌
（hyperparasites），能够寄生于其它真菌而营寄生生
活。由于粉红黏帚霉能有效地抑制病原真菌的繁殖，
自 20 世纪 90 年代发现以来粉红黏帚霉主要被用作
植物病原菌的生防菌［15-17］。目前国内外对粉红黏帚
霉的研究主要在其寄生机理以及植物病害的防治效
果上，对其基因的克隆研究较少，尚未见有粉红黏
帚霉糖化酶基因的研究报道。本研究首次将来源于
粉红黏帚霉的糖化酶基因在黑曲霉 G1 中进行重组
表达，并以酶活性高低和酶学性质为指标，旨在获
得一种酶活性高、耐热性强、生产成本低、有重要
应用价值的新型糖化酶。
1 材料与方法
1.1 材料
菌株大肠杆菌 DH5α 感受态购自北京全式金生
物技术有限公司 ；粉红黏帚霉、黑曲霉 G1 为本实
验室保藏。本研究所采用的黑曲霉 G1 宿主菌为糖
化酶 glaA 基因和蛋白酶 pepA 基因双敲除的菌株。
穿 梭 载 体 pGm 图 谱 如 图 1 所 示， 共 计 8 982
bp，其上有来源于黑曲霉的糖化酶强启动子 PglaA，
来源于塔宾曲霉的终止子 TglaA，并含有氨苄青霉
素和乙酰胺选择性标记，3 个常用的酶切位点 Xba I、
Pac I 和 Xho I。
pUC100
pGm
8 982 bp
A. tubingensis TglaA
A. niger PglaA
amdS
Xba I2038Xba I1989
图 1 穿梭载体 pGm 图谱
酶 和 试 剂 ：PhusionDNA 聚 合 酶 购 自 赛 默 飞
世 尔 科 技 公 司，Xba I、Xho I 限 制 性 内 切 酶、Gel
Extraction Kit、Plasmid Kit、T4 连接酶购自 Fermentas
公司，Fungal DNA Kit 购自 OMEGA 公司，预制蛋
白胶购自英潍捷基（上海）贸易有限公司，酵母膏、
蛋白胨购自 OXOID 公司，裂解酶、乙酰胺、氨苄青
霉素购自 Sigma 公司，其余试剂为国产分析纯。
培养基与溶液 LB、CMA、amdS 筛选培养基［18］、
MMSA、CSL、PromosoySpecial Medium 发酵培养基、
Solution A、Solution B、Solution C、裂解液、微量元素。
粉 红 黏 帚 霉 全 基 因 组 测 序 工 作 由 编 号 为
11ZCZDSY08300 的天津市工业微生物基因组解析项
目完成，序列暂未公开。本实验所用的启动子为黑
曲霉糖化酶强启动子，诱导物为麦芽糖，该麦芽糖
存在于发酵培养基中。
1.2 方法
1.2.1 糖化酶基因在粉红黏帚霉全基因组中的挖
掘 用序列比对的方法将黑曲霉糖化酶（GenBank
编号 XP_001390530.1）序列与粉红黏帚霉全基因组
预测蛋白序列进行比对，获取相似性较高的序列。
将相似性较高的序列在 NCBI 数据库中进行 BLAST
比对分析，并用 SignaIP 分析信号肽，最终确定要克
隆的糖化酶基因 g3440。
2015,31(7) 195张亮等 ：粉红黏帚霉糖化酶基因的克隆、表达及酶学性质分析
1.2.2 糖 化 酶 基 因 g3440 的 克 隆 以 粉 红 黏 帚
霉 全 基 因 组 DNA 为 模 板 进 行 PCR 扩 增 获 得 目 的
基 因，PCR 过 程 所 用 到 的 引 物 分 别 为 ：上 游 引
物 5-CCGCTCGAGAGGATGGTGAAGATAATTC
CCACTGTGC-3，下游引物 5-TGCTCTAGATCATCG
CCAGTTATCATTAGTCGAG-3，下划线处表示 Xho I、
Xba I 两限制酶酶切位点。PCR 反应体系为 20 μL ：
5×Phusion HF Buffer 4 μL，dNTP（10 mmol/L）0.4
μL，上下游引物（100 μmol/L）各 0.4 μL，基因组 1
μL，PhusionDNA polymerase 0.2 μL，Milli-Q H2O 13.6
μL。反应条件 ：98℃预变性 30 s ；98℃变性 10 s，
72℃延伸 1 min，30 个循环 ；72℃延伸 10 min。1%
琼脂糖凝胶电泳检测目的扩增产物。
1.2.3 重组表达载体的构建 用胶回收试剂盒纯化
PCR 产物，纯化后的 PCR 产物及 pGm 载体用 Xho I、
Xba I 限制性内切酶进行双酶切，回收目的基因片段
及载体片段进行连接，连接产物转化感受态大肠杆
菌 DH5α，经 Amp 抗性筛选阳性克隆，提取质粒，
进行菌落 PCR 鉴定。鉴定正确后，委托英潍捷基（上
海）贸易有限公司进行测序。将测序正确的质粒命
名为 pGm-3440。
1.2.4 黑曲霉原生质体的转化及筛选 将黑曲霉 G1
孢子在 CMA 液体培养基中 30℃、200 r/min 条件下
培养过夜。用无菌滤布收集菌体并用 Solution A 冲
洗，转移菌体至 40 mL 裂解液（40 mL Solution A 中
加 0.6 g 裂 解 酶 ） 中，30℃、200 r/min 裂 解 2-3 h。
过滤并用两个无菌 50 mL 离心管收集原生质体，每
管加 Solution B 至 25 mL，4 000 r/min、5 min，弃上清；
每管加 25 mL Solution B，4 000 r/min、5 min，弃上清；
合并两管，加 20 mL Solution B，4 000 r/min、5 min，
弃上清。加 10 μL DNA、12.5 μL Solution C、100 μL
原声质体，冰浴 20 min。取出，加 1 mL Solution C、
2 mL Solution B，9 mL MMSA 上层培养基，混匀倒
入平板 MMSA 中，培养 7-10 d 直至长出转化子。用
amdS 筛选培养基进行转化子筛选，将转化子进行基
因组提取并进行 PCR 鉴定及测序鉴定，鉴定正确的
菌株即为重组黑曲霉菌株。
1.2.5 重组菌的发酵验证 挑取重组黑曲霉菌株，
接种于 20 mL 发酵培养基中，30℃、200 r/min 培养
5 d，14 000 r/min 离心 10 min 收集上清液。取 30 μL
上清液，加 10 μL 4×Loading Buffer，沸水煮 5 min，
用 10% 预制胶上样 10 μL 进行电泳，电泳条件 200 V、
45 min。
1.2.6 重组酶活性测定 重组糖化酶酶活测定按国
家行业标准 QB/T1803-1993 进行。酶活定义 ：1 mL
液体酶，于 40℃、pH 值为 4.6 的条件下，1 h 分解
可溶性淀粉产生 1 mg 葡萄糖，即为 1 个酶活力单位，
以（U/mL）表示。
1.2.7 生淀粉糖化酶活性测定 预先将酶液用乙酸 -
乙酸钠缓冲液（pH6.0）稀释 100 倍，取 3 mL 加入
250 mL 三角瓶中，加入 0.9 g 玉米淀粉，再加入缓
冲液 24 mL，60℃、100 r/min 培养 1 h，并设未加酶
液作为空白对照。取出加入 3 mL 10% 碳酸钠溶液，
4 000 r/min 离心 10 min，取上清，用 GOPOD 试剂盒
检测还原糖的含量。
1.2.8 重组酶最适温度及热稳定性测定 用 DNS 法
在 pH4.6 条件下测定不同温度下重组酶的活力，以
最高酶活 100% 计。在不同温度下将重组酶保温一
段时间（5、10、15、30、60 和 90 min），在最适条
件下测定剩余酶活，以未处理的酶液酶活为 100% 计。
1.2.9 重组酶最适 pH 及 pH 稳定性测定 在最适温
度下测定不同 pH 值下重组酶的活力，以最高酶活
100% 计。在室温下将重组酶在不同 pH 值缓冲溶液
中放置一段时间（1、2、4、8、20 和 32 h），在最
适条件下检测剩余酶活力，以未处理的酶液酶活为
100% 计。
2 结果
2.1 糖化酶基因的挖掘
用序列比对的方法从粉红黏帚霉全基因组中获
得了一个可能编码糖化酶的基因 g3440，其注释信息
为 E5AAM7_Glucoamylase。该基因编码一个含有 527
个氨基酸的蛋白质，其序列已在 2013 年申请的专
利（申请号 201310718737.2）中公开。用 VectorNTI
软件预测其分子量为 56.4 kD。该蛋白序列与黑曲霉
糖化酶相似性达 48%，覆盖度达 97%（图 2）。用
SignaIP 分析发现该序列存在一个信号肽切割位点，
推断的信号肽切割位点在 S22-E23 之间，该信号肽属
于真核生物信号肽。
该基因大小为 1 825 bp，其 cDNA 大小为 1 584
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.7196
11111Anigerg3440Consensus 10 20 30 40 52Section 1
5353455353Anigerg3440Consensus 60 70 80 90 104Section 2
10510597105105Anigerg3440Consensus 110 120 130 140 156Section 3
157157149152157Anigerg3440Consensus 170 180 190 208Section 4
209209201204209Anigerg3440Consensus 220 230 240 250 260Section 5
261261253256261Anigerg3440Consensus 270 280 290 300 312Section 6
313313303308313Anigerg3440Consensus 320 330 340 350 364Section 7
365365355345365Anigerg3440Consensus 370 380 390 400 416Section 8
417417407354417Anigerg3440Consensus 430 440 450 468Section 9
469469459406469Anigerg3440Consensus 480 490 500 510 520Section 10
521521511528521Anigerg3440Consensus 530 540 550 560 572Section 11
573573563452573Anigerg3440Consensus 580 590 600 610 624Section 12
325625615503625Anigerg3440Consensus 630 640 650 Section 13
图 2 粉红黏帚霉 g3440 基因的氨基酸序列与黑曲霉糖化酶序列同源性比对分析
2015,31(7) 197张亮等 ：粉红黏帚霉糖化酶基因的克隆、表达及酶学性质分析
bp，含有 3 个内含子序列，大小分别为 173、13 和
55 bp。将 g3440 基因的氨基酸序列在 NCBI 数据库
中进行 BLAST 比对，结果显示该序列与 NCBI 中已
公布的来源于 Leptosphaeriamaculans JN3 的糖化酶
（GenBank 编号 XP_003844197.1）相似性最高（62%），
因此，可判断本研究扩增到的是一个新糖化酶基因。
2.2 PCR扩增产物鉴定
通过对粉红黏帚霉菌全基因组基因进行 PCR，
获得了大小正确的（1 825 bp）核苷酸序列（图 3）。
有表达。目的基因随机重组到黑曲霉 G1 基因组中，
2、3 号菌可能是目的基因随机重组的位点不正确，
未能转录与翻译。目的蛋白的分子量稍微偏大，用
NetNGlyc 1.0 Server 进行分析发现该氨基酸序列中有
2 个潜在的 N-糖基化位点，因此推断该蛋白可能进
行了糖基化修饰，造成其实际分子量比根据氨基酸
预测值大［19］。
10000
8000
bp
M 1 2 3
6000
5000
4000
3500
3000
2500
2000
1500
1000
750
500
250
M ：DNA 分子量标准 ；1-3 ：g3440 的扩增条带
图 3 PCR 扩增产物的电泳分析
2.3 转化子基因组PCR鉴定
提取黑曲霉转化子（5 个）的基因组，PCR 验
证及电泳分析结果如图 4 所示。
10000
8000
bp
M 1 2 3 4 5 6
5000
3000
2000
1500
1000
750
500
250
M ：DNA 分子量标准 ；1-5 ：转化子的 PCR 产物鉴定 ；6 ：G1 对照
图 4 转化子菌株基因组 PCR 鉴定
2.4 重组菌的发酵产酶鉴定
SDS-PAGE（ 图 5） 显 示 1、4、5 号 转 化 子 均
~180
~130
bp M 1 2 3 4 5 6
~95
~72
~55
~43
~34
~26
α-amylase
glucoamylase
M ：蛋白质分子量标准 ；1-5 ：重组糖化酶 ；6 ：G1 阴性对照
图 5 黑曲霉转化子的 SDS-PAGE 分析
2.5 重组酶的活性及酶学性质分析
2.5.1 重 组 酶 活 性 测 定 用 国 标 法（QB/T 1803-
1993）对重组酶液进行酶活性测定，结果显示 1 号转
化子酶活性高达 292 U/mL，4、5 号转化子酶活性分
别为 257 U/mL 和 263 U/mL。
2.5.2 生淀粉糖化酶活性测定 重组酶生淀粉糖化
酶活性测定结果见表 1。反应前后葡萄糖的变化可
知 1、4、5 号转化子生淀粉糖化酶活性均较低，甚
至比出发菌株 G1 还低，因此认为没有生淀粉糖化
酶活性。
表 1 葡萄糖的含量
葡萄糖含量 /（mg·mL-1） 反应前 反应后
1 0.562 0.694
4 0.407 0.674
5 0.348 0.722
G1 0.413 1.540
2.5.3 重组酶的最适温度及热稳定性测定 用 DNS
法，在不同温度下测定重组酶的活性。结果（图 6）
显示该酶的最适温度为 50℃。将重组酶在不同温度
下保温并进行酶活性测定，结果（图 7）表明重组
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.7198
酶的耐热性较差，在最适温度下保温 15 min 酶活性
大约损失一半。
20 30 40 50 60 70 80 90
0
20
40
60
80
100
120
R
el
at
iv
e
ac
tiv
ity
/%
Temperature/ć
图 6 重组酶最适温度曲线
0 20 40 60 80 100
0
20
40
60
80
100
120 40ć
50ć
60ć
70ć
R
es
id
ua
l a
ct
iv
ity
/%
Time/min
图 7 重组酶热稳定性曲线
2.5.4 重组酶的最适 pH 及 pH 稳定性测定 在不同
pH 值下对重组酶活性进行测定，发现重组酶的最适
pH 为 5.0（图 8）。在将重组酶在不同 pH 溶液中室
温放置一段时间，并进行酶活性测定，结果（图 9）
发现重组酶的 pH 稳定性较好，在 pH5.0-6.0 的缓冲
液中放置 20 h 后仍有 80% 以上的酶活力。
3 讨论
随着全球经济的发展，能源短缺的问题日益突
出，可再生能源的开发与利用受到了世界各国的高
度重视。淀粉是绿色植物果实、种子、块茎、块根
的主要成分，是空气中二氧化碳和水经光合作用合
2 3 4 5 6 7 8 9
0
20
40
60
80
100
120
R
el
at
iv
e
ac
tiv
ity
/%
pH
图 8 重组酶最适 pH 曲线
0 5 10 15 20 25 30 35
0
20
40
60
80
100
120 pH3.0
pH4.0
pH5.0
pH6.0
pH7.0
pH8.0
R
es
id
ua
l a
ct
iv
ity
/%
Time/h
图 9 重组酶 pH 稳定性曲线
成的产物，是地球上最丰富的贮藏性多糖。然而，
大多数微生物多以葡萄糖、麦芽糖等低聚糖为最适
底物，天然淀粉却不能被有效的利用。将天然淀粉
转化为可发酵性糖成为一个亟待解决的问题。糖化
酶是水解淀粉的重要酶类之一，它可以水解生淀粉
或低聚糖非还原性末端 α-1，4- 糖苷键生成葡萄糖。
许多糖化酶水解生淀粉的活性较低且热稳定性差，
工业上在进行糖化前需将淀粉质原料进行高温糊化
和液化，并进行降温冷却，增加了生产成本。开发
出酶活性高，耐热性强的新型糖化酶可大大降低生
产成本，提高发酵工业的经济效益。近几年，国内
对新型糖化酶基因及表达的研究较少，对黑曲霉糖
化酶基因、表达及产酶条件的研究较多。2008 年，
李昆等［20］用黑曲霉糖化酶基因启动子 PglaA 替换质
2015,31(7) 199张亮等 ：粉红黏帚霉糖化酶基因的克隆、表达及酶学性质分析
粒 pRS303K 上 KmR 基因启动子，构建成糖化酶基
因启动子功能检测质粒 pRS-PglaA-KmR，并将其转
化 E. coli JM109，通过对重组菌的氨基糖苷磷酸转
移酶基因活性检测发现 PglaA 在 E. coli 中具有驱动
KmR 基因表达的活性。2011 年贺莹等［21］对黑曲霉
IN7-31 产糖化酶的液态发酵参数与技术优化进行研
究，其摇瓶发酵糖化酶酶活高达 3 044 U/mL，较优
化前提高了 1.59 倍。2012 年，王强等［22］将黑曲霉
糖化酶基因在毕赤酵母 X33 中进行了成功表达，其
表达量达 180 mg/L。本研究采用基因工程技术手段
将粉红黏帚霉糖化酶基因插入到黑曲霉 G1 染色体
中，并实现了成功表达，该重组酶酶活达 292 U/mL，
最适温度和 pH 分别为 50℃和 5.0。本研究为后续新
型糖化酶的开发奠定了基础，同时也为糖化酶的研
究提供了一种新的出发菌株。随着老一代糖化酶逐
渐被新型糖化酶取代，筛选和开发高比酶活、耐高
温或用于生淀粉加工的新型糖化酶基因，对于淀粉
加工产业和酿酒糖化过程优化等工业生产技术提升
提供支持。同时，新型糖化酶的开发可以打破国际
专利对传统糖化酶的保护壁垒和技术垄断，为我国
淀粉质原料的降解提供更高效的酶及辅助因子。传
统糖化酶大都存在酶活性不高，耐热性差等问题，
在实际生产运用中能耗大、耗时长、成本高，而开
发出酶活性高，耐热性强的新型糖化酶可大大降低
淀粉质原料的糖化成本，提高糖化效率。此外，传
统糖化酶的生产菌株大多是野生菌株经过反复诱变
而得到的突变株，在实际生产中存在着易污染、生
产条件复杂且难以控制等技术性难题，而新型糖化
酶菌株通过基因工程技术手段定向构建，可有效解
决这些问题。本研究获得的重组酶活性有待进一步
提升，同时该酶的酶学性质在耐热方面也需要改善。
进行密码子优化及高通量筛选，提升重组酶的活性
和酶学性质将是下一步研究工作的重心。
4 结论
本研究首次克隆并报道了粉红黏帚霉糖化酶基
因，并将其转化到黑曲霉 G1 中获得了糖化酶的表达。
120 h 摇瓶发酵后，发酵液上清糖化酶活性达 292
U/mL。对重组糖化酶的酶学性质进行研究表明，其
最适温度和 pH 分别为 50℃和 5.0，该酶热稳定性较
差，pH 稳定性较好，在 pH5.0-6.0 的缓冲液中室温
放置 20 h 后仍有 80% 的残余酶活。
参 考 文 献
［1］ James JA, Lee BH. Glucoamylases ：microbial sources, industrial
applications andmolecular biology—a review［J］. Journal of Food
Biochemistry, 1997, 21（1）：1-52.
［2］ Pandey A, Nigam P, Soccol CR, et al. Advances in microbial
amylases［J］. Biotechnol Appl Biochem, 2000, 31（2）：135-152.
［3］Kaur P, Satyanarayana T. Production and starch saccharification
by a thermostable, and neutral glucoamylase of a thermophilic
mould Thermomucor indicae-seudaticae［J］. World Journal of
Microbiology& Biotechnology, 2004, 20（4）：419-425.
［4］马丽娜 , 陈喜文 , 陈德富 , 等 . 曲霉属糖化酶基因的克隆及其在
毕赤酵母中的表达［J］. 南开大学学报 , 2007, 5（40）：85-90.
［5］刘喜凤 , 王肇悦 , 张博润 . 糖化酶及糖化酶基因在酿酒酵母中
表达的研究进展［J］. 酿酒 , 2007, 34（4）：73-76.
［6］梁新红 , 孙俊良 , 唐玉 , 等 . 黑曲霉糖化酶分离纯化与酶学性质
研究［J］. 河南科技学院学报 , 2011, 39（4）：24-27.
［7］ 陈启和 , 何国庆 . 糖化酶及其基因研究进展［J］. 微生物学杂志 ,
2000, 20（4）：46-50.
［8］Mertens JA, Skory CD. Isolation and characterization of two genes
that encode active glucoamylase without a starch binding domain
from Rhizopusoryzae［J］. Curr Microbiol, 2007, 54（6）：462-
466.
［9］姚婷婷 , 王衍敏 , 顾建龙 . 携多拷贝 glaA 的重组黑曲霉过量合
成糖化酶的研究［J］. 生物工程学报 , 2006, 22（4）：567- 571.
［10］康东亮 . 高产率糖化酶菌株的诱变选育［J］. 河南工业大学
学报 ：自然科学版 , 2006, 27（4）：43- 46.
［11］王家东 , 张茜 , 侯红萍 . 介孔分子筛 MCM-41 固定糖化酶的研
究［J］. 中国酿造 , 2012, 31（1）：116-119.
［12］Durand H, Clanet M, Tiraby G. Genetic improvement of scale
cellulase production［J］. Enzyme and Microbial Technology,
1988, 10（6）：341-346.
［13］Van den Hombergh JP, Van de Vondervoort PJ, Fraissinet-Tachet L,
et al. Aspergillus as ahost for heterologous protein production ：the
problem of proteases［J］. Trends Biotechnology, 1997, 15（7）：
256-263.
［14］Pavezzi FC, Carneiro AA, Martins DA, et al. Influence of different
substatesonthe production of a mutant thermostableglucoamylase
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.7200
in submerged fermentation［J］. Appl Bicohem Biotechnol, 2011,
163（1）：14-24.
［15］何迎春 , 高必达 . 立枯丝核菌的生物防治［J］. 中国生物防治 ,
2000, 16（1）：31-34.
［16］莫明和 , 董林茜 , 迟胜起 , 等 . 立枯丝核菌重寄生真菌的筛
选［J］. 植物病理学报 , 2002, 32（1）：84-88.
［17］Vaili NG. Biological seed treatment of corn with mycopathogenic
fungi［J］. Journal of Phytopathology, 1992, 134（4）：313-323.
［18］赵颖 , 巴再华 , 张春艳 . 双向选择标记 amdS 在黑曲霉中自
发突变及 amdS-检测［J］. 济宁医学院学报 , 2008, 31（4）：
283-285.
［19］Duan YT, Wang Z, Wu W, et al. Polycistronic expression of human
platelet factor 4 with heparin-neutralizing activity in Escherichia
coli［J］. Bioscience, Biotechnology, And Biochemistry, 2012, 76
（10）：1855-1860.
［20］李昆 , 李松 , 牛丹丹 , 等 . 黑曲霉糖化酶基因启动子功能鉴
定［J］. 微生物学杂志 , 2008, 28（6）：5-9.
［21］贺莹 , 吕利华 , 张婵 , 等 . 黑曲霉 IN7-31 产糖化酶的液态发酵
参数与技术优化研究［J］. 中国酿造 , 2011, 1 ：48-51.
［22］王强 , 徐义兵 , 郭春和 , 等 . 黑曲霉糖化酶基因在毕赤酵母
X33 中的高效表达［J］. 中国畜牧兽医 , 2012, 39（4）：21-
24.
（责任编辑 李楠）