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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第5期
收稿日期 : 2011-09-29
基金项目 : 石河子大学动植物育种专项（gxjs2009-yz03）, 石河子大学高层次人才引进项目（RCZX200819）
作者简介 : 权俊萍 , 女 , 博士 , 副教授 , 研究方向 : 园艺园林植物种质资源及遗传育种 ; E-mail: quanjp99@163.com
通讯作者 : 吕国华 , 男 , 教授 , 研究方向 : 园艺植物生理生态学 ; E-mail: lghshz@163.com
薰衣草高质量 DNA提取及 ISSR-PCR
多重化体系的建立
权俊萍1 贾晓鹰2 戴丽娜1 肖俊辉1 田琴2 牛攀新1 吕国华1
（1 石河子大学农学院，石河子 832000 ；2 石河子大学设施生物种苗研发中心，石河子 832000）
摘 要： 以伊犁薰衣草‘701’新鲜叶片为材料，对 4种基因组 DNA提取方法进行比较，并通过单因子梯度比较试验结合
L9（34）正交优化设计，对 ISSR-PCR扩增体系中退火温度、DNA、Mg2+、dNTP和引物浓度进行最佳条件及配比筛选。结果表明，
改良 3×CTAB法是薰衣草高质量 DNA少量提取的最佳方法；建立薰衣草 ISSR-PCR扩增优化体系为，20 μL反应体系中包括模板
DNA 50 ng，Mg2+ 3 mmol/L，dNTP 0.3 mmol/L，引物 0.3 mmol/L，Taq酶 1 U；扩增程序退火温度为 56℃。运用本试验建立的 ISSR-
PCR优化体系，对 5份薰衣草种质进行了初步验证，获得了良好的多样性扩增条带。
关键词： 薰衣草 DNA提取 ISSR-PCR 正交设计 体系优化
High-quality DNA Extraction of Lavender Leaves and Establishment of
Multiple Optimizing of ISSR-PCR System
Quan Junping1 Jia Xiaoying2 Dai Lina1 Xiao Junhui1 Tian Qin2 Niu Panxin1 Lü Guohua1
（1College of Agricultural，Shihezi University，Shihezi 832000；2Research and Development Center of Factory Biological Seedling，
Shihezi University，Shihezi 832000）
Abstract: It was to optimize and establish extractive method of high-quality DNA and stable ISSR-PCR amplified system of lavender.
Four genetic DNA-extractive methods were compared by using fresh leaves of YILI Lavender ‘701’. The optimum conditions of ISSR-PCR
system were compared and screened in different levels of primer, dNTP mixture, Mg2+, Taq DNA polymerase and annealing temperature based
on gradient test of single factor and L9（34）orthogonal design. Results showed that the modified 3×CTAB is the best extractive method of high-
quality lavender DNA. The optional parameters for 20 μL ISSR-PCR reaction system are DNA 50 ng, Mg2+ 3 mmol/L, dNTP 0.3 mmol/L, random
primer 0.3 mmol/L and Taq DNA polymerase 1 U, respectively. The high-quality diversity bands were amplified when applied the optimizing
system on five lavender cultivars. The research sets the experimental basis for the future cultivar identification, genetic mapping, and variety
breeding and genetic diversity of genus Lavandula.
Key words: Lavender DNA extractive ISSR-PCR Orthogonal design System optimization
薰衣草为唇形科（Labiatae），薰衣草属（Lavan-
dula）植物，栽培历史悠久，栽培种类繁多，其精油
提取物在医疗药品、日用化工、食品产业具有重要
的经济用途，是世界香料种植产业中不可或缺的重
要组成部分［1-4］。薰衣草因其花色淡雅、花开繁茂、
花期长，具有丰富的花文化内涵以及对环境较强的
耐受能力，作为观赏植物日益受到人们的青睐，在
许多城市的园林绿化实践工作中得以推广普及。中
国新疆伊犁河谷因其所处自然地理环境的特殊性，
非常适合一流香料植物的栽培和生产，已成为世界
著名高品质薰衣草第三产地，被称为中国的“薰衣
草之乡”。近些年来，由于新疆薰衣草栽培品种单一、
品种来源与遗传背景的不清楚，加之多年营养繁殖
和栽培，出现了严重的品种退化、精油含量降低、
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第5期152
品种抗性下降等问题［5］。采用科学先进的育种手段，
加快薰衣草优良品种选育工作，更好地优化薰衣草
品种结构，已成为当地薰衣草产业发展的一项主要
内容。将分子生物学与基因遗传改良工程相结合，
开展薰衣草品种的遗传改良和良种繁育研究，是加
速薰衣草优良品种选育进程的必要途径［6］。DNA 分
子标记技术已广泛应用于植物种质资源的研究及品
种选育等许多领域，利用分子标记技术进行亲本的
选择选配及对杂交后代的筛选，可大大提高育种效
率，缩短育种年限［7］。内部简单序列重复区间扩增
（Inter simple sequence repeat，ISSR）是基于 PCR 扩
增的一种第二代分子标记技术，它无需预知物种基
因组序列，可广泛使用于各类植物，具有操作简单、
稳定性好、多态性丰富等优点，在进行植物遗传多
样性分析、种质鉴定、遗传连锁图的构建、基因连
锁标记的寻找与基因定位和比较基因组学研究等方
面得到了很好的应用［8, 9］。
本研究以新疆伊犁地区薰衣草主栽品种‘701’
为材料，在预试验基础上，参考相关试验方法［7, 10-15］，
在高效、优质薰衣草 DNA 少量提取技术建立的基础
上，进行薰衣草 ISSR-PCR 优化体系的研究，并对
建立的优化体系进行不同薰衣草种质的初步应用与
评价，旨在为今后薰衣草属植物资源鉴定、品种选
育以及遗传多样性等方面的研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 材料 试验材料为伊犁地区薰衣草主栽品种
‘701’，田间种植于石河子大学设施种苗研发中心。
1.1.2 试剂及仪器 试验中 dNTP mixture、10×PCR
buffer 及 Taq聚合酶购自北京天根生物工程公司 ；
DNA Marker 和引物均由上海生工生物工程公司合
成。试验使用主要仪器有 ：Bio-Rad PCR 扩增仪
（GeneAmp 公司生产），Gel DOC 2000 凝胶成像系统，
Mikko 22R 台式高速冷冻离心机 ；DYY-6C 电泳仪 ；
DK-S26 电热恒温水浴锅 ；754PC 型紫外分光光度计
（上海菁华公司生产）。
1.2 方法
1.2.1 总 DNA 提取方法及比较［7, 16-18］
1.2.1.1 改良 2×CTAB（十六烷基三甲基溴化
铵）法
（1）研磨 ：取 0.1g 新鲜叶片于预冷的研钵中，
加入 1 g PVP（聚乙烯吡咯烷酮），于液氮中迅速研
磨成细粉状。
（2）DNA 释放 ：转入 1.5 mL 离心管，加入 800
μL 预热的 2×CTAB 提取缓冲液及 12.5 μL 的 BME，
混匀后于 65℃水浴 30-45 min，其间摇动 3-4 次。
（3）抽提 ：冷却后加入等体积的氯仿 - 异戊
醇（24 1），摇匀后 12 000 r/min 离心 10 min，取上
清加入等体积氯仿 - 异戊醇（24 1）再抽提一次，
12 000 r/min 离心 10 min。
（4）沉淀 ：取上清液加入 1/5 体积 5 mol/L 的
NaCl 混匀，再加入 2/3 体积预冷的无水乙醇，轻轻
颠倒数次，-20℃静置 2 h 以上，4℃ 8 000 r/min 离心
10 min，弃上清夜。
（5）洗涤 ：70% 的乙醇清洗沉淀 DNA 2-3 次，
室温风干，200 μL TE 室温下完全溶解于 -20℃保存
备用。
提取缓冲液配方：100 mmol/L Tris-HCl（pH=8.0），
20 mmol/L EDTA（pH=8.0），1.4 mol/L NaCl，2%
CTAB，2% PVP，1% BME（β-巯基乙醇）。
1.2.1.2 改良 3×CTAB 法 与改良 2×CTAB 法的区
别在（1）、（2）步：（1）液氮研磨时加入 2 g PVP；（2）
研磨物转入 1.5 mL 离心管后，先加入 1 mL 核裂解
液及 0.3% 的 BME，迅速摇匀后 4℃下 12 000 r/min
离心 5 min，再于沉淀中加入 700 μL 的 3×CTAB 提
取缓冲液及 12.5 μL 的 BME，65℃水浴 30-45 min。
其它处理同 1.2.1.1。
核裂解液配方 ：100 mmol/L Tris-HCl（pH=8.0），
20 mmol/L EDTA（pH=8.0），4% PVP，6.3% 葡萄糖，
2% BME ；提取缓冲液配方 ：100 mmol/L Tris-HCl
（pH=8.0），20 mmol/L EDTA（pH=8.0），1.4 mol/L
NaCl，3% CTAB，4% PVP，2% BME。
1.2.1.3 改良 SDS（十二烷基硫酸钠）法 与改良
3×CTAB 法区别是 DNA 释放步的裂解液和提取液
成分不同以及 DNA 抽提沉淀步不同 ：沉淀时先于离
心上清液中加入 2/3 体积 2.5 mol/L（pH=8）的 KAc，
混匀后冰浴 30 min，4℃ 10 000 r/min 离心 10 min，
取上清加入等体积酚 - 氯仿 - 异戊醇（25 24 1）
混合液，轻混后于室温静置 10 min，4℃ 12 000 r/min
2012年第5期 153权俊萍等 ：薰衣草高质量 DNA 提取及 ISSR-PCR 多重化体系的建立
离心 10 min。酚 - 氯仿 - 异戊醇重复抽提 1 次后，
取上清直接加入 2 倍体积预冷的无水乙醇，-20℃沉
淀离心。
裂解液：100 mmol/L Tris-HCl（pH=8.0），20 mmol/L
EDTA（pH=8.0），0.5 mol/L NaCl，1.5% SDS； 提取液：
0.4 mol/L 葡萄糖，3% PVP，0.5% BME。
1.2.1.4 SDS 法 与 2×CTAB 法的区别在（2）、（3）、
（4）步 ：（2）液氮研磨物转入 1.5 mL 离心管后，直
接加入提取缓冲液，65℃水浴 10-15 min，冷却后
加入 1/3 体积 KAC 溶液，-20℃放置 30 min，4℃
12 000 r/min 离心 15 min。（3）取上清液加入等体积
氯仿异戊醇（24 1），轻混均匀静置后，4℃ 8 000 r/min
离心 10 min。（4）取上清液加入 2/3 体积预冷的异
丙醇，混匀后 -20℃放置 30 min 以上，DNA 沉淀生成。
提取缓冲液配方：100 mmol/L Tris-HCl（pH=8.0），
50 mmol/L EDTA（pH=8.0），500 mmol/L NaCl，
10 mmol/L BME，2% PVP，1.5% SDS。
以上 DNA 提取方法均重复 3 次，将提取的
DNA 进行 1.2% 琼脂糖凝胶电泳，以 λDNA 浓度为
参照，直观检测 DNA 的纯度及含量，同时紫外分光
光度计检测并计算 DNA 样品在 260 和 280 nm 处的
吸光度值，判定 DNA 纯度和得率。
1.2.2 ISSR-PCR 反应体系优化 采用 1.2.1 中建立
的最佳 DNA 提取方法，对伊犁薰衣草 701、伊犁薰
衣草法国蓝、英国薰衣草、法国薰衣草、孟士德薰
衣草等 5 份种质进行基因组 DNA 提取，用于后续
研究。
根据加拿大 British Columbia 大学公布的序列
人工合成 60 条 ISSR 引物，预试验对所有合成的
ISSR 引物进行初步筛选，选择其中扩增质量较好的
ISSR-36（引物序列：（AG）8TA）引物进行优化试验。
首先，使用梯度 PCR 仪，设定 48-60℃的退火温度
梯度范围，自动生成 12 个温度 ：48、49.3、50.5、
52.2、53.5、54.6、55.3、56.6、57.1、58.2、58.9 和
59.4℃，进行 ISSR-PCR 退火温度的扩增比较。其次，
以伊犁薰衣草‘701’ DNA 为模板，采用如下基本
PCR 程序：94℃预变性 4 min；94℃变性 40 s，T（表
示前一步试验中较适宜退火温度）退火 30 s，72℃
延伸 60 s，38 个循环 ；72℃ 7 min，4℃停止。针对
DNA、Mg2+ 、dNTPs 及引物浓度设计单因子梯度试
验，反应体系总体积为 20 μL，DNA 量设为 10、30、
50、70、90 ng ；Mg2+ 浓度设 0.50、1.5、2.50、3.75、
5.00 mmol/L ；dNTP 浓度设 0.05、0.15、0.25、0.35、
0.45 mmol/L ；引物浓度设 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5
mmol/L。对单因子试验基础上，进一步进行 L9（34）
正交优化试验［19］。以上试验均重复 3 次，对 ISSR-
PCR 扩增产物进行 1.5% 琼脂糖凝胶电泳，EB 染色，
电泳电压为 115 V，电泳时间 1.5 h，电泳完毕于 Gel
DOC 2000 紫外凝胶成像系统拍照记录。
1.2.3 ISSR-PCR 优化体系在薰衣草不同种质间的比
较 利用建立的 ISSR-PCR 优化体系对合成的 60 条
ISSR 引物再一次筛选，选择扩增条带较好的 5 条引
物对供试的 5 份薰衣草种质进行初步扩增验证。
2 结果
2.1 不同DNA提取方法的比较及检测
将琼脂糖凝胶电泳与紫外分光光度计测定结果
相结合，对 4 种不同 DNA 提取方法进行比较。从
DNA 提取质量看，只要样品采集及贮藏及时，严格
按照提取程序和相关规范进行，除 SDS 法杂质较多
外，其他 3 种方法提取的 DNA 均为无色透明液体状，
多糖及酚类物质杂质含量较低，DNA 杂质主要是蛋
白质。从凝胶电泳（图 1）可以看出，改良 3×CTAB
法点样孔较为清晰，提取的 DNA 条带清楚，主带明
亮，无脱尾现象，改良 SDS 法虽然杂质较少，DNA
提取得率较高，但 DNA 存在一定的降解 ；改良
2×CTAB 法及 SDS 法点样孔亮斑明显，混浊有污染，
说明杂质含量较高，且 SDS 法提取 DNA 有明显降
解现象，对 DNA 进行吸光值测定结果也进一步验证
了以上结论。在 DNA 样品提取得率方面，不同方法
DNA 提取得率间有明显差异，除 SDS 法外，其余 3
种提取方法的 DNA 得率均较高，均能达到 50 ng/μL
以上。此外，试验还对薰衣草干燥叶片和冷冻叶片
进行了同种方法的 DNA 提取，结果 DNA 杂质含量
明显增多，得率明显下降，因此为保证 DNA 提取的
质量，应尽可能以新鲜幼嫩叶片作为提取 DNA 的
材料。
采用改良 3×CTAB 法对 5 份不同薰衣草种质进
行 DNA 提取方法的验证，结果（图 2）显示，DNA
扩增条带清晰完整，杂质少，得率高，将提取的
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第5期154
DNA 浓度用 TE 稀释至相应浓度，用于后续薰衣草
ISSR-PCR 扩增体系多重优化试验。
扩增条带减少甚至无扩增，综合比较后，初步确定
30-70 ng/20 μL 的模板 DNA 浓度进行后续 ISSR-PCR
体系的正交优化。
PCR 反应体系内 Mg2+ 浓度的细微变化不仅会
对 Taq聚合酶的催化活性产生灵敏影响，并且还会
影响到引物退火温度的高低、特异性产物的扩增和
引物二聚体的形成，最终对 PCR 扩增产物得率和扩
增特异性造成较大影响。从图 4 可知，对于本 ISSR-
PCR 扩增体系，Mg2+ 浓度为 2.5 和 3.75 mmol/L 时都
有较为清晰的扩增条带，低于 2.5 mmol/L 时扩增条
带无或缺失，过高时则表现为扩增谱带背景增强，
且条带模糊不易分开。
λDNA. 60 ng/μL；1，2：伊犁薰衣草 701；3，4. 伊犁薰衣草法国蓝；
5，6. 英国薰衣草 ；7，8. 法国薰衣草 ；9，10. 孟士德薰衣草
图 2 改良 3×CTAB法提取 5种薰衣草 DNA电泳图谱
λDNA. 40 ng/μL；1-3. 改良 2×CTAB 法；4-6. 改良 3×CTAB 法；
7-9. 改良 SDS 法 ；10-12. SDS 法
图 1 薰衣草‘701’不同提取方法 DNA电泳图谱
2.2 薰衣草ISSR-PCR反应体系的优化
2.2.1 退火温度对薰衣草 ISSR-PCR 扩增效果的影
响 在 DNA 提取基础上，根据预试验结果，选择
扩增效果相对较好的 ISSR-36 号引物进行 PCR 体
系优化试验。首先对自动生成 12 个温度梯度进行
ISSR-PCR 退火温度的比较。结果（图 3）表明，退
火温度在 50.5-56.6℃之间均能扩增出不同程度的条
带，其中 55.3℃和 56.6℃的退火温度时扩增条带明
显，低于 50℃和高于 57℃时扩增条带不明显或条
带数量减少至无条带，本试验选择 56℃作为薰衣草
ISSR-PCR 体系优化的程序退火温度。
2.2.2 薰衣草 ISSR-PCR 单因子优化体系扩增结果的
比较及分析 前期预试验表明，Taq聚合酶浓度在
常规反应体系下对结果影响不大，影响薰衣草 ISSR
扩增体系稳定性和重复性的主要因子是 Mg2+、DNA、
dNTP 及引物浓度，因此主要针对以上 4 因子进行了
单因子优化试验。从图 4 可以看出，模板 DNA 浓度
在 30、50、70 ng 时，均能扩增出相对一致的 DNA
条带，DNA 浓度较高时，扩增条带过亮，条带间
清晰度降低，当浓度低至 30 ng 以下时，出现部分
M. 2000 bp DNA Marker ；1-12. 不同退火温度，依次为 48℃、
49.3℃、50.5℃、52.2℃、53.5℃、54.6℃、55.3℃、56.6℃、
57.1℃、58.2℃、58.9℃、59.4℃
图 3 薰衣草‘701’ ISSR-PCR不同退火温度扩增比较
M. 2000 bp DNA Marker；1-5. 不同 DNA 浓度，依此为 10、30、50、70 及 90
ng ；6-10. 不同 Mg2+ 浓度，依次为 0.50、1.50、2.50、3.75 及 5.00 mmol/L ；
11-15. 不同 dNTP 浓度，依次为 0.05、0.15、0.25、0.35 及 0.45 mmol/L ；
16-20. 不同引物浓度，依次为 0.1、0.2、0.3、0.4 及 0.5 mmol/L
图 4 不同 DNA、Mg2+、dNTP及引物（I36）浓度的
ISSR-PCR扩增电泳图谱
体系中 dNTP 浓度是影响 PCR 扩增效果的另一
重要变量。dNTP 浓度过低时，会降低扩增产物的得
率，减少扩增条带，浓度过高会造成碱基的错误渗
入而增加非特异性条带扩增的概率［21］。从本试验扩
增结果看， dNTP 浓度低于 0.15 mmol/L 和高于 0.35
mmol/L 时均会影响到扩增条带的完整性和清晰度，
故初步确定确定 dNTP 浓度范围在 0.15-0.35 mmol/L
2012年第5期 155权俊萍等 ：薰衣草高质量 DNA 提取及 ISSR-PCR 多重化体系的建立
之间。
PCR 扩增体系中引物的浓度要适量，引物浓度
偏低时会使扩增条带数目减少或不清晰。本试验扩
增结果表明，引物浓度在 0.3、0.4 和 0.5 mmol/L 时
均有稳定的扩增条带，在 0.1 和 0.2 mmol/L 浓度下
出现了扩增条带模糊，部分条带丢失情况，可初步
确定引物浓度范围在 0.3-0.5 mmol/L 之间。
2.2.3 薰衣草 ISSR-PCR 扩增体系的正交优化及筛
选 单因子优化试验虽然可初步确定出主要影响因
子的适宜浓度范围，但作为 PCR 的扩增体系，各因
子彼此间存在一定互作效应，仅从单因子试验并不
能真正获得综合优化结果。正交优化试验设计可以
较好的反映出因子间的互作效应，快速确定体系中
各因子最佳配比组合。本试验对初步确定的各因子
进行了进一步 L9（34）正交优化试验，以确定出薰
衣草 ISSR-PCR 扩增体系的最佳优化程序，更好的
保证扩增结果的稳定性和重复性。正交优化试验各
因子组合见表 1，扩增结果见图 5。
对正交试验扩增结果按照电泳图的条带扩增数、
扩增清晰度、扩增背景均匀性等表现进行综合打分，
分为 1-9 个等级，最佳记为 9，最差记为 1。对 3 次
重复的扩增结果采用 SPSS 统计分析软件进行统计分
析（表 2）表明，在选定各因子浓度范围内，Mg2+
浓度对扩增结果影响最大，而 DNA 模板浓度的影响
最小，其中 Mg2+ 和 dNTP 浓度与其他各因素间的差
异达极显著，其他因素间差异不显著。由于本正交
试验是建立在单因子优化基础上的，因素内不同水
平间设置差异较小，会对最终分析结果的显著性有
一定干扰。
表 1 薰衣草‘701’ ISSR-PCR扩增体系 L9（34）
正交优化表
序号 Mg
2+
（mmol/L）
dNTPs
（mmol/L）
引物
（mmol/L）
模板 DNA
（ng）
1 2 0.15 0.3 30
2 2 0.25 0.4 50
3 2 0.35 0.5 70
4 3 0.15 0.4 70
5 3 0.25 0.5 30
6 3 0.35 0.3 50
7 4 0.15 0.5 50
8 4 0.25 0.3 70
9 4 0.35 0.4 30
表 2 L9（34）正交试验各因素间方差分析
变异来源 自由度 DF 均方 MS F 值
模型 8 3338.406 10.467
Mg2+ 2 1424.277 24.465*
dNTPs 2 246.564 16.122*
引物 2 150.978 10.473
模板 DNA 2 89.472 8.460
误差 9 118.960
总变异 9
* 表示在 P<0.05 水平上差异显著
M. 2000 bp 分子质量标准 ；1-9. 分别对应表 1 中不同正交组合配方
图 5 薰衣草‘701’ISSR-PCR L9（34）正交优化扩增结果
对扩增产物的琼脂糖电泳图的直观分析可以看
出（图 5），各正交组合均能扩增出一定的 ISSR 条
带，但扩增质量有明显差异。随着 Mg2+ 浓度的增加，
PCR 扩增条带亮度增强，条带间干扰增加，区分度
降低，特别是高 Mg2+ 浓度和任何其他一个因子的较
高浓度水平相配合时，表现更加明显。综合比较看，
正交组合 2、5 和 8 号均扩增出较清晰完整的条带，
而其他配方均表现出条带的缺失、模糊、亮度过强
或过暗等现象。8 号由于较高的 Mg2+ 和模板 DNA 浓
度造成扩增背景较亮和扩增条带亮度对比过强，5
号组合扩增条带表现相对 2 号模糊，2 号扩增效果
总体表现较好，亮度适中均匀，条带清晰，故确定
优化的薰衣草 ISSR-PCR 20 μL 体系配方如下 ：模板
DNA 50 ng， Mg2+ 0.25 mmol/L，dNTP 0.3 mmol/L，引
物 0.3 mmol/L，Taq酶 1 U。
2.3 ISSR-PCR优化体系在薰衣草属资源上的初步
扩增
在以上优化体系建立基础上，对合成的 60 条
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第5期156
ISSR 引物进行了再次筛选，选择其中扩增良好的 5
个 ISSR 引物（分别为 ISSR4、32、33、56、801），
对 5 份不同种质薰衣草 DNA 进行了初步扩增。结果
（图 6）表明，总体扩增条带清晰，亮度适中，统计
出 31 条清晰的条带，片段大小多集中在 300-1 500
bp 之间，平均每条引物扩增出 6.2 个条带，多态性
条带数为 23，多态性条带比率为 74.19%。
3 讨论
3.1 薰衣草高质量DNA少量、快速提取技术建立
从当前发表的植物 DNA 提取文献看，各种方法
的建立均是基于 CTAB 及 SDS 两种 DNA 提取技术
之上的，由于提取缓冲液成分、提取步骤及提取对
象的差异，使得 DNA 提取效果也不尽相同。本研究
表明，薰衣草新鲜叶片中多糖和酚类等杂质，无论
CTAB 法还是 SDS 法，在经过核裂解处理以及提高
PVP 和巯基乙醇比例后，均能较好的去除，主要的
干扰杂质蛋白质在经过两次以上氯仿/异戊醇（酚/氯
仿 / 异戊醇）抽提时也能明显降低其在 DNA 中的残
留率。其次，改良 SDS 法虽然表现出比两种 CTAB
法更高的 DNA 提取得率，但 DNA 却出现一定程度
的降解。3×CTAB 法由于含有较高的 CATB、PVP
及 β- 巯基乙醇浓度，使得细胞裂解更加彻底，DNA
纯度得到很好的保证。考虑到 DNA 纯度和完整性对
分子标记扩增结果稳定性和重复性有重要影响，确
定 3×CTAB 法是高质量薰衣草 DNA 少量、快速提
取的较好方法。需要明确的是，以上各种 DNA 提取
技术路线的比较必须建立在成熟的试验操作技能和
高质量生化试剂基础之上。
3.2 ISSR-PCR扩增体系建立的关键问题
ISSR 是基于 PCR 基础上的分子标记，反应中
涉及到的各因子对不同物种扩增结果的特异性、稳
定性及重复性有较大影响，故对扩增体系进行优化
是十分必要的［19］。本研究将单因子梯度试验和正交
试验设计相结合，获得了更为准确稳定的试验结果。
参照以往相关文献［10-15］可知，不同植物间采
用的 ISSR-PCR 扩增程序总体差异不大，主要区别是
退火温度的高低，一般情况下，退火温度过高会造
成引物选择性增强，引物和模板结合程度较低，扩
增产物少，退火温度过低则会降低引物扩增的特异
性。本试验结果表明，薰衣草 ISSR-PCR 体系优化
的程序退火温度为 56℃较为适宜。
研究表明，各因子对薰衣草 ISSR-PCR 优化体
系的相对影响程度从大到小依次为 Mg2+、dNTP、引
物和 DNA 浓度。首先，Mg2+ 浓度一直是影响 PCR
结果的重要变量之一，其浓度的大小直接影响 Taq
DNA 聚合酶的活性、DNA 双链的合成以及引物退
火温度的高低［20］。优化后的薰衣草 ISSR-PCR 优
化体系中的 Mg2+ 浓度相对较高（3 mmol/L），这是
体系内综合作用及物种差异性共同决定的结果。其
次，dNTP 是综合体系中和 Mg2+ 密切相关的一个因
子，当 dNTP 分子中的磷酸基团与 Mg2+ 结合时，会
对 Mg2+ 活性产生抑制作用，故在一个标准体系中，
dNTP 和 Mg2+ 浓度的调整必须保持同步。再次，将
优化后的扩增体系应用于不同薰衣草种质的批量扩
增时，对扩增效果稳定性影响较大的主要有以下两
个因素：一是供试各样品间 DNA 的质量及浓度差异，
必须保证不同样品间 DNA 的纯度、完整性和浓度的
相对一致性 ；其二，引物序列差异会导致最佳退火
温度、Mg2+ 有效性等方面的变化，使得建立的 ISSR-
PCR 优化体系用于不同引物扩增时，扩增质量有较
M. 2000 bp DNA Marker ；1-1-1-5. 引物 4 对 1-5 号薰衣草 DNA 扩增结果 ；2-1-2-5. 引物 32 对 1-5 号薰衣草 DNA 扩增结果 ；3-1-3-5.
引物 33 对 1-5 号薰衣草 DNA 扩增结果 ；4-1-4-5. 引物 56 对 1-5 号薰衣草 DNA 扩增结果 ；4-1-4-5. 引物 801 对 1-5 号薰衣草 DNA
扩增结果 ；1-5 号薰衣草分别为伊犁薰衣草 701、伊犁薰衣草法国蓝、英国薰衣草、法国薰衣草和孟士德薰衣草
图 6 5个 ISSR引物对 5种薰衣草的扩增结果
2012年第5期 157权俊萍等 ：薰衣草高质量 DNA 提取及 ISSR-PCR 多重化体系的建立
大差异。因此，在选择扩增质量表现较好引物的同时，
也可针对一些扩增条带较多但电泳质量较差的引物，
进行扩增体系微调，一般能很好的改善扩增效果，
从而增加引物的可用性及特异性条带出现比例。
虽然 ISSR 分子标记技术因引物可选性强、试验
重复性好、操作简单、安全性高、谱带丰富、可揭
示更高程度的 DNA 位点差异性和多态性等优点，在
植物种质资源及遗传育种方面应用广泛［8］，但也要
注意到该项技术应用中的不足之处，如扩增条带多
为显性标记，不能区分纯合体和杂合体，在计算遗
传相似系数时会出现一定程度的偏差等问题［20］。因
此，对于本研究建立的薰衣草 ISSR-PCR 技术体系，
在今后应用过程中，要根据研究目的科学加以选择，
必要时可结合不同分子标记技术进行综合研究，更
好地揭示研究结果的科学性。
4 结论
本研究确定了薰衣草高质量 DNA 少量提取的
最佳方法为改良 3×CTAB 法，建立了薰衣草 ISSR-
PCR 扩增优化体系，运用本优化体系进行了不同引
物及薰衣草种质的 ISSR-PCR 的初步验证，获得了
良好的多样性扩增条带。
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）