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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第6期
黑 木 耳（Auricularia auricula）， 属 真 菌 门、 担
子菌纲、本耳目、木耳科。《本草纲目》记载黑木耳
“性平，味甘 ；补齐止血、涩肠活血”，具有凉血、
活血、益气强身等功效。黑木耳含有较高蛋白质及
氨基酸，高钙，高铁，富含糖类、多种维生素和微
收稿日期 ：2013-03-18
基金项目 ：国家菌草工程技术研究中心开放基金项目（JCJJ13012），福建省教育厅科技项目（JB11038、JB12055）
作者简介 ：赵超，男，博士，讲师，研究方向 ：分子生物学与食药用菌功能成分 ；E-mail ：zhchao@live.cn
通讯作者 ：刘斌，男，博士，教授，博士生导师，研究方向 ：功能性食品与分子营养学 ；E-mail ：liubin618@hotmail.com
Box-Behnken 响应面设计法优化黑木耳菌质
多糖提取工艺
赵超1，2  曾峰1  黄一帆2，3  刘斌1，2
（1. 福建农林大学食品科学学院，福州 350002 ；2. 国家菌草工程技术研究中心，福州 350002 ；
3. 福建农林大学动物科学学院，福州 350002）
摘 要 ： 为了优化黑木耳菌质多糖的提取工艺，采用 Box-Behnken 设计方法，研究水提温度、水提时间、液料比及其交互
作用对黑木耳菌质多糖得率的影响。应用 Design Expert 软件和响应面分析相结合的方法，模拟得到回归方程的预测模型和可信度，
分析得到最佳的提取条件为 ：水提温度 81.59℃，水提时间 81.40 min，液料比 36.42∶1。黑木耳菌质多糖得率的预测值为 7.92 mg/
g，采用上述最佳提取条件进行验证试验，测得菌质多糖得率为 7.79 mg/g。采用响应法优化得到的黑木耳菌质多糖提取条件参数准
确可靠，该研究为黑木耳菌质多糖的工业化生产提供了必要的技术支持。
关键词 ： 黑木耳 菌质多糖 提取工艺 Box-Behnken 设计 响应面分析
Optimum Technique of Extracting Mycelium Polysaccharide
from Auricularia auricular Using Box-Behnken
Design-Response Surface Methodology
Zhao Chao1，2 Zeng Feng1，2 Huang Yifan2，3 Liu Bin1，2
（1. College of Food Science，Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou 350002 ；2. National Engineering Research Center of
Juncao，Fuzhou 350002 ；3. College of Animal Science，Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou 350002）
Abstract:  To optimize the extraction technique for mycelium polysaccharide from A. auricular, the effects of extraction temperature,
extraction time, the liquid to solid ratio and their interaction on extraction rate were studied by Box-Behnken design. The predictive model and
reliability were developed by Design Expert software and response surface analysis（RSM）. The optimal extraction conditions were achieved
and listed as follows ：extraction temperature 81.59℃, extraction time 81.40 min, liquid-to-solid ratio 36.42∶1. Under the optimum conditions,
the extraction yield of mycelium polysaccharide from A. auricular reached 7.79 mg/g, while the predicted one was 7.92 mg/g. The results showed
the suitability of RSM in optimizing the extraction of mycelium polysaccharide from A. auricular. The necessary technical support was provided
by this experimental study for the industrial production of mycelium polysaccharide from A. auricular.
Key words:  Auricularia auricular Mycelium polysaccharide Extraction technique Box-Behnken design Response surface analysis
量元素等，是营养价值较高的食药用菌［1］。黑木耳
主要功效成分为多糖，研究表明，黑木耳多糖具有
抗肿瘤、降血脂、降血糖、抗凝血、抗衰老、抗辐射、
增强体液免疫和细胞免疫功能等功能［2-5］。近年来，
黑木耳多糖的提取和利用已成为分子生物学、医学、
2013年第6期 189赵超等 ：Box-Behnken 响应面设计法优化黑木耳菌质多糖提取工艺
食品科学等领域的研究热点之一。我国是世界上主
要的黑木耳生产国，年产量占世界总产量的 90% 以
上［6］，因此，深入研究黑木耳的主要活性功能成分
多糖的提取具有重要的现实意义。黑木耳子实体多
糖研究较多，但黑木耳菌质多糖的提取工艺研究方
面尚未见报道［7］。
响应面法是工艺优化时常用的有效方法，用于
同时涉及多种工艺参数的工艺优化［8，9］。鉴于此，
课题组采用热水浸提法提取黑木耳菌质多糖，在单
因素（醇沉浓度、水提温度、水提时间、液料比）
试验的基础上，应用 Box-Behnken 响应面设计法在
黑木耳菌质多糖提取过程中，对影响提取率的水提
温度、水提时间、液料比及其各因素之间交互作用
进行试验设计，从而得到最佳的提取工艺参数，以
期为黑木耳菌质多糖的开发利用提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料
黑木耳（Auricularia auricula）菌种，由福建农
林大学菌物研究中心惠赠。新鲜甘蔗渣、豆渣自制，
干燥处理。
1.2 方法
1.2.1 固态发酵黑木耳菌质的制备 甘蔗渣 / 豆渣
（W/W，3∶1）50 g，添加 50 mL 液体培养基（葡萄
糖 20 g/L，MgSO4 0.5 g/L，KH2PO4 1.0 g/L），搅拌均
匀后，装入 500 mL 蘑菇瓶封口，121℃灭菌 30 min。
接种黑木耳液体菌球，26℃恒温培养 15 d，65℃烘
干后粉碎备用。
1.2.2 葡萄糖标准曲线 标准曲线的制作参照徐秀
忠和宋广磊方法［10］。
1.2.3 样品多糖含量的测定 称取 2.0 g 黑木耳菌质
粉末于不同条件进行热水浸提法提取［7］，取滤液 2.0
mL 醇沉处理（乙醇含量 70%），置 4℃冰箱过夜，
3 500 r/min 离心 6 min。所得醇沉粗多糖 70℃烘至
恒重，加入 5 mL 的蒸馏水溶解，然后准确吸取 0.1
mL，用蒸馏水补充至 1.0 mL，再分别加入 1 mL 现
配的 0.5% 苯酚和 5 mL 浓硫酸，沸水浴 5 min，冷却
至室温，于 490 nm 处测吸光度，根据标准曲线回归
方程，由吸光度求出提取液中的菌质多糖质量浓度，
并按照下列公式计算各处理的多糖得率［11］。
多糖得率（mg/g）= 求出的多糖质量浓度 × 定
容体积 / 测定的体积 ×2
1.2.4 单因素试验 以水为提取溶剂，考察醇沉浓
度（60%、70%、80%、95%、100%）、水提温度（50、
60、70、80、90、100℃）、水提时间（30、60、90、
120、150 min）、以及液料比（1∶20、1∶30、1∶40、
1∶50、1∶60）对多糖得率的影响［4］。单因素试验
时，考察因素变化，其他因素不变。每个处理设 3 个
重复。
1.2.5 优化试验 优化试验在单因素试验的基础上，
应用 Box-Behnken 中心设计原理，以水提时间、水
提温度、液料比 3 个因素为自变量，单因素试验得
出的各最佳条件为中心点，以黑木耳菌质多糖得率
为响应值，优化黑木耳菌质多糖提取工艺条件。
1.3 数据分析
采用 Design Expert 软件设计 3 因素 3 水平响应
面分析试验，试验结果采用 Design Expert 软件进行
数据处理和分析，确定最佳试验条件。
2 结果
2.1 黑木耳菌质多糖提取的单因素试验
2.1.1 醇沉浓度对黑木耳菌质多糖得率的影响 在
水提温度 80℃、水提时间 2 h、液料比 1∶40 的条
件下，分别选取 60%、70%、80%、95% 和 100% 乙
醇进行醇沉试验，测定并计算各处理的多糖得率，
结果如图 1 所示。图 1 显示，随着醇沉浓度的升高，
黑木耳菌质多糖的得率逐渐增大，采用的乙醇浓度
越高，菌质多糖的得率越高，综合考虑试验的可行
性和经济条件，选取醇沉浓度为 100%。
2.1.2 水提温度对黑木耳菌质多糖得率的影响 在
醇沉浓度为 100%、水提时间 2 h、液料比 1∶40 的
条 件 下， 分 别 选 取 水 提 温 度 为 50、60、70、80、
90、100℃进行试验，测定并计算各处理的多糖得率，
结果如图 2 所示。图 2 显示，随着水提温度的升高，
黑木耳菌质多糖得率先增大后减少，在 80℃处出现
最大值，因此最佳水提温度为 80℃左右。
2.1.3 水提时间对黑木耳菌质多糖得率的影响 在
醇沉浓度 100%、水提温度 80℃、液料比 1∶40 的
条件下，分别选取水提时间 30、60、90、120、150
min 进行试验，测定并计算各处理的多糖得率，结
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第6期190
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
60
ཊ㌆
ᗇ⦷
mg
/g

䞷⊹⎃ᓖ%
70 80 90 100
图 1 醇沉浓度对黑木耳菌质多糖得率的影响
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
50
ཊ㌆
ᗇ⦷
mg
/g

60 70 80 90 100≤ᨀ⑙ᓖ°C
图 2 水提温度对黑木耳菌质多糖得率的影响
果如图 3 所示。图 3 显示，随着水提时间的延长，
黑木耳菌质多糖的得率先增加后减少，在 90 min 达
到最大值，综合考虑试验效率和成本，水提时间选
为 60 min。
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
30 60 90
ཊ㌆
ᗇ⦷
mg
/g

120 150
≤ᨀᰦ䰤min
图 3 水提时间对黑木耳菌质多糖得率的影响
2.1.4 液料比对黑木耳菌质多糖得率的影响 在醇
沉浓度 100%、水提温度 80℃、水提时间 2 h 的条件
下，分别选取液料比为 1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、
1∶60 进行试验，测定并计算各处理的多糖得率，结
果如图 4 所示。图 4 显示，随着液料比的变化，菌
质多糖的得率先增大后缓慢减小，料液比接近 1∶35
左右时多糖得率最高，所以最佳液料比选为 1∶35。
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
20
ཊ㌆
ᗇ⦷
mg
/g

30 40 50 60
ᯉ⏢∄mL/g
图 4 液料比对黑木耳菌质多糖得率的影响
2.2 模型建立
采用 3 因素 3 水平的响应面进行分析法，考虑
各因素间的交互作用以及各因素对菌质多糖得率的
影响。试验设计与结果见表 1、表 2。
表 1 响应面试验因素及水平设计表
因素
水平
-1 0 1
X1（℃） 60 75 90
X2（min） 30 60 90
X3（mL/g） 20 35 50
X1 ：水提温度 ；X2 ：水提时间 ；X3 ：液料比 ；下同
表 2 黑木耳菌质多糖响应面试验设计及结果
试验号 X1（℃） X2（min） X3（mL/g） 多糖得率（mg/g）
1 -1 1 0 5.74
2 0 1 -1 3.47
3 -1 0 -1 4.23
4 0 1 1 0.79
5 1 -1 0 7.23
6 -1 -1 0 3.81
7 0 0 0 3.92
8 0 0 0 4.68
9 0 -1 -1 5.00
10 -1 0 1 0.89
11 1 0 1 1.45
12 1 0 -1 5.38
13 0 0 0 4.20
14 0 0 0 4.10
15 1 1 0 7.08
16 0 -1 1 0.16
17 0 0 0 3.83
经 Design Expert 软件对 17 个试验点的黑木耳菌
株多糖得率进行回归统计分析得出二次模型回归统
2013年第6期 191赵超等 ：Box-Behnken 响应面设计法优化黑木耳菌质多糖提取工艺
计分析表，见表 3。得到提取率的回归方程如下 ：
Y=4.15+0.81X1+0.11X2-1.85X3-0.52X1X2-0.15X1X3
+0.54X2X3+1.23X1
2+0.59X2
2-2.38X3
2
表 3 响应面二次回归方程方差分析
方差来源 平方和 自由度 均方根误差 F 值 P 值
模型 65.24 9 7.25 20.22 0.0003**
X1 5.23 1 5.23 14.6 0.0065**
X2 0.097 1 0.097 0.27 0.6193
X3 27.34 1 27.34 76.27 <0.0001**
X1 X2 1.08 1 1.08 3.02 0.1260
X1 X3 0.087 1 0.087 0.24 0.6373
X2X3 1.17 1 1.17 3.25 0.1143
X1
2 6.33 1 6.33 17.65 0.0040**
X2
2 1.48 1 1.48 4.13 0.0815
X3
2 23.94 1 23.94 66.76 <0.0001**
残差 2.51 7 0.36
失拟项 2.07 3 0.69 6.25 0.0544
纯误差 0.44 4 0.11
总离差 67.75 16
R2=0.9630，R2Adj =0.9153，CV=15.43%，*P<0.05，差异显著 ；**P<0.01，差
异极显著［12］
2.3 响应面交互作用分析与优化
响应面图形是响应值对各输入因子构成的三维
空间的曲面图。图 5-图7 分别显示了水提温度、水
提时间和液料比 3 组试验参数以菌质多糖得率为响
应值的趋势图。
2.4 回归模型的验证
通 过 软 件 分 析 可 以 得 到， 当 水 提 温 度 为
81.59℃，水提时间为 81.40 min，液料比为 36.42∶1
时，黑木耳菌质多糖得率有一个预测的最大值 7.92
75.0
82.5
A:≤ᨀ⑙ᓖB:≤ᨀᰦ䰤
90.0
67.5
60.030.0
45.0
60.0
75.0
90.0
9.97661
ཊ㌆
ᗇ⦷ 4.7784
5.58018
6.38197
7.18375
67.5 82.5 90.075.060.0
30
60
90
75
5.04566
4.51114
5.04566 5.58018
6.1147
6.64923
45
A:≤ᨀ⑙ᓖ
ཊ㌆ᗇ⦷
B
:≤ᨀ
ᰦ䰤 5
图 5 水提温度（A）及水提时间（B）对黑木耳菌质多糖得率影响的响应曲面和等高线图
mg/g。采用上述最优提取条件进行验证试验，试验
测得黑木耳菌质多糖得率为 7.79 mg/g。
3 讨论
采用热水浸提黑木耳菌质多糖，方法操作步骤
简单、选择分离效果好，有利于黑木耳菌质多糖活
性物质的提取。试验过程中，根据多糖提取的经验，
将影响多糖得率的因素确定为提取温度、加热时间、
液料比、醇沉浓度 4 个因素。目前，关于黑木耳菌
质多糖的提取工艺的研究较少，且主要采用单因素
试验和正交试验考察浸提时间、浸提温度、料液比
等因素对黑木耳菌质多糖得率的影响。正交试验的
次数较多，且优选结果不会超越所取水平的范围，
因而不能给进一步的试验提供明确的指向性。课题
组采用响应面分析法结合软件分析，能够检测各因
素之间的交互作用，给出考察因素和响应值之间的
一个明确的函数表达式即回归方程，从而得到整个
区域中因素的最佳组合和响应值的最优值，减少了
试验次数。
对响应面优化结果表 3 分析，回归模型 P<0.01
（P=0.0003），达到了极显著水平，该模型是有意
义 的。 回 归 模 型 的 R2=0.9630，R2Adj=0.9153， 变 异
系数为 15.43，拟合程度比较好。该模型的失拟项
P=0.0544，其影响不显著，即失拟项与纯误差没有
显著差异，说明试验操作可信，试验的理论推测可
以使用。回归方程系数进行显著性检验，水提温度
X1 及其二次项 X1
2，液料比 X3 及其二次项 X3
2 对菌
质多糖得率有着极其显著（P<0.01）的影响 ；对菌
质多糖得率影响显著（P<0.05）的因素项没有，其
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第6期192
他变量对菌质多糖得率的影响均不显著（P>0.05）。
依据系数 X1=0.81、X2=0.11、X3=-1.85 可知因素的主
效应关系为液料比 > 水提温度 > 水提时间。
响应面分析的等高线图可直观地反映各因素对
响应值的影响及最佳参数和各参数之间的相互作用，
圆形表示两因素交互作用不显著，而椭圆形与之相
反。水提温度和水提时间的交互作用显著，且水提
时间轴向等高线变化密集，水提温度轴向等高线变
化相对稀疏，故水提温度对响应值峰值的影响较水
提时间影响大。水提温度和液料比的交互作用显著，
且液料比轴向等高线变化密集，水提温度轴向等高
线变化相对稀疏，故水提温度对相应峰值的影响较
液料比影响大。水提时间和液料比的交互作用显著，
且液料比轴向等高线变化密集，水提时间轴向等高
线变化相对稀疏，故水提时间对相应峰值的影响较
液料比影响大［13-15］。
通过回归模型的验证，黑木耳菌质多糖得率的
预测值与验证值的误差仅为 1.67%，证明模型是合
理的，可用于实际检测。试验采用响应曲面法优化
得到的黑木耳菌质多糖提取条件参数准确可靠。响
应面优化黑木耳菌质多糖提取工艺，对各因素的考
察较为全面、系统，试验结果具有一定的实际应用
价值。
4 结论
采用 Box-Behnken 设计建立了黑木耳菌质多糖
得率与 3 个关键因子（水提温度、水提时间及液料比）
的二次多项式回归模型，经检验证明该模型是合理
可靠的。利用模型的响应面及其等高线分析黑木耳
菌质多糖得率的关键因子及其相互作用。最佳黑木
耳菌质多糖得率的优化条件为 ：水提温度 81.59℃，
水提时间 81.40 min，液料比 36.42∶1，菌质多糖得
率的预测值为 7.92 mg/g，验证值 7.79 mg/g。
75.0
82.5
A:≤ᨀ⑙ᓖC:⏢ᯉ∄
90.0
67.5
60.020.0
27.5
35.0
42.5
50.0
-0.175058
ཊ㌆
ᗇ⦷ 1.51809
3.21123
4.90438
6.59752
67.5 82.5 90.075.060.0
20.0
35.0
50.0
42.5
4.51114 5.04566
4.51114
5.58018
6.1147
27.5
A:≤ᨀ⑙ᓖ
ཊ㌆ᗇ⦷
C
:⏢ᯉ
∄
5
图 6 水提温度（A）及液料比（C）对黑木耳菌质多糖得率影响的响应曲面和等高线图
60.0
75.0
B:≤ᨀ⑙ᓖC:⏢ᯉ∄
90.0
45.0
30.020.0
27.5
35.0
42.5
50.0
-0.263688
ཊ㌆
ᗇ⦷ 1.10912
2.48194
3.85475
5.22756
45.0 75.0 90.060.030.0
20.0
35.0
50.0
42.5
5.04566
4.51114
4.51114
27.5
ཊ㌆ᗇ⦷
C
:⏢ᯉ
∄
5
B:≤ᨀᰦ䰤
图 7 水提时间（B）及液料比（C）对黑木耳菌质多糖得率影响的响应曲面和等高线图
2013年第6期 193赵超等 ：Box-Behnken 响应面设计法优化黑木耳菌质多糖提取工艺
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（责任编辑 李楠）