全 文 : 菌物学报
jwxt@im.ac.cn 15 March 2014, 33(2): 280‐288
Http://journals.im.ac.cn Mycosystema ISSN1672‐6472 CN11‐5180/Q © 2014 IMCAS, all rights reserved.
研究论文 Research paper DOI: 10.13346/j.mycosystema.120294
基金项目:中国博士后科学基金(No. 20110491164)
*Corresponding author. E‐mail: bianyb.123@163.com
收稿日期: 2013‐12‐26, 接受日期: 2014‐01‐20
SSR 在黑木耳和毛木耳转录组中的分布和序列特征
周雁 范秀芝 陈连福 边银丙*
华中农业大学应用真菌研究所 湖北 武汉 430070
摘 要:以黑木耳和毛木耳转录组测序获得的转录本序列为基础,采用软件 SSR Locator 对两个物种中 SSR 的数量、
分布和结构特征等方面进行分析,发现毛木耳中 SSR 的丰度和密度较黑木耳小。在两者的 SSR 中,三碱基和六碱基
重复的出现最多。对含量最多的三碱基重复序列的基序进行分析表明富含 GC 的 SSR 在这两个种的转录组中占优势
地位。
关键词:黑木耳,毛木耳,转录组,简单重复序列,基序
Distribution and sequence characteristics of SSR in the transcriptomes
of Auricularia auricula‐judae and Auricularia polytricha
ZHOU Yan FAN Xiu‐Zhi CHEN Lian‐Fu BIAN Yin‐Bing*
Institute of Applied Mycology of Huazhong Agricultural University, Wuhan, Hubei 430070, China
Abstract: Illumina Solexa sequencing technology was used to generate transcript sequences of Auricularia auricula‐judae
and A. polytricha. The number, distribution and motif characteristic of SSR in this two species were analyzed using the
software SSR Locator. The SSR abundance and density in A. polytricha were less than that in A. auricula‐judae. However,
tri‐ and hexa‐nucleotide SSR were two kinds of significantly abundant repeats in both transcriptomes. The motif analysis
of tri‐nucleotide SSR which was the most popular repeats indicated the GC‐rich repeats were the dominant SSR in both
transcriptomes.
Key words: Auricularia auricula‐judae, A. polytricha, transcriptome, SSR, motif
简单重复序列(simple sequence repeats,
SSR)广泛分布于真核生物基因组中,SSR 在基
因组进化过程中扮演着十分重要的角色,故对
SSR 的数量、构成和分布等特性的分析,有助
周雁 等 /SSR 在黑木耳和毛木耳转录组中的分布和序列特征
菌物学报
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于了解物种之间的亲缘关系(Li et al. 2009)。在
许多动物、植物和少数真菌中已开发出大量 SSR
分子标记(Dutech et al. 2007),为构建分子标
记遗传连锁图、种质资源多样性分析、比较基
因组学和分子标记辅助选择育种等领域的发展
提供了大量的分子标记资源。在植物中,由于
SSR 具有多态性高、共显性遗传、易于用 PCR
检测和在基因组上分布均匀等特点,以 EST 为
基础开发的分子标记中应用最多的是 SSR,而
且由于 EST‐SSR 来源于转录区,当它们用于种质
资源评价时表现的是转录区的差异,因而更能
反映出真实的遗传多样性;应用于分子标记辅
助选择时,可以直接进行等位基因选择;此外,
由于 EST‐SSR 的高转移性,使之非常适于比较作
图研究和合并不同遗传连锁图(Powell et al.
1996)。
随着第二代测序技术的飞速发展,基因组
和转录组测序被广泛应用于各种真核和原核生
物的分子生物学研究,为各种生物的基础研究
奠定了技术基础。随着裂褶菌 Schizophyllum
commune Fr.、灰盖拟鬼伞 Coprinopsis cinerea
(Schaeff.) Redhead et al.、灵芝 Ganoderma
lucidum (Curtis) P. Karst.、双色蜡蘑 Laccaria
bicolor (Maire) P.D. Orton 和皱木耳 Auricularia
delicata (Mont.) Henn.等蕈菌基因组测序的完
成,这使得 SSR 的查找和分子标记的开发更加
高效便利(Floudas et al. 2012;Labbé et al. 2011;
Qian et al. 2013)。对于非模式生物而言,无参
转录组测序在基因克隆、基因表达谱分析和分
子标记开发等方面的应用已非常广泛(Zalapa et
al. 2012)。
黑木耳 Auricularia auricula‐judae (Bull.)
Quél.(戴玉成和李玉 2011)和毛木耳 A.
polytricha (Mont.) Sacc.是木耳属中栽培最广泛
的两个种,是重要的食药用真菌(戴玉成和杨
祝良 2008;戴玉成等 2010)。本研究采用
Illumina 的 Solexa 测序技术分别对这两个物种
的菌丝体和子实体进行转录组测序,并在无参
转录组拼接产生的 EST 基础上,利用软件 SSR
Locator 进行 SSR 的查找,分析了黑木耳和毛木
耳的 EST‐SSR 的数量、构成、分布等特性,为这
两个物种的遗传连锁图谱的构建和分子标记辅
助选择中进一步开发利用 SSR 标记提供了序列
基础。
1 材料与方法
1.1 供试菌株
用于黑木耳转录组测序的供试菌株为
Au916,是保藏于华中农业大学应用真菌研究所
的双核体栽培菌株。
毛木耳野生菌株 APTJ6101引自四川省农业
科学院土壤肥料研究所,通过原生质体分离获
得原生质体单核体 App7。毛木耳栽培菌株
MHJY002 来源于福建省福州市闽侯县嘉永食用
菌有限公司,M2S16 是通过担孢子单孢分离获
得的 MHJY002 的孢子单核体后代之一。App7
和 M2S16 经杂交配对产生的杂交子 APM2‐16
是毛木耳转录组测序的供试菌株,现保藏于华
中农业大学应用真菌研究所。
1.2 RNA 样本的准备
分别将黑木耳菌株 Au916 和毛木耳菌株
APM2‐16 接种于液体完全培养基( liquid
complete yeast medium,LCYM)中(Horgen et al.
1989),25℃培养 7d 后收集菌丝体并保存于
–80℃超低温冰箱中保存备用。黑木耳 Au916
的子实体样本为人工接种段木上生长的成熟耳
片;而毛木耳 APM2‐16 的子实体样本是通过代
料栽培获得的成熟耳片,栽培料中含有 80%木
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屑、19%麸皮和 1%石膏,含水量 55%–60%。采
集到的新鲜子实体经无菌水洗净表面杂质后立
即保存于80℃超低温冰箱中保存备用。
1.3 RNA 的分离提取和转录组测序
联合使用 RNAiso‐mate for Plant Tissue、
RNAiso Plus和High‐Salt Solution for Precipitation
(TaKaRa)进行黑木耳菌丝体和子实体 RNA 的
分离提取。而毛木耳菌丝体和子实体的 RNA 则
使用 TRIzol 试剂盒(Invitrogen Life Technologies)
和 High‐Salt Solution for Precipitation(TaKaRa)
进行分离提取。获得的总 RNA 用 Agilent 2100
生物分析仪(Agilent Technologies)进行 RNA
完整性检测和浓度测定。
符合转录组测序建库要求的总 RNA在北京
六合华大基因科技股份有限公司深圳分公司的
Illumina HiSeq™ 2000 测序平台上完成转录组测
序,所用原始数据提交到 NCBI的 SRA(Sequence
Read Archive)数据库中,黑木耳菌丝体测序数
据的登录号为 No. SRX318366,黑木耳子实体的
登录号为 No. SRX318367,而毛木耳菌丝体和子
实体转录组测序数据的登录号分别是 No.
SRX319468 和 No. SRX319472。
每个样品经双末端测序产生的 reads 在去
除含接头的序列后用组装软件 SOAPdenovo 进
行转录组的从头组装(Li et al. 2010)。首先将存
在部分重叠的 reads 组装在一起获得重叠群
(contig);然后将 reads 比对回重叠群,通过
双末端测序的结果确定来自同一转录本的不同
重叠群和它们之间的距离,获得含未知序列的
scaffold;再进一步用双末端的信息对 scaffold
作补洞处理,最后产生两端不能再延长的 EST
序列。菌丝体和子实体的 reads 分别完成组装
后,再用 TGICL 和 CAP3 对两个样品的 EST 序列
混合后作进一步序列拼接和去冗余处理,最后
得到非冗余的 EST 序列(Pertea et al. 2003;
Huang & Madden 1999)。
1.4 SSR 的查找和分析
用软件 SSR Locator 分别对拼接完成的黑木
耳和毛木耳非冗余 EST 序列进行单至六碱基重
复 SSR 的查找和统计分析(da Maia et al. 2008),
其中单碱基重复次数至少为 20 次,二碱基重复
至少 8 次,三碱基重复至少 5 次,四碱基重复至
少 4 次,而五碱基和六碱基的重复次数在 3 次以
上。同一条序列中,100bp 范围内包含用非重复
碱基连接的多个 SSR 作为复合型 SSR 进行统计。
2 结果与分析
2.1 转录组测序和拼接
分别提取黑木耳、毛木耳的菌丝体和成熟子
实体的总 RNA,经 Agilent 2100 生物分析仪
(Agilent Technologies)检测,当 RIN(RNA
Integrity Number)值≥6.5,浓度达到 100ng/μL
以上时构建代表不同物种不同生育期的 4 个测
序文库,在 Illumina HiSeq™ 2000 测序平台上完
成转录组测序。每个样本都获得了 1G 以上的原
始 reads,通过去除含接头的 reads,进行转录组
的从头组装。黑木耳的菌丝体和子实体转录组经
组装分别获得31 233个和33 371个 EST,用TGICL
和 CAP3 软件对这两个阶段的 EST 作进一步组装
最终产生了 32 753 个非冗余 EST,序列总长度约
为 19.6Mb,N50 值为 808bp(表 1)。毛木耳的
菌丝体和子实体转录组则分别获得 43 941 个和
50 658个 EST,用同样的方法进一步拼接共获得
48 963 个非冗余 EST,序列总长度约为 19.8Mb,
与黑木耳转录组结果相似,N50 值仅有 457bp,
远低于黑木耳转录组的 N50 值(表 2)。
周雁 等 /SSR 在黑木耳和毛木耳转录组中的分布和序列特征
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表 1 黑木耳 Au916 转录组的基本信息
Table 1 General features of the Auricularia auricula‐judae Au916 transcriptome
菌丝体
Mycelium
子实体
Fruiting body
综合
Total
总原始 reads数
Number of raw reads
13 333 334 13 333 334 26 666 668
总碱基数
Total nucleotides (bp)
1 200 000 060 1 200 000 060 2 400 000 120
Q20的比例 a
Q20 percentagea
88.88% 88.00% ‐
N的比例 b
N percentageb
0.00% 0.00% ‐
平均 reads长度
Average reads length (bp)
90 90 90
重叠群数
Number of contigs
138 842 159 208 ‐
重叠群长度的 N50值
N50 length of contigs (bp)
192 202 ‐
Scaffolds数
Number of scaffolds
44 488 49 896 ‐
Scaffolds长度的 N50值
N50 length of scaffolds (bp)
470 548 ‐
ESTs数
Number of ESTs
31 233 33 371 32 753
ESTs的总长度
Length of ESTs (bp)
13 679 486 16 212 364 19 644 658
ESTs长度的 N50值
N50 length of ESTs (bp)
540 645 808
GC含量
GC content
56.50% 57.67% ‐
注:a,Q20 的比例表示测序错误率低于 1%的序列百分比;b,N 的比例是测序失败的碱基占所有序列的百分比.
Note: a, Q20 percentage indicates the percentage of sequences at a sequencing error rate lower than 1%; b, N percentage
indicates the percentage of the nucleotides which could not be sequenced.
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表 2 毛木耳 APM2‐16 转录组的基本信息
Table 2 General features of the Auricularia polytricha APM2‐16 transcriptome
菌丝体
Mycelium
子实体
Fruiting body
综合
Total
总原始 reads 数
Number of raw reads
12 627 212 13 266 670 25 893 882
总碱基数
Total nucleotides (bp)
1 136 449 080 1 194 000 300 2 330 449 380
Q20 的比例 a
Q20 percentagea
90.88% 90.37% ‐
N 的比例 b
N percentageb
0.04% 0.01% ‐
平均 reads 长度
Average reads length (bp)
90 90 90
重叠群数
Number of contigs
244 024 307 887 ‐
重叠群长度的 N50 值
N50 length of contigs (bp)
112 104 ‐
Scaffolds 数
Number of scaffolds
75 041 83 591 ‐
Scaffolds 长度的 N50 值
N50 length of scaffolds (bp)
270 284 ‐
ESTs 数
Number of ESTs
43 941 50 658 48 963
ESTs 的总长度
Length of ESTs (bp)
13 864 206 16 448 330 19 803 591
ESTs 长度的 N50 值
N50 length of ESTs (bp)
332 346 457
GC 含量
GC content
61.27% 61.02% ‐
注:a,Q20 的比例表示测序错误率低于 1%的序列百分比;b,N 的比例是测序失败的碱基占所有序列的百分比.
Note: a, Q20 percentage indicates the percentage of sequences at a sequencing error rate lower than 1%; b, N percentage
indicates the percentage of the nucleotides which could not be sequenced.
2.2 SSR 的分布和数量
用软件 SSR Locator 分别对拼接完成的
32 753 个黑木耳非冗余 EST 序列和 48 963 个毛
木耳非冗余 EST 序列进行 SSR 的查找。按查找
标准,从黑木耳转录组中共查找到 1 767 个 SSR
存在于 1 558 条 EST 中,占整个转录组 EST 总数
周雁 等 /SSR 在黑木耳和毛木耳转录组中的分布和序列特征
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的 4.76%,其中 161条 EST序列中存在多个 SSR,
这些 SSR中有 83组 SSR是复合型 SSR,平均 1Mb
中存在大约 90 个 SSR,所有 SSR 碱基数共
30 755bp,占转录组序列总长度的 0.16%(表 3)。
用同样的方法在毛木耳转录组序列中查找到
1 550 个 SSR 存在于 1 445 条 EST,占整个转录
组 EST 序列总数的 2.95%,其中 98 条 EST 序列
中存在多个 SSR,这些 SSR 中有 56 组 SSR 是复
合型 SSR,平均 1Mb 中存在大约 78 个 SSR,所
有 SSR 碱基数共 26 956bp,占转录组序列总长
度的 0.14%(表 3)。总体而言,黑木耳转录组
中 SSR 的数量要略多于毛木耳转录组。
表 3 黑木耳和毛木耳转录组中 SSR 的分布
Table 3 SSR distribution in the transcriptome of
Auricularia auricula‐judae and A. polytricha
分布特征
Characteristic of
distribution
黑木耳
A. auricula
毛木耳
A. polytricha
总碱基数
Total nuleotides (bp)
19 644 658 19 803 591
SSR总量
Number of identified SSR
1 767 1 550
含 SSR的序列数
Number of SSR
containing sequences
1 558 1 445
含多个 SSR的序列数
Number of sequences
containing more than
one SSR
161 98
复合 SSR数量
Number of SSRs present
in compound formation
83 56
SSR总长度
Total SSR length (bp)
30 755 26 956
SSR密度
SSR density (per Mbp)
90 78
黑木耳和毛木耳转录组中 SSR 的构成和分
布是基本相似的(表 4)。在所有的 SSR 中,出
现最多的三碱基重复,在黑木耳转录组中有 825
个,占总数的 46.69%,毛木耳转录组中有 741
个,占总数的 47.81%;其次为六碱基重复,在
黑木耳和毛木耳中分别含 596 个(33.73%)和
487 个(31.42%);再次为五碱基重复和四碱基
重复;单碱基重复和二碱基重复在黑木耳和毛
木耳的转录组中存在差异,黑木耳中以二碱基
重复最少,只有 19 个,而毛木耳中则以单碱基
重复最少,为 28 个。另一方面,除了黑木耳的
三碱基重复中存在 102bp 的 SSR 外,一到六碱
基重复的 SSR 在两个物种中普遍较短,平均都
为 17.4bp(表 4)。
2.3 SSR 基序的特点和性质
在黑木耳和毛木耳转录组中,SSR 基序的
数目和种类也基本相同。在单碱基重复的基序
数量上,两个不同种的转录组中是存在差异的,
其中黑木耳转录组中以 A/T 重复较多,而 C/G
重复略少一些,而毛木耳中则相反,C/G 重复
的 SSR 占单碱基重复的绝大多数(图 1)。在二
碱基重复的 SSR 中,TA/TA 基序在两个物种的转
录组中均不存在,CG/CG 基序在毛木耳中是特
异存在的,而 AT/AT 和 GC/GC 两种基序在毛木
耳转录组中是不存在的(图 1)。从数量上而言,
在二碱基重复的 SSR 中,黑木耳转录组中不同
类型基序的 SSR 均在 5 条左右,AT/AT 和 GC/GC
两种基序只有 1 条;而毛木耳转录组中的变化
幅度相对较大,以 GA/TC 基序的 SSR 最多,有
16 条,占所有二碱基重复 SSR 的 45.71%,CG/CG
基序则只有 1 条。三碱基重复 SSR 是转录组中
含量最丰富的,黑木耳和毛木耳中分别存在 29
和 26 种不同的基序,其中 ACG/CGT、AGC/GCT、
CAG/CTG、CCG/CGG、CGA/TCG、CGC/GCG、
GAC/GTC、GCA/TGC、GCC/GGC 和 GGA/TCC 等
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表 4 黑木耳和毛木耳转录组中 SSR 的数量和长度
Table 4 Abundance and length of SSR in the transcriptome of Auricularia auricula‐judae and A. polytricha
黑木耳 A. auricula‐judae 毛木耳 A. polytricha
重复单元
Repeat
unit
SSR 数量
SSR count
平均长度
Average length
(bp)
最大长度
Maximum length
(bp)
SSR 数量
SSR count
平均长度
Average length
(bp)
最大长度
Maximum length
(bp)
单碱基
Mono‐
31 24.6 32 28 23.1 40
二碱基
Di‐
19 17.2 22 35 19.2 19
三碱基
Tri‐
825 16.6 102 741 16.6 39
四碱基
Tetra‐
93 17.0 24 75 17.4 32
五碱基
Penta‐
203 16.0 30 184 15.5 25
六碱基
Hexa‐
596 18.7 30 487 18.9 42
总数
Total
1 767 17.4 102 1 550 17.4 42
图 1 黑木耳和毛木耳转录组中单碱基重复 SSR 和二碱
基重复 SSR 不同基序的频率分布
Fig. 1 Frequencies of different mono‐ and di‐nucleotide
repeats SSR motif in the transcriptomes of Auricularia
auricula‐judae and A. polytricha.
10 种基序都较多,分别在黑木耳和毛木耳中占
这类 SSR 的 84.73%和 86.23%。在黑木耳转录组
中以 CAG/CTG 基序的 SSR数量最多,有 124 个;
而毛木耳中则以 CGA/TCG基序的 SSR数量最多,
有 98个(图 2)。
黑木耳转录组中,基序为 TGCA/TGTA 和
ATCC/GGAT 的四碱基重复 SSR 在该类 SSR 中最
丰富,分别有 5 个;而毛木耳中则以 CCTC/GAGG
和 CGAG/CTCG 最丰富,分别有 6 个。基序为
CGCGC/GCGCG的五碱基重复 SSR在黑木耳转录
组 中 最 多 , 共 6 条 ; 而 毛 木 耳 中 则 以
GCCGC/GCGGC 最多,共 7 条。六碱基重复的基
序在转录组中是最丰富的,在黑木耳和毛木耳
中分别有 362 种和 314 种不同类型。在黑木耳
转录组中,基序为 CTTCTC/GAGAAG 的六碱基重
周雁 等 /SSR 在黑木耳和毛木耳转录组中的分布和序列特征
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复在该类 SSR 中最多,共 9 条;毛木耳中基序为
CTCGTC/GACGAG和 AAGGAG/CTCCTT分别有 9条
SSR,为六碱基重复 SSR中最丰富的基序类型。
图 2 黑木耳和毛木耳转录组三碱基重复 SSR 不同基序
的频率分布
Fig. 2 Frequencies of different tri‐nucleotide repeats SSR
motif in the transcriptomes of Auricularia auricula‐judae
and A. polytricha.
3 讨论
本研究用 SSR Locator这一软件对黑木耳和
毛木耳的转录组序列进行了完全和复合型重复
的 SSR 进行查找,以单碱基到六碱基重复次数
分别为 20 次、8 次、5 次、4 次、3 次和 3 次以
上为标准,从 32 753 条黑木耳转录本序列中获
得了 1 767 个 EST‐SSR,48 963 条毛木耳序列中
获得 1 550 个 EST‐SSR。本研究中所用的毛木耳
菌株杂交菌株,亲本的亲缘关系较远,而且拼
接完成的转录组序列长度的 N50 值比黑木耳的
小 1 倍左右,这可能是导致毛木耳中所得 SSR
序列相对于黑木耳要少的主要原因,因此,要
获得可靠的 SSR,需要高质量的序列拼接结果
为基础。
从 SSR 的分布密度来看,1Mb 的毛木耳转
录组序列中平均获得 78 个 SSR,比黑木耳转录
组略低,但两者的密度与已完成测序的皱木耳、
灰盖鬼伞、双色蜡蘑和灵芝基因组中密度相似
(Flouds et al. 2012;Qian et al. 2013)。在灵芝
基因组中,超过 50%的三碱基和六碱基重复 SSR
存在于编码区,而其他 4 类 SSR 绝大多数都分
布于基因间隔区(Qian et al. 2013),这与毛木
耳和黑木耳转录组中 SSR 的数量分布相类似。
这种在编码区中倾向于三碱基和六碱基重复类
型而抑制其他类别的现象,可能是生物本身为
避免因非三联体重复导致的移码突变而产生的
一种特殊机制(Metzgar et al. 2000)。
对黑木耳和毛木耳转录组中 EST‐SSR 的基
序构成和特性进行分析,在单碱基重复中黑木
耳与大多数蕈菌一样,A/T 基序相对于 G/C 要
多,而毛木耳的单碱基重复则相反,与裂褶菌
类似,G/C 基序的相对更多(Li et al. 2009;Labbé
et al. 2011;Qian et al. 2013)。在二碱基重复中,
毛木耳和黑木耳转录组中最主要的为 4 种基
序,即 AC/GT、AG/CT、CA/TG 和 GA/TC,与灵
芝、灰盖鬼伞、双色蜡蘑和裂褶菌都不同(Qian
et al. 2013)。三碱基重复 SSR 是黑木耳和毛木
耳转录组中含量最多的一类 SSR,通过对不同
基序频率分布的分析,发现大多数基序含有两
个以上的 G/C,即富含 GC 的 SSR 在毛木耳和黑
木耳转录组中占优势地位。
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Findley K, Foster B, Gaskell J, Glotzer D, Górecki P,
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