全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第2期
收稿日期 : 2011-08-25
基金项目 : 内蒙古自治区自然科学基金项目（2010BS0506）, 内蒙古自治区高等学校科学研究项目（NJ10054）
作者简介 : 孟建宇 , 男 , 讲师 , 研究方向 : 应用与资源微生物学 ;E-mail:meng_jianyu@yahoo.com.cn
蒙古口蘑子实体凝集素性质初步研究
孟建宇1 宋馨宇2
（1内蒙古农业大学生命科学学院，呼和浩特 010018 ；2天津科技大学生物工程学院，天津 300457）
摘 要 : 对蒙古口蘑干燥子实体研磨后，用磷酸盐缓冲液浸提，得到蒙古口蘑子实体的凝集素粗提物。对其性质进行分析表明，
蒙古口蘑子实体凝集素对牛血和羊血都能凝集，且对羊血的凝集作用较强 ；D-果糖、β-葡萄糖、半乳糖和木糖对蒙古口蘑子实体
凝集素均具有抑制作用 ；弱酸或弱碱性浸提液有利于凝集素的提取 ；蒙古口蘑子实体凝集素具有一定的热稳定性，直到 70℃以后
凝集红细胞的活力才丧失 ；凝集素的凝集活性对 Ca2+、Mg2+、Mn2+ 和 Fe3+ 这 4 种离子有不同程度的依赖。
关键词 : 蒙古口蘑 子实体 凝集素 糖抑制 稳定性
Primary Study on Characterization of the Lectin from Fruiting
Bodies of Tricholoma mongolicum
Meng Jianyu1 Song Xinyu2
（1College of Life Sciences，Inner Mongolia Agricultural University，Hohhot 010018 ；2College of Bioengineering，
Tianjin University of Sciences and Technology，Tianjin 300457）
Abstract: The lectin was extracted from dried fruiting bodies of Tricholoma mongolicum by phosphate buffer and its properties were
analyzed. The results showed that the lectin from fruiting bodies of Tricholoma mongolicum was able to agglutinate cattle erythrocytes and sheep
erythrocytes, and sheep red blood cell was more sensitive to the lectin. The agglutination activity could be inhibited by D-fructose, β-glucose,
galactose and xylose. The weak acid or weak base was good for extraction of the lectin. The lectin was certain stable in heat treatment, and it still
kept partial activity at 70℃ . The agglutination activity was depended on Ca2+, Mg2+, Mn2+ and Fe3+ in varying degrees.
Key words: Tricholoma mongolicum Fruiting bodies Lectin Saccharide inhibition Stability
蘑菇凝集素由于其众多的潜在功能及广泛的
分布，其相关研究越来越多。作为药用真菌重要的
药理成分，蘑菇凝集素已成为继研究蘑菇多糖之外
的另一活性物质［1］。因为具有促进有丝分裂、免
疫调节、抗增生、抗肿瘤、放松血管和降血压作用
活性，多种蘑菇凝集素已成为细胞学家、肿瘤学家、
心脑血管专家尤其是免疫学家研究焦点［1-4］。近年
来，有许多新蘑菇凝集素的提取纯化报道，相应的
性质研究比较深入，如双孢蘑菇凝集素便是研究的
相对较透彻的凝集素［5-15］。但相对于数量巨大的
蘑菇凝集素来说，已经分离和进行性质研究的只是
一小部分，仍有许多蘑菇凝集素有待开发和利用。
目前 , 我国对于食（药）用真菌的凝集素研究还处
于起步阶段［2］。
蒙古口蘑是我国北方草原出产的名贵野生食药
兼用菌，属菇类上品［16］。现代医学研究表明，蒙古
口蘑具有增强免疫、抗肿瘤、抗氧化、抗病毒、降
低血糖、抗溃疡、抗衰老、抗辐射等多方面的生物
活性和生理功能［1,2,17,18］。通过对蒙古口蘑干燥子实
体凝集素的性质进行初步分析，为进一步研究蒙古
口蘑子实体凝集素的性质提供基础资料。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 材料来源 蒙古口蘑（Tr-12）采自锡林浩特
市，新鲜血液（牛血、羊血）由呼和浩特市屠宰场提供。
2012年第2期 189孟建宇等 ：蒙古口蘑子实体凝集素性质初步研究
1.1.2 主要试剂及仪器
1.1.2.1 磷 酸 盐 缓 冲 液（PBS）：将 NaCl（80 g）、
KCl（2 g）、Na2HPO4（11.5 g）和 KH2PO4（2 g）混合，
调 pH 值为 7.4，定容至 1 000 mL，用时稀释 10 倍。
1.1.2.2 主要仪器 研钵，120 目试验专用筛，96
孔微量 V 型血凝板（姜堰市荣飞器械厂），TDL-40B
高速离心机（上海安亭科学仪器厂），JC-HH-S26S 数
显恒温水浴器（济南精诚实验仪器有限公司）。
1.2 方法
1.2.1 2% 红 细 胞 悬 液 的 制 备 取 牛 血 和 羊 血 各
100 mL，加入抗凝剂（EDTA 0.1 g），用 0.9% 的生
理盐水反复洗涤 5 次，每次 2 000 r/min 离心 5 min，
去上清，按红细胞压积用生理盐水配成 2% 的红细
胞悬液备用。
1.2.2 蒙古口蘑子实体凝集素的抽提 取干燥 Tr-12
的子实体进行分批研磨，过 120 目筛。将研磨后的
粉末按 20 mL/g 比例加入 PBS 中，置 4℃冰箱抽提
48 h 后，用 3 层纱布挤压过滤，将滤液 4 000 r/min
离心 5 min，取上清液，即得蒙古口蘑子实体凝集素
粗提液。
1.2.3 血 凝 活 性 测 定 在 96 孔 V 型 血 凝 板 上 用
40 μL 凝集素溶液与等量的生理盐水系列倍比稀释，
即 ：各孔中分别加入 40 μL 10 mmol/L 的 NaCl 溶液，
在第 1 排孔加 40 μL 子实体凝集素粗提液混匀，即
为 20 ；将第 1 排孔内稀释为 20 的液体取 40 μL，加
入第 2 排孔内混匀，即为 21 ；以此类推，直到倍
比稀释至 26 ；第 8 排孔内不加样品，只滴加 40 μL
NaCl 溶液做空白对照。稀释完毕后，每孔内边振
荡边加入等体积（40 μL）2% 红细胞悬液，振荡
1 min，将 V 型板室温静置 1-1.5 h 后观察结果，判
断凝集活性。如果凝集孔中红细胞呈膜状 , 血球相
互集聚形成一片网络，用牙签可以挑起即为有凝集
活性；如果凝集素无凝集现象，则红细胞沉淀于“V”
型孔底部，呈一红色清晰圆斑。红细胞形成薄层凝
集，均匀分布整个孔底（强凝集的边缘可出现皱缩），
判断为全凝集，记“++++”。孔内凝集范围大于孔
面积的一半、未遍及全孔的，判断为多半凝集，记
为“+++”。红细胞少许沉淀于中部，周围有浑浊带、
约占孔面积的 50%，外周液澄清者，判断为半凝集，
记为“++”。红细胞大部分沉积于孔中心，凝集点边
缘模糊者，判为少许凝集，记为“+”。若凝集素无
凝集现象则红细胞将沉积在 V 型孔底部形成清晰的
小红点状，记为“-”。凝集效价的计算以“26”为终点，
血凝活力以凝集素的最大稀释倍数 2n 表示。
1.2.4 糖抑制试验 将 96 孔血凝板各孔加入 40 μL
0.9% NaCl 溶液，在血凝板 1 号孔中加入 40 μL 蒙古
口蘑子实体凝集素粗提液，将凝集素做系列倍比稀
释。第 8 号孔以 NaCl 溶液为对照。将 40 μL 0.15 mol/L
的 D-果 糖、β-葡 萄 糖、D-半 乳 糖 和 木 糖 溶 液 分 别
加入不同浓度倍比稀释的凝集素混合液中，静置
30 min，再分别加入 40 μL 2% 牛血和羊血细胞悬液，
静置 1 h 后观察。
1.2.5 温度对凝集活力的影响 先将凝集素样品溶
于 0.9% 生理盐水中配置成浓度为 1 000 μg/mL 的溶
液。在容积为 1.5 mL 的小管中分别加入凝集素溶液
150 μL，在恒温水浴锅中于 40-90℃每隔 10℃将样
品分别保温处理 5 min，取出后用流水冷却至室温后，
检测其活性。室温样品做对照。
1.2.6 酸碱性抽提缓冲液对凝集活力的影响 将子
实体的粉末按 0.1 g 分装，分别加入 2 mL 0.05 mol/L
甘 氨 酸 缓 冲 液（pH3.0）、Tris-HCl 缓 冲 液（pH8.0）
和醋酸钠 （pH5.0）缓冲液，置冰箱中抽提 48 h 后过
滤，4 000 r/min 离心 10 min，取上清液，即得 3 种
不同 pH 值缓冲液抽提的凝集素抽提液。分别在 96
孔 V 型血凝板每排的第 1-8 孔加入与各凝集素抽提
液相同的缓冲液各 40 μL，每排第 1 孔加入由不同
pH 值缓冲液抽提的凝集素抽提液 40 μL，依次进行
倍比稀释，第 8 孔做空白对照，不加样。然后加入
血样悬液 40 μL 静置 1 h 后观察血凝活性。与磷酸缓
冲液（pH7.4）抽提的凝集素试验组做对比。
1.2.7 金属离子对凝集活力的影响 取 10 mmol/L
CaCl2 溶 液（ 或 MgCl2 或 MnCl2）40 μL， 在 96 孔 V
型血凝板上对生理盐水进行倍比稀释后，向每孔加
入经 20 mmol/L EDTA·Na2 处理过的凝集素 40 μL
振挡摇匀后，分别加入 40 μL 2% 红细胞悬液，室温
放置 2 h，显微镜下检查凝集结果。对照组以未经
EDTA·Na2 处理的凝集素及经过 EDTA·Na2 处理的
凝集素，但不加金属离子两组。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第2期190
2 结果
2.1 蒙古口蘑子实体凝集素血凝活性
按照二倍稀释法进行试验后，发现同样的凝集
素粗提液对不同的血液有不同的凝集效应。对于凝
集结果（表 1）显示的差异，可知蒙古口蘑子实体
凝集素对羊血的凝集作用略强于牛血。
2.2 蒙古口蘑子实体凝集素的糖抑制试验
通过试验组和对照组比较（表 2）可以明显看到，
4 种糖对凝集素的血凝活性都有抑制作用，是蒙古
口蘑子实体凝集素的糖抑制剂，D-果糖尤为明显。
2.3 蒙古口蘑子实体凝集素的热稳定性
将少量凝集素粗提液至于水浴锅中加热，从
40℃到 90℃之间每隔 10℃设置一个温度梯度，与室
温下的粗提液对比凝集活性，测定温度对凝血活性
的影响。结果（表 3）显示，从室温到 60℃时，凝
集活性呈现减弱的趋势，到 70℃时表现出微弱的凝
集现象，直到失去活性。蒙古口蘑子实体凝集素是
对热比较稳定的凝集素。
表 1 蒙古口蘑子实体凝集素血凝活性
凝集素效价 20 21 22 23 24 25 26
牛血组 ++++ ++ + - - - -
羊血组 ++++ +++ ++ + - - -
表 2 蒙古口蘑子实体凝集素的糖抑制结果
凝集素效价
未加糖 β-葡萄糖 D-果糖 半乳糖 木糖
牛血 羊血 牛血 羊血 牛血 羊血 牛血 羊血 牛血 羊血
20
21
22
23
24
25
26
空白
++++
++
+
-
-
-
-
-
++++
+++
++
+
-
-
-
-
+++
+
-
-
-
-
-
-
+++
++
+
-
-
-
-
-
+++
-
-
-
-
-
-
-
+++
+
-
-
-
-
-
-
+++
+
-
-
-
-
-
-
+++
++
+
-
-
-
-
-
+++
+
-
-
-
-
-
-
+++
++
+
-
-
-
-
-
2.4 不同pH值的抽提缓冲液对凝集活性的影响
由分别用 pH 值为 3.0、5.0、8.0 的浸提液抽提
的凝集素与 pH 值为 7.4 的浸提液抽提的凝集素对红
细胞的凝集效价进行对比，结果（表 4）显示，弱
酸或弱碱的浸提液更有利于凝集素的抽提，凝集效
价均高于中性缓冲液浸提的凝集素。同时，凝集结
果也显示了蒙古口蘑子实体凝集素具备一定酸碱稳
定性。
表 3 温度对蒙古口蘑子实体凝集素凝集活性的影响
凝集素
效价
pH7.4 pH3.0 pH5.0 pH8.0
牛血 羊血 牛血 羊血 牛血 羊血 牛血 羊血
20
21
22
23
24
25
26
空白
+++
+
-
-
-
-
-
-
+++
++
+
-
-
-
-
-
+++
++
+
-
-
-
-
-
++++
+++
++
+
-
-
-
-
++++
+++
++
+
-
-
-
-
++++
+++
++
+
-
-
-
-
++++
++
+
-
-
-
-
-
+++
++
+
-
-
-
-
-
表 4 不同 pH 缓冲液对蒙古口蘑子实体凝集素
凝集活性的影响
2.5 金属离子对凝集活性的影响
将用 EDTA 透析去除金属离子的凝集素、未经
EDTA 处理的凝集素与分别加入 4 种金属离子的试
验组对比，发现金属离子是凝集活性的必需因子。
将经过 EDTA 处理的凝集素与未经处理的凝集素试
温度（℃） 凝集程度
室温 ++++
40 +++
50 ++
60 +
70 +/-
80 -
90 -
2012年第2期 191孟建宇等 ：蒙古口蘑子实体凝集素性质初步研究
验结果（表 5）对比发现，处理后的凝集素凝集活
性丧失；加入 4 种金属离子后，对活性均有恢复作用，
但强弱有所不同。牛血组的结果显示，Mn2+、Fe3+
对凝集活性的恢复作用大于 Ca2+、Mg2+ 的。羊血组
的结果显示，Fe3+ 对凝集活性的恢复作用最强， Mn2+
与 Mg2+ 对凝集活性的恢复作用大于 Ca2+。
3 讨论
凝集素的细胞凝集作用是凝集素分子的一个亚
基与一个细胞表面的凝集素专一识别的糖基结合，
另一个亚基与另一个细胞上的糖基结合，从而通过
凝集素的“架桥”作用而导致的［19］。凝集素具有
特异性识别细胞表面糖残基的功能，因此可以近似
地将抑制剂与凝集素之间的关系类比为酶与底物的
“锁钥”关系。抑制剂被认为是特殊的底物，与凝集
素分子识别位点结合，从而阻止它与靶向供体的结
合［20］。本研究的糖抑制试验中果糖、半乳糖、葡萄
糖、木糖都可以与蒙古口蘑子实体凝集素结合，进
而影响蒙古口蘑的凝血效果。
利用不同 pH 浸提液抽提后，发现用弱酸或弱
碱性浸提缓冲液有利于凝集素的提取，具备一定的
酸碱稳定性。在 pH6-8 之间表现出较强的凝集活性，
这可能与蒙古口蘑的生长环境的 pH 接近，凝集素
作为一种生理活性物质，在适宜的 pH 条件下发生
较强的凝集作用是一种正常的生理反应。
凝集素的热稳定性主要取决于凝聚素活性位点
的性质，若活性位点为肽或蛋白质，由于肽链和蛋
白质在受热情况下空间构象发生改变而变性失活，
故此种凝集素的热稳定性就较差，若活性位点为糖
链，由于糖链相对于肽链和蛋白质敏感性差，故此
种凝集素的热稳定性就较强［21］。也可能在于分子内
二硫键使肽键的折叠呈现较稳定的结构［22］。热稳定
性试验表明，蒙古口蘑子实体凝集素的提取液有很
好的热稳定性，温度在 70℃处理后才彻底失去凝血
活性。这样高的热稳定性在已分离的食用菌凝集素
中是比较少见的，仅有平菇凝集素能忍受 70℃高温
的报道［7］。具体原因还有待对蒙古口蘑子实体凝集
素纯化后作进一步的结构分析。
许多凝集素都需要金属离子维持其功能，在去
除金属离子后的蒙古口蘑子实体凝集素中添加 Ca2+、
Mg2+、Mn2+、Fe3+，凝集活性均有不同程度地恢复。
这些金属离子可以使去离子的凝集素活性恢复，说
明蒙古口蘑子实体凝集素的活性需要这些金属离子
来维持。
4 结论
蒙古口蘑子实体凝集素对牛血和羊血都能凝集，
同等凝集素效价下对羊血的凝集作用较强。D-果糖、
β-葡萄糖、半乳糖和木糖对蒙古口蘑子实体凝集素
均具有抑制作用。弱酸或弱碱性浸提液有利于凝集
素的提取 ；蒙古口蘑子实体凝集素具有较好的热稳
定性，直到 70℃以后凝集红细胞的活力才丧失。蒙
古口蘑子实体凝集素的凝集活性对 Ca2+、Mg2+、Mn2+
和 Fe3+ 这 4 种离子有不同程度的依赖。
参 考 文 献
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凝集
效价
未经处理
的凝集素
凝集素经 EDTA 处理后
不加金属离子 加 Ca2+ 加 Mg2+ 加 Mn2+ 加 Fe3+
牛血 羊血 牛血 羊血 牛血 羊血 牛血 羊血 牛血 羊血 牛血 羊血
20
21
22
23
24
25
26
空白
++++
++
+
-
-
-
-
-
++++
+++
++
+
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
+/-
-
-
-
-
-
-
-
++
+
-
-
-
-
-
-
++
+
-
-
-
-
-
-
++
+
-
-
-
-
-
-
+++
++
+
-
-
-
-
-
+++
++
+
-
-
-
-
-
+++
++
+
-
-
-
-
-
+++
++
+
-
-
-
-
-
++++
+++
++
+
-
-
-
-
表 5 金属离子对蒙古口蘑子实体凝集素凝集活性的影响
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第2期192
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（责任编辑 马鑫）