全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第12期
植物的纤维组分中半纤维素约占 20%-30%，植
物光合作用产生资源的 1/3 是半纤维素［1］。半纤维素
是继纤维素后第二丰富的可再生资源，在造纸、食
品、纺织、饲料等行业具有广阔的应用前景［2］。木
聚糖（xylan）是半纤维素的重要组分，在自然条件下，
木聚糖难以被降解利用。木聚糖酶（xylanase）以内
切的方式降解木聚糖分子中 β-1，4 木糖苷键，是一
类能够降解木聚糖的复合酶系［3］。开展木聚糖酶高
产菌株的研究对木聚糖的利用具有重大意义［4，5］。
这些高产木聚糖酶菌株大多是经过多次、多种诱变
收稿日期 ：2013-7-23
作者简介 ：郑丽丽，女，硕士，研究实习员，研究方向 ：农业废弃物资源综合利用 ; E-mail ：lily_0909@126.com
通讯作者 ：盛占武，男，博士，助理研究员，研究方向 ：农业废弃物资源综合利用 ; E-mail ：shengzhanwu100@163.com
不同诱变方法对黑曲霉产木聚糖酶能力的影响
郑丽丽1  盛占武1  韩冰莹2  谭琳1  李奕星1  郭刚1
（1. 中国热带农业科学院海口实验站 海南省遗传改良重点实验室，海口 570102 ；
2. 中国热带农业科学院热带生物技术研究所，海口 571101）
摘 要 ： 利用 5 种方法对黑曲霉 AS3.350 进行诱变，研究不同诱变方法对黑曲霉产木聚糖酶的影响，获得高产木聚糖酶的
突变株。结果表明，紫外诱变获得的最优突变株酶活是出发菌株的 2.18 倍，诱变效果最为明显，其次是快中子辐照诱变，获得的
最优突变株酶活是出发菌株的 1.72 倍，硫酸二乙酯诱变、亚硝酸钠诱变、亚硝基胍诱变获得的最优突变株酶活分别是出发菌株的 1.51
倍、1.46 倍、1.38 倍，物理诱变比化学诱变对黑曲霉产木聚糖酶更为敏感。
关键词 ： 紫外诱变 快中子辐照 亚硝基胍诱变 硫酸二乙酯诱变 亚硝酸钠诱变
Effect of Different Mutation Methods on Xylanase Production
Ability by Aspergillus niger
Zheng Lili1 Sheng Zhanwu1 Han Bingying2 Tan Lin1 Li Yixing1 Guo Gang1
（1. Haikou Experimental Station，Chinese Academy of Tropical Agricultural Science，Hainan Key Laboratory of Banana Genetic Improvement，
Haikou 570102 ； 2. Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology，Chinese Academy of Tropical
Agricultural Scienses，Haikou 571101）
Abstract:  Based on the Aspergillus niger AS3.350, the mutants were brewed through inducing five treatments.The effect of different
mutation methods on enzyme production ability of Xylanase was disscused and obtained mutant strain of xylanase production high ability. The
results indicate that, the mutagenesis of UV irradiation was most obvious, and the xylanase activity was 2.18 times of the original strain.Mutagenic
effect of the fast neutron irradiation mutagenesis was second, the xylanase activity was 1.72 times of the original strain.After mutagenesis by
diethyl sulfatemutagenesis, sodium nitrite, nitrosoguanidine, xylanase activity of the best mutant strains were 1.51 times, 1.46 times, 1.38 times.
Physical mutation is more sensitive than chemical mutagenesis on increasing xylanase activity by Aspergillus niger.
Key words:  UVirradiation Fast neutron irradiation Nitrosoguanidine mutation Diethyl sulfate mutagenesis Sodium nitrite induced
方法处理得到的优良菌株。目前诱变方法主要有物
理法、化学法等，本研究重点探索紫外诱变［6，7］、
快中子辐照诱变［8］、硫酸二乙酯诱变［9，10］、亚硝
酸钠诱变［11］及亚硝基胍诱变［12］5 种方法对黑曲霉
AS3.350 在提高木聚糖酶活性程度上的优劣，为应
用木聚糖酶降解半纤维素奠定理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种 出发菌株 AS3.350 由中国科学院微生
2013年第12期 147郑丽丽等 ：不同诱变方法对黑曲霉产木聚糖酶能力的影响
物研究所提供。
1.1.2 紫外源与中子源 紫外源由上海市闻天仪器
设备有限公司的 QY-20 三用紫外分析仪。中子源是
由东北师范大学辐射技术研究所提供。
1.1.3 试剂 pH5.0 柠檬酸缓冲液，pH4.5 醋酸缓冲
液，pH6.0 磷酸缓冲液，DNS 试剂，0.5 mL/L 硫代硫
酸钠溶液，亚硝基胍（MNNG），硫酸二乙酯（DES），
亚硝酸钠（NaNO2），D- 木糖溶液。
1.1.4 培 养 基 （1）PDA 斜 面 培 养 基 配 方 ：葡 萄
糖 20 g，KH2PO4 1 g，MgSO4·7H2O 1.5 g， 马 铃 薯
200 g，琼脂粉 20 g，蒸馏 水 1 000 mL，pH 自 然 ；
（2）液体发酵培养基配方 ：KH2PO4 26 g，CaCl2 5 g，
MgSO4·7H2O 10 g，FeSO4 0.16 g，酵母膏 10 g，麸
皮 20 g，Tween-80 5 mL，pH5.0 ；（3）初筛培养基配
方［13，14］；（4）种子培养基配方：K2HPO4 1 g，KCl 0.5
g，NaNO2 2 g，MgSO4 0.5 g，FeSO4 0.01 g，蔗糖 30 g，
琼脂 20 g，蒸馏水 1 000 mL。
1.2 方法
1.2.1 菌 种 培 养 菌 种 活 化 ：取 黑 曲 霉 AS3.350
用 PDA 斜面培养基活化 2 代备用。菌种培养 ：取
活化后的 2 代黑曲霉 AS3.350 于查氏液体培养基
中，250 mL 三 角 瓶 装 液 量 50 mL， 置 于 摇 床 中
28℃，200 r/min 振荡培养 60 h。发酵培养 ：5% 的
接 种 量 接 种 种 子 液 至 发 酵 培 养 基， 装 液 量 为 50
mL/250 mL，置于摇床中 28℃，200 r/min，震荡培养
108 h。
1.2.2 菌悬液的制备 用生理盐水将 PDA 斜面培养
基中的 2 代黑曲霉 AS3.350 孢子洗脱下来，置于三
角瓶中，放入玻璃珠，置于摇床中 200 r/min 振荡 1
h，取无菌纱布过滤孢子悬液，利用血球计数板计算
孢子个数，取生理盐水稀释一定倍数，使孢子浓度
保持在 107-108 个 /mL［15，16］。
1.2.3 筛选方法 初筛 ：将菌悬液涂布于刚果红初
筛培养基上培养 60 h，用生理盐水进行脱色，挑选
透明圈较大的单菌落接种于 PDA 培养基，以备复筛。
复筛 ：将初筛得到的菌株接种于查氏液体培养基，
置于摇床中 28℃振荡培养 60 h，按照一定比例加入
到液体发酵培养基中，摇床中 28℃振荡培养 108 h，
测木聚糖酶活。
1.2.4 诱变方法
1.2.4.1 紫外诱变 诱变前紫外灯预热 20 min，待
光波稳定后取菌悬液置于无菌平板，在波长 256
nm，照射距离 15 cm，20 cm，在搅拌的状态下分别
照射 30 、60 、90、120 、150 、180 s，将照射后的
菌悬液稀释并涂布于初筛培养基。
1.2.4.2 快中子诱变 快中子剂量率为 0.0025 Gy/s，
分别照射 5、10 、15 、20 、30 min，即 0.75，1.50，2.25，
3.00，4.50 Gy5 个剂量来处理，将照射后的菌液稀释
10-2-10-6，抽取不同稀释倍数的菌液各 0.25 mL 并涂
布于初筛培养基。
1.2.4.3 亚硝酸钠诱变 分别取 0.02、0.03、0.05、
0.1 mol/L 亚硝酸钠溶液，菌悬液 1 mL 及 pH4.5 醋酸
缓冲液 2 mL，26℃分别保温 10、15、20、25 min，
加入 0.07 mol/L pH8.6 的磷酸氢二钠溶液 20 mL 终止
反应，将诱变后的菌悬液稀释并涂布于初筛培养基。
1.2.4.4 硫酸二乙酯诱变 取 0.5 mL DES 和 4.5 mL
95% 乙醇制成 DES 溶液，将 DES 溶液与菌悬液按一
定体积比混合，不同体积比（DES/ 菌悬液）分别为
0.2%、0.4%、0.5%、1%，30℃振荡处理不同的时间
20、30、40、60 min，加入 0.5 mol/L 硫代硫酸钠溶
液 2 mL 终止反应，稀释并涂布于初筛培养基。
1.2.4.5 亚硝基胍诱变 取菌悬液 1 mL，加入 1 mL
浓度分别为 0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL 的亚硝基胍溶液，
将试管放入 28℃水浴中静置 20、30、40、50 min，
向试管中加入 0.5 mol/L 硫代硫酸钠 18 mL 终止反应，
稀释并涂布于初筛培养基。
1.2.5 分 析 方 法 将 发 酵 液 过 滤， 滤 液 在 4℃，
8 000 r/min 条件下离心，取上清液即粗酶液。绘制
木糖标准曲线，分别在试管中加入 10 μmol/mL D-木
糖 溶 液 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL， 补
入 柠 檬 酸 缓 冲 液 至 1 mL， 再 加 入 3 mL DNS 煮 沸
15 min，取出后迅速冷却，加蒸馏水补至 25 mL，以
不加木糖溶液的 0 号管为对照，在 540 nm 波长处测
OD 值。木糖含量为横坐标，OD 值为纵坐标，绘制
标准曲线。
木聚糖酶活力的测定 ：取 1% 的木聚糖底物 0.9
mL 加入到 25 mL 具塞试管中，置于 50℃水浴保温
10 min，加入经柠檬酸 - 磷酸氢二钠缓冲液适当稀
释的酶液 0.1 mL，在 50℃水浴中反应 10 min，加入
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第12期148
DNS 试剂 3 mL 终止反应，煮沸 15 min，迅速冷却后
补蒸馏水至 25 mL，均匀混合，在 540 nm 波长处进
行比色。对照管中的酶液灭活后加入［17，18］。
酶活力单位定义 ：50℃，pH5.0 的条件下，每
分钟每毫升待测酶液分解底物释放出 1 μmol 还原
糖的量，计算公式如下 ：酶活力（U）=D×V1×CX/
T×V2
［11］］。其中，D ：酶液稀释倍数，V1 ：比色管定
容体积，CX：木糖摩尔浓度（μmol/mL），V2：酶液体积，
T ：酶解时间。
2 结果
2.1 紫外诱变
采用 6 个不同的照射时间和 2 个照射距离对黑
曲霉进行诱变，对黑曲霉在每个照射时间下的致死
率和正突变率进行比较，结果在波长 256 nm 及距离
20 cm 的照射条件下菌株的正突变率最高，致死率处
于 80%-90% 的理想范围。在 256 nm 照射距离为 20
cm 条件下，对黑曲霉 AS3.350 照射不同时间进行诱
变，同一条件下挑选 5 株透明圈较大的突变株进行
液体发酵培养，测定木聚糖酶活力取平均值，并与
出发菌株黑曲霉 AS3.350 进行对照，结果如图 2 所
示。在 256 nm 照射距离为 20 cm 条件下，照射时
间从 30 s 到 90 s 的突变株酶活递增，90 s 到 180 s
突变株酶活有所下降，照射时间为 90 s 的突变株
UV256-90 酶活最高为为原始菌株的 2.18 倍。因此，
黑曲霉进行紫外诱变的最佳条件为 256 nm，照射垂
直距离为 20 cm，照射时间为 90 s。
2.2 快中子照射
利用 7 个不同的的照射剂量对黑曲霉进行诱变，
当照射剂量在 0.15-4.50 Gy 范围内，致死率逐渐增加，
正突变率上升后随之下降，当剂量 0.75 Gy 时正突变
率最高，其致死率达到 40.6%，当剂量大于 4.50 Gy
时，快中子照射黑曲霉的致死率接近 100%，因此 0.75
Gy 为最佳照射剂量。在此条件下，挑选 10 株透明
圈相对较大的突变株进行液体发酵培养，测木聚糖
酶活 3 次取平均值，并与出发菌株黑曲霉 AS3.350
进行对照，结果如图 3 所示。0.75 Gy 剂量下快中子
辐照诱变的突变株酶活力均有不同程度的提高，其
中 Fn5-2 株木聚糖酶活为 134.77 U/mL，是原始菌
株的 1.72 倍。说明黑曲霉对快中子辐照比较敏感，
对黑曲霉进行快中子辐照能显著提高其产木聚糖酶
能力。
图 1 木糖标准曲线
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
O
D
54
0
0.1
0
0 2 4
y=0.1034x-0.0454
R2=0.9935
6 8
xylose concentrationsμmol/mL
240
220
200
180
160
140
120
100
80
60
40
20
突变株
AS
3.3
50
UV
25
6-6
0
UV
25
6-9
0
UV
25
6-1
20
UV
25
6-1
50
UV
25
6-1
80
UV
25
6-3
0
0
⴨ሩ
䞦⍫
%
图 2 紫外诱变突变株的 Xylanase 酶活
200
180
160
140
120
100
80
60
40
20
突变株
AS
3.3
50
Fn
5-1
Fn
5-2
Fn
5-3
Fn
5-4
Fn
5-5
Fn
5-6
Fn
5-7
Fn
5-8
Fn
5-9
Fn
5-1
0
0
⴨ሩ
䞦⍫
࣋%

图 3 快中子辐照突变株 Xylanase 酶活
2.3 亚硝酸钠诱变
利用 4 个不同浓度的亚硝酸钠溶液对黑曲霉
AS3.350 进行诱变，致死率随着亚硝酸钠溶液浓度
的增加及诱变时间的增加而增大，亚硝酸钠的浓度
为 0.1%，诱变时间为 20 min 时致死率为 90.5%，正
突变率最大达到 16.1%，属于好的诱变致死率范围。
得到最佳诱变条件为亚硝酸钠浓度为 0.1%，诱变时
间为 20 min。选取最佳诱变条件下的水解圈较大的
8 株突变株，进行液体发酵培养，测木聚糖酶酶活
力 3 次取平均值，并与出发菌株黑曲霉 S3.350 进行
对照，结果如图 4 所示。从图 4 可以看出，选出的
2013年第12期 149郑丽丽等 ：不同诱变方法对黑曲霉产木聚糖酶能力的影响
8 株突变株酶活都有不同程度的提高，其中最优突
变株 TNa-7 酶活为原始菌株的 1.46 倍。
2.4 硫酸二乙酯诱变
利用硫酸二乙酯对黑曲霉 AS3.350 进行诱变，
发现硫酸二乙酯对黑曲霉 AS3.350 的致死率与硫酸
二乙酯的浓度和诱变时间均成正比关系，随着硫酸
二乙酯与菌液比例的增大及诱变时间的增加，致
死率也随之增加。硫酸二乙酯诱变的最佳条件为 ：
DES/ 菌液体积比为 0.4%，诱变时间为 20 min，此时
正突变率最高，达 40.5%。在最佳条件下对黑曲霉
AS3.350 进行诱变处理，挑选透明圈相对较大的 8 株
突变株，进行液体发酵培养，测木聚糖酶活 3 次取
平均值，结果如图 5 所示。黑曲霉 AS3.350 经过硫
酸二乙酯的诱变，酶活均有不同程度的提高，最佳
诱变时间为 20 min，其中最优突变株 DES-1 酶活为
原始菌株的 1.51 倍。
度为 0.5% 诱变时间为 20 min 正突变率最高，致死
率也在较优范围，因此 MNNG 诱变的最佳条件为 ：
MNNG 浓度 0.5%，诱变时间 20 min。在最佳条件下
选透明圈相对较大的 8 株突变株，进行液体发酵培
养，测木聚糖酶活 3 次取平均值，结果如图 6 所示。
8 株突变株酶活力均有不同程度的提高，但效果并
不显著，其中最优突变株 MNNG-7 酶活是原始菌株
的 1.38 倍。
180
160
140
120
100
80
60
40
20
菌株
AS
3.3
50
TN
a-1
TN
a-2
TN
a-3
TN
a-4
TN
a-5
TN
a-6
TN
a-7
TN
a-8
0
⴨ሩ
䞦⍫
%
图 4 亚硝酸钠诱变突变株 Xylanase 酶活
180
160
140
120
100
80
60
40
20
突变株
AS
3.3
50
DE
S-1
DE
S-2
DE
S-3
DE
S-4
DE
S-5
DE
S-6
DE
S-7
DE
S-8
0
⴨ሩ
䞦⍫
࣋%

图 5 硫酸二乙酯诱变突变株 Xylanase 酶活
2.5 亚硝基胍诱变
利用 4 种不同浓度的亚硝基胍溶液对黑曲霉
AS3.350 进 行 诱 变， 发 现 MNNG 对 黑 曲 霉 的 致 死
率是 3 种化学诱变方法中最高的，MNNG 浓度在
0.3%-0.5% 范围内，正突变率随浓度增大而增大，
当浓度大于 0.5% 正突变率有所下降，在 MNNG 浓
160
140
120
100
80
60
40
20
突变株
AS
3.3
50
MN
NG
-1
MN
NG
-2
MN
NG
-3
MN
NG
-4
MN
NG
-5
MN
NG
-6
MN
NG
-7
MN
NG
-8
0
⴨ሩ
䞦⍫
%
图 6 亚硝基胍诱变突变株 Xylanase 酶活
3 讨论
本试验采用 5 种诱变方法对黑曲霉 AS3.350 进
行诱变，考察各种方法对黑曲霉产木聚糖酶能力的
影响，其中 2 种物理诱变（紫外诱变和快中子辐照）
对黑曲霉产木聚糖酶相对敏感，在提高木聚糖酶活
效果显著，并且物理诱变具有设别简单操作方便的
优点，缺点是能耗较高。化学诱变剂对黑曲霉产木
聚糖酶的敏感度不及物理诱变方法，但具有一定的
诱变作用，木聚糖酶活力有不同程度的提高，化学
诱变的优点在于诱发的变异较为稳定，缺点是某些
化学诱变剂具有强的毒副作用，不易操作。在实际
应用中，可根据不同需要和目的选择适当的诱变
方法。
4 结论
紫外诱变的最佳条件为 ：波长 256 nm，照射
垂 直 距 离 20 cm， 照 射 时 间 90 s， 得 到 的 突 变 株
UV256-90 产木聚糖酶 酶活为 170.79 U/mL，是原始
菌株的 2.18 倍。快中子诱变的最佳条件为 ：照射
剂量 0.75Gy，得到突变株 Fn5-2 产木聚糖酶酶活为
134.77 U/mL，是原始菌株的 1.72 倍。硫酸二乙酯诱
变的最佳条件为 ：DES/ 菌液体积比 0.4%，诱变时间
20 min，得到的突变株 DES-1 酶活为原始菌株的 1.51
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第12期150
倍。亚硝酸钠诱变的最佳条件为 ：亚硝酸钠浓度为
0.1%，诱变时间为 20 min，得到的突变株 TNa-7 酶
活为原始菌株的 1.46 倍。亚硝基胍诱变的最佳条件
为 ：MNNG 浓度 0.5%，诱变时间 20 min，得到的突
变株最优突变株 MNNG-7 酶活是原始菌株的 1.38 倍。
参 考 文 献
［1］ 阮同琦 , 赵祥颖 , 刘建军 . 木聚糖酶及其应用研究进展［J］.
山东食品发酵 , 2008（1）：42-45.
［2］ Ruanglek V, Sriprang R, Ratanaphan N. Cloning, expression,
characterization, and high cell-density production of recombinant
endo-1, 4-β-xylanase from Aspergillus niger in Pichia pastoris［J］.
Enzyme and Microbial Technology, 2007, 41（1-2）：19-25.
［3］ 徐君飞 , 张居作 . 木聚糖酶的应用研究进展［J］. 农产品加工 ,
2007, 8 ：58-59.
［4］ 李秀婷 . 微生物木聚糖酶及在食品工业中的应用［J］. 农业机
械学报 , 2008, 39（2）：175-179.
［5］ 王修启 , 邢宝松 , 张兆敏 , 等 . 小麦基础日粮添加不同水平木
聚糖酶对猪生产性能的影响［J］. 华北农学报 , 2003, 18（3）：
114-116.
［6］ 廖春丽 , 万亚涛 , 李亚平 , 等 . 溶藻菌株 NP23 的紫外诱变选
育［J］. 生物技术通报 , 2012（6）：174-178.
［7］ 杨玉红 , 于雪骊 , 刘长江 . 紫外诱变选育多聚赖氨酸高产菌株
的研究［J］. 北方园艺 , 2007（9）：45-46.
［8］ 韩冰莹 , 陈光 , 王刚 , 费卓群 . 快中子与 DES 复合诱变选育高
产木聚糖酶黑曲霉菌株［J］. 饲料工业 , 2012, 33（10）：29-
31.
［9］ 张卫兵 , 梁 琪 , 乔海军 , 等 . 紫外线和硫酸二乙酯诱变高产凝
乳酶地衣芽孢杆菌的研究［J］. 食品工业科技 , 2012, 33, （5）：
174-177.
［10］ 罗红霞 , 陈志刚 , 孙玉清 , 等 . 硫酸二乙酯诱变选育乳酸菌菌
株的研究［J］. 中国乳品工业 , 2009, 37, （10）：20-23.
［11］ 吕熹 , 王刚 , 李俊 , 等 . 紫外、亚硝酸钠诱变筛选高产耐有
机溶剂脂肪酶菌株［J］. 吉林农业大学学报 , 2010, 32（4）：
394-397.
［12］ 李海娜 , 苏移山 , 朱希强 , 郭学平 . 亚硝基肌诱变选育乳链菌
肤高产菌株［C］. 生化与生物技术药物学术研讨会论文集 ,
四川 ：绵阳 , 2010 ：235-241.
［13］ 黄运红 , 龙中儿 , 李素珍 . 木聚糖酶高产微生物的筛选和鉴
定［J］. 江西师范大学学报报 ：自然科学版 , 2002, 6（3）：
245-248.
［14］ 江均平 , 严自正 , 张树政 . 海枣曲霉木聚糖酶降解寡聚木糖的
特性［J］. 生物化学与生物物理学报 , 1995, 27（3）：287-92.
［15］ 王聪 , 张光杰 . 木聚糖酶高产黑曲霉的选育及其酶学性质研
究［J］. 生物技术通报 , 2010（6）：227-230.
［16］ 陈凤莲 , 朱兴杰 , 许世玉 , 方桂珍 . 黑曲霉的紫外诱变及其液
体发酵产木聚糖酶［J］. 哈尔滨商业大学学报 , 2009, 25（1）：
47-50.
［17］ 李彩霞 , 房桂干 , 刘书钗 . 木聚糖酶酶活测定方法［J］. 纸和
造纸 , 2011（1）：60-61.
［18］ 武玉波 , 冯秀燕 . 木聚糖酶酶活测定方法的研究［J］. 中国饲
料 , 2008（4）：34-36.
（责任编辑 李楠）