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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第9期
胰 高 糖 素 样 多 肽 1（Glucagon-like peptide-1，
GLP-1）是由肠道 L 细胞合成和分泌的一个由 30 个
氨基酸组成的具有促进胰岛素分泌功能的多肽，其
既能增强葡萄糖依赖性的胰岛素分泌、减少食物的
摄取、减慢胃的排空，以及抑制胰高血糖素的分泌、
刺激胰 β 细胞增殖，促进胰岛再生，又能抑制胰 β
收稿日期 ：2013-03-05
基金项目 ：江苏省科技支撑计划（BE2009629）
作者简介 ：冯均尚，男，硕士研究生，研究方向 ：微生物与生化药学 ；E-mail ：syufjs@163.com
通讯作者 ：许正宏，男，博士，教授，研究方向 ：发酵工程，微生物与生化药学 ；E-mail ：zhenghxu@jiangnan.edu.cn
融合蛋白 GGH N 端延长类似物的克隆表达、
纯化及活性研究
冯均尚1  窦文芳1  张晓梅1  许泓瑜1  史劲松2  许正宏1
（1. 江南大学药学院制药工程研究室，无锡 214122 ；2. 江南大学药学院生物活性制品加工工程研究室，无锡 214122）
摘 要 ： GGH 是人胰高血糖素样肽-1 与人血清白蛋白融合蛋白（GLP-1A2G）2-HSA 的简称，为研究 N 端添加丙氨酸的修饰
对其活性的影响，通过基因工程方法成功构建表达该类似物的工程菌，并纯化得到终产物，完成了初步体外活性检测。首先运用
PCR 技术扩增出融合蛋白 GGH 类似物的基因片段，以 pPIC9K 为表达质粒构建了重组表达质粒，将双酶切和测序验证正确的重组
质粒电转至分泌型菌株毕赤酵母 GS115，然后经过 MD 平板筛选获得转化子，利用甲醇诱导表达 72 h，SDS-PAGE 检测上清产物与
未修饰的 GGH 对比，得到阳性转化子。融合蛋白经过发酵液 8 000 r/min 离心 10 min，0.45 μm 的微孔滤膜微滤，采用截留分子量
为 10 kD 的超滤膜超滤 20 倍，再依次经过 Blue Sepharose 6 Fast Flow、Phenyl Sepharose Fast Flow、Q Sepharose Fast Flow、Sephadex G-25
层析柱。在 RINm5f 细胞上测 cAMP 的生成，通过与阳性对照的标准曲线对比发现，A-GGH 活性比 GGH 提高 10 倍，表现出较好
的体外活性。
关键词 ： 融合蛋白 GGH 类似物 毕赤酵母 表达 纯化 活性
Expression，Purification and Bioactivity of Fusion Protein GGH
Analogue with N-terminal Extension
Feng Junshang1 Dou Wenfang1 Zhang Xiaomei1 Xu Hongyu1 Shi Jinsong2 Xu Zhenghong1
（1. Laboratory of Pharmaceutical Engineering，School of Pharmaceutical Science，Jiangnan University，Wuxi 214122 ；2. Laboratory of
Bioactive Products Processing Engineering， School of Pharmaceutical Science，Jiangnan University，Wuxi 214122）
Abstract:  GGH is a fusion protein of two human glucagon-like peptide-1 mutant and human serum albumin. In order to check the
influence of the extension of an alanine to the N-terminal of GGH, we constructed recombinant plasmid pPIC9K/A-GGH capable of expressing
the analogue in the methylotrophic yeast P. pastoris GS115. Recombinant strain P. pastoris GS115 was screened through MD plates. After 72 h of
inducing by 2% methanol at 30℃, the fusion protein was purified from fermentation broth by centrifugation, ultrafiltration concentration, affinity
absorption chromatography, ion exchange chromatography and gel filtration. Activity test result suggested that A-GGH showed better activity in
vitro and that its cAMP level was significantly increased by 10-fold compared to GGH without N-terminal extension.
Key words:  Fusion protein GGH Analogue Pichia pastoris Expression Purification Bioactivity
细胞的凋亡［1-4］，因此是治疗二型糖尿病的潜在药
物。但是，由于 GLP-1 在体内易被二肽酰基肽酶Ⅳ
（DPP Ⅳ）降解和肾脏清除导致半衰期短，且频繁的
注射给药不便于病人的使用，限制了其临床应用［5，6］。
为克服 GLP-1 半衰期短、易降解等缺点，本实
验室前期通过重叠 PCR 将两个 GLP-1 突变串联体
2013年第9期 125冯均尚等 ：融合蛋白 GGH N 端延长类似物的克隆表达、纯化及活性研究
分子与一个人血清白蛋白 HSA 分子融合得到融合
蛋白 GGH，并实现了其在巴斯德毕赤酵母（Pichia
pastoris）中的表达［7］。初步的药代动力学显示，融
合蛋白在小鼠体内吸收半衰期为 26.6 h，消除半衰
期达到 57.8 h，而且保留了 GLP-1 的生物活性，但
融合蛋白没有体现出两个 GLP-1 应有的活性。为了
提高融合蛋白 GGH 的活性，本研究从蛋白质的寿命
信号出发，对其 N 端进行特定氨基酸延长［8-10］，构
建毕赤酵母表达菌株并纯化得到类似物 A-GGH，进
行初步的体外活性检测，旨在为 GGH 成药的临床药
效学试验提供可能，也为提高重组蛋白的生物活性
提供新的修饰方法。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌体载体和细胞 大肠杆菌 E.coli JM109 和
毕赤酵母表达菌株 GS115 由本实验室保存，质粒
pPIC9K-GGH 由本实验室构建并保存，质粒 pMD-
19T Simple Vector 购自 TaKaRa 公司，pPIC9K 为 Inv-
itrogen 公司产品，RINm5f 细胞购自北京肿瘤医院。
1.1.2 主要试剂 各种限制性内切酶、Ex Taq DNA
聚合酶、T4 DNA 连接酶、DNA 和蛋白 Marker 等购
自 TaKaRa 公司，质粒抽提试剂盒、DNA 凝胶回收
试剂盒、PCR 产物纯化试剂盒均购自上海捷瑞生物
有限公司，酵母氮源培养基为上海生工产品，引物
由上海生工生物有限公司合成，其余试剂均购自国
药集团化学试剂有限公司。
1.1.3 主 要 仪 器 PCR 仪、 蛋 白 电 泳 仪、 核 酸 电
泳 仪 均 购 自 美 国 Bio-Rad 公 司， 凝 胶 成 像 仪 购 自
美国 UVP 公司，ÄKTApurifier 全自动层析仪购自美
国 GE 公司，Labscale 超滤系统购自美国 Millpore 公
司，高压蒸汽灭菌锅购自日本 Tomy Digital Biology
公司。
1.2 方法
1.2.1 融合蛋白 GGH 类似物基因的扩增 设计合成
分别带有 SnaB Ⅰ和 Not Ⅰ两种酶切位点的 GGH 类
似物的引物，引物序列见表 1。以 pPIC9K/GGH 为
模板，PCR 反应条件为 ：94℃预变性 4 min，94℃变
性 30 s，56℃退火 45 s，72℃延伸 2 min，共 35 个循环，
72℃延伸 10 min，4℃保存。以 PA、PH 为引物，扩
增出 A-GGH 的基因 ；PCR 产物经过 1% 琼脂糖凝胶
电泳检测后，用 DNA 胶回收试剂盒回收。
表 1 引物序列
引物名称 引物序列（5-3） 酶切位点
PA GAGGTACGTAAAAAGAGCT CACGGTGA-
AGGTACTTTCACT
SnaB Ⅰ
PH TGAACCGCGGCCGCTATAAGCCTAAGGC-
AGCTTG
Not Ⅰ
1.2.2 重组表达载体 pPIC9K/A-GGH 的构建 用 T4
连接酶将扩增出的类似物的基因与 pMD-19T Simple
Vector 相连并转化至 E.coli JM109，用含有 100 μg/mL
氨苄青霉素的 LB 平板筛选阳性克隆，分别用菌液
PCR 和双酶切验证，得到阳性转化子送菌液测序，
确认没有突变后抽提质粒，用 SnaB Ⅰ和 Not Ⅰ双
酶切类似物的重组克隆载体 pMD-19T-A-GGH，割
胶回收得到类似物的基因连接至毕赤酵母表达载体
pPIC9K，重组表达载体热激转化至 E.coli JM109，用
含有 100 μg/mL 氨苄青霉素的 LB 平板筛选阳性克
隆，分别用菌液 PCR 和双酶切验证，得到阳性转化
子送菌液测序，确认无突变后抽提质粒，得到类似
物 A-GGH 的重组表达载体 pPIC9K/A-GGH。
1.2.3 重 组 表 达 质 粒 的 线 性 化 和 电 转 化 酵 母 细
胞 分别取 5-10 μg 鉴定和测序正确的重组质粒
pPIC9K/A-GGH，用 Sal Ⅰ单酶切使之线性化，琼脂
糖凝胶电泳回收 9.5 kb 片段，-20℃保存备用。按文
献［11］制备毕赤酵母 GS115 感受态细胞，取出 80 μL
和 5 μL（100 ng）的线性化的重组表达质粒 pPIC9K/
A-GGH 混合，Bio-Rad 电转仪于 1.5 kV、25 μF、200
Ω、时间常数 5 ms 电转化，立即加入 600 μL 1 mol/L
冰浴山梨醇，移液枪吹打均匀，再将内容物全部转
移到无菌的 1.5 mL EP 管，加入 600 μL YPD 培养基，
在 30℃条件下孵育 2 h。取 400-600 μL 涂布于 MD
平板上，30℃培养 2-3 d 至出现转化子。
1.2.4 阳性转化子的鉴定与发酵表达 提取转化子
的 基 因 组 DNA， 加 入 RNase A 消 除 RNA 的 干 扰，
以 PA、PH 为引物，对提取的酵母基因组 DNA 进
行 PCR 扩增验证。同时将转化子进行摇瓶发酵表
达，挑单菌落至 10 mL YPD 于 30℃、200 r/min 摇床
上活化培养 24 h，按照 4% 的接种量接种到 120 mL
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第9期126
BMGY 相同条件培养 24 h，静置沉降 6-8 h，弃上清，
换 40 mL BMMY 在相同条件下诱导培养，2% 甲醇
诱导表达，每 24 h 诱导一次，诱导表达 72 h，冷冻
离心取上清与野生菌 GS115 诱导表达产物、GGH 表
达产物用 SDS-PAGE 检测对照得到高表达转化子。
1.2.5 表达产物的分离纯化 发酵液 8 000 r/min 冷
冻离心 8 min，分子量 10 kD 的 biomax 的超滤膜浓缩
20 倍，加水调节样品电导至 12.0 mS/cm。调节样品
的 pH 值 7.1 左右，上样于平衡后的 Blue Sepharose
6 Fast Flow 层析柱，流穿后，洗脱液（4 mmol/L 磷
酸盐缓冲液 +20 mmol/L NaCl+0.2 mol/L 精氨酸）洗
脱 杂 蛋 白， 洗 脱 液（4 mmol/L 磷 酸 盐 缓 冲 液 +20
mmol/L NaCl+0.8 mol/L 精氨酸）洗脱得到目的蛋白
液。用硫酸铵调节样品的电导值 120.0 mS/cm，上样
于平衡后的 Phenyl Sepharose 6 Fast Flow 层析柱，20
mmol/L 的磷酸盐洗脱得到目的蛋白液。调节样品
的电导值 2.8 mS/cm，上样于平衡后的 Q Sepharose
Fast Flow 层析柱，洗脱液（20 mmol/L 磷酸盐缓冲液
+0.05 mol/L NaCl）洗脱杂蛋白，洗脱液（20 mmol/L
磷酸盐缓冲液 +0.2 mol/L NaCl）洗脱得到目的蛋白
液。样品上样于平衡的 Sephadex G-25 凝胶层析柱，
交换缓冲体系为 20 mmol/L 的磷酸盐缓冲液，冻干
备用。
1.2.6 GGH 类似物体外活性的初步测定 根据标准
品，空白和样品数确定所需的板条数，预留总活性
及空白测定微孔，加入 150 μL 缓冲液到 NSB 微孔 ；
加入 100 μL 缓冲液到零标准品微孔 ；加入 100 μL 标
准品或样本到其余各微孔 ；加入 50 μL cAMP 偶联物
到除总活性及空白测定微孔外的各微孔 ；加入 50 μL
cAMP 抗体溶液到除 NSB 测定微孔、总活性及空白
测定微孔外的各微孔 ；以粘和带封闭微孔，置于水
平轨迹微板混匀器上室温下孵育 2 h（25℃，250 r/
min）；洗板，倾空各微孔并以洗涤缓冲液使用多通
道移液器冲洗，重复洗 4 次，冲洗毕倒出微孔内残
存液体，清洁纸巾擦拭干净 ；总活性测定微孔内加
入 5 μL cAMP 偶联物 ；所有微孔内加入对硝基苯磷
酸酶作用物 200 μL，于试验架顶部室温下避光孵育
1 h ；所有微孔内加入反应终止溶液 100 μL ；以酶标
仪（检测波长 405 nm 吸光率，调整范围 570-590 nm）
快速测定各微孔吸光度值（optiealdensity，OD）。
2 结果
2.1 GGH类似物表达载体pPIC9K/A-GGH的构建
PCR 扩增结果（图 1）显示，A-GGH 的基因大
小为 2 000 bp ；与 pMD-19T Simple Vector 连接后菌
液 PCR 琼脂糖凝胶验证图略，双酶切验证结果（图
2） 显 示， 重 组 质 粒 为 4 700 bp 左 右， 目 的 基 因
2 000 bp，pMD-19T Simple Vector 为 2 700 bp，因此
大小验证正确，而且测序结果正确 ；与 pPIC9K 连
接后的菌液 PCR 琼脂糖凝胶验证图略，双酶切验证
结果（图 3）显示，重组质粒为 11 000 bp 左右，目
1 M
2000
bp
1 ：A-GGH 基因的 PCR 产物 ；M ：DNA Marker DL2000
图 1 A-GGH 基因的扩增
1M 2
5000
2000
bp
M ：DNA Marker DL5000 ；1 ：亚克隆质粒 pMD-19T/A-GGH ；
2 ：Not I 与 SnaB I 双酶切重组质粒
图 2 重组质粒 pMD-19T/A-GGH 的双酶切验证
M2M1 1 2
9416
2000
bp
M1 ：DNA Marker DL5000 ；M2 ：Hind III DNA Marker ；1 ：重组表达质粒
pPIC9K/A-GGH ；2 ：Not I 与 SnaB I 双酶切重组表达质粒
图 3 重组质粒 pPIC9K/A-GGH 的双酶切验证
2013年第9期 127冯均尚等 ：融合蛋白 GGH N 端延长类似物的克隆表达、纯化及活性研究
的基因 2 000 bp，pPIC9K 为 9 300 bp，因此大小验
证正确，而且测序结果正确。
2.2 PCR与SDS-PAGE鉴定重组毕赤酵母阳性克隆
以提取重组毕赤酵母的基因组 DNA 为模板，以
PA、PH 为引物，按照 1.2.1 PCR 扩增条件进行扩增，
大小为 2 000 bp，验证正确，结果图略 ；发酵诱导
表达的 SDS-PAGE 分析（图 4）显示，转化子的表
1M 2 3kD
116.0
66.2
45.0
35.0
25.0
18.4
14.4
M ：蛋白 Marker ；1 ：阳性对照 GGH 的表达产物 ；2 ：阴性对照 P.pastoris
GS115 表达上清 ；3 ：阳性转化子 P. pastoris GS115/pPIC9K/A-GGH 表达产物
图 4 毕赤酵母转化子诱导表达 GGH 类似物 SDS-PAGE 图
达产物条带大小与阳性对照一致，而阴性对照没有
表达相同大小的条带，类似物的目的条带有表达，
大小符合理论，至此成功表达类似物 A-GGH。
2.3 表达产物的分离纯化
发酵液上清经过超滤浓缩 20 倍，加水稀释调节
电导为 Blue Sepharose 6 FF 上样的平衡液的电导 12
mS/cm，调 pH7.2。Blue Sepharose 6 FF 在上样淋洗
后，观察流穿液为黄绿色且有分层现象，0.2 mol/L
精氨酸洗脱可以得到峰 2（图 5），SDS-PAGE（图
6）检测其为杂蛋白和部分结合不牢的目的蛋白，0.8
mol/L 精氨酸洗脱峰 3 为主要的目的蛋白。Phenyl
Sepharose 6 FF 上样后会有一个流穿峰 1，去除的是
分子量较大的内毒素和杂蛋白，20 mmol/L 磷酸盐
洗脱峰 2 为目的蛋白。Q Sepharose Fast Flow 对白蛋
白有较强的吸附性，每毫升基质可以吸附 120 mg 的
HSA，达到精细纯化的要求，可以进一步除去分子
量较小的内毒素，0.05 mol/L NaCl 洗脱可以除去部
0 20 40 60 80 100
0
20
40
60
80
100
120
1
2
3
0
80
160
240
320
400
Elution timemin
C
on
du
ct
iv
ity
mS
/c
m

A
28
0 m
A
U

A280
Conductivity
1
0 20 40 60 80 100 120
0
500
1000
1500
2000
2500
0
20
40
60
80
100
Elution timemin
A
28
0 m
A
U

A280
Concentration
C
on
ce
nt
ra
tio
n%
B

3
2
10 20 30 40 50 60
0
15
30
45
60
1
2
75
0
10
20
30
40
A280
Conductivity
C
on
du
ct
iv
ity
mS
/c
m

A
28
0
mA
U

Elution timemin15 30 45 60 75 90 105 120
0
100
200
300
400
0
20
40
60
80
100
A280
Concentration
C
on
ce
nt
ra
tio
n%
B

Elution timemin
A
28
0 m
A
U

1
2
A B
C D
（A）Blue Sepharose 6FF 层析出峰图 ： 1 ：流穿峰 ；2 ：0.2 mol/L 精氨酸洗脱峰 ；3 ：0.8 mol/L 精氨酸洗脱峰。（B）Phenyl Sepharose 6 FF 层析出峰图 ：1 ：流穿峰 ；2 ：
20 mmol/L PB 洗脱峰 ；3 ：水洗脱峰。（C）Q Sepharose 6 FF 层析出峰图 ： 1 ：0.05 mol/L NaCl 洗脱峰 ；2 ：0.2 mol/L NaCl 洗脱峰。（D）Sephadex G-25 层析出峰图 ：
1 ：蛋白出峰 ；2 ：盐出峰
图 5 凝胶层析阶段出峰图
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第9期128
分结合不紧的蛋白，0.2 mol/L NaCl 洗脱峰为目的蛋
白洗脱峰。凝胶 Sephadex G-25 进行脱盐，将缓冲体
系交换为 20 mmol/L 的磷酸盐缓冲液。
通过 N 末端的延长修饰来探索这种修饰方法对于融
合蛋白 GGH 生物活性的影响，成功地构建了类似物
的表达菌株，并纯化得到纯度较高的产物，体外活
性初步显示 A-GGH 是有应用潜力的类似物。虽然有
细胞生物学理论认为蛋白的寿命取决于 N 末端的氨
基酸，但是本研究所采用的丙氨酸是使蛋白质稳定
的，但这不是绝对的，因为蛋白质在不同的表达系
统中可能遭到不同的环境的影响，例如不同系统产
生的蛋白酶的降解。目前 Pichia pastoris 与 CHO 表
达系统是应用最广泛也是最有潜力的重组蛋白表达
系统，然而 CHO 系统与 Pichia pastoris 相比，不仅
可以进行准确地翻译与转录后的修饰，使表达的蛋
白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近
于天然蛋白分子，而且其培养周期也比较短，降低
了外界环境对表达蛋白活性的不利影响，下一步工
作我们会尝试 CHO 表达系统。
基因工程药物特别是蛋白质类药物的活性直接
受生产过程的影响，本研究融合蛋白 GGH 类似物经
过亲和层析、疏水层析、阳离子交换层析与脱盐，达
到了较高的纯度，但由于步骤较多，使得收率不高，
而且长时间的纯化过程可能造成融合蛋白的活性的
丧失，因此有必要寻求更加简洁的纯化方法，在保
证产物纯度的基础上减少步骤，提高收率。有研究
对 GLP-1 和白蛋白的融合蛋白进行一步免疫亲和的
纯化［12］，我们将会尝试在重组蛋白两端添加亲和标
签，以此减少纯化步骤，提高纯化的效率，减少了
外界环境对产物的稳定性和活性的不利影响。
本研究通过对融合蛋白 GGH 的 N 端修饰，利
用试剂盒检测 cAMP 的生成，可以精确地达到定量
与定性，体外活性显示 A-GGH 是具有应用潜力的类
似物，为了临床试验研究，接下来将会做小鼠体内
的糖耐量试验，以检测在体内的降血糖活性的高低。
N 端是蛋白发挥功能的重要部位，添加的氨
基酸很可能直接影响其生物活性，融合蛋白 GGH
N 端的修饰提高了母体蛋白的活性，这可能是由于
修饰提高了其稳定性，一方面可能是修饰的氨基酸
残基阻止了蛋白酶与蛋白的结合位点，相关研究有
Exendin-4 的糖基化的一个类似物即体现出抗蛋白酶
降解的能力［13］；另一方面可能是新增残基的稳定性
比较高，难于降解，但这些作用机制仍然有待验证，
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9
116
kD
66.2
45
35
25
18.4
14.4
M ：蛋白 Marker ；1 ：发酵液上清 ；2 ：超滤弃液 ；3 ：上清超滤浓缩 20 倍 ；
4 ：亲和层析流穿液 ；5 ：0.2 mol/L 精氨酸洗脱 ；6 ：0.8 mol/L 精氨酸洗脱 ；
7 ：疏水流穿峰 ；8 ：20 mmol/L PB 洗脱峰 ；9 ：离子交换层析 0.2 mol/L NaCl
洗脱峰
图 6 融合蛋白纯化的 SDS-PAGE 图
2.4 GGH类似物的体外活性的检测
根据 cAMP 试剂盒说明书测得数据，处理成如
图 7 的曲线，通过与阳性对照曲线的趋势对比发现，
GGH 的类似物 A-GGH 具有明显的产生 cAMP 的能
力，而且该类似物在产生相同 cAMP 时对应的蛋白
浓度是 GGH 的 1/10，因此相同的药物的量，A-GGH
的体外活性是 GGH 的 10 倍，即本研究的修饰对
GGH 的活性起到了显著的提高。
0.01 0.1 1 10 100 1000 10000
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
cA
M
Pp
m
ol
/w
el
l
Proteinnmol/L
Exendin-4
GGH
A-GGH
HSA
图 7 GGH 类似物体外活性测定结果图
3 讨论
本研究主要从蛋白质的 N 末端的氨基酸入手，
2013年第9期 129冯均尚等 ：融合蛋白 GGH N 端延长类似物的克隆表达、纯化及活性研究
N 端的氨基酸的延长对于生物活性的影响机制也需
要进一步的研究验证。
4 结论
本研究尝试对融合蛋白 GGH 的 N 端进行添加
丙氨酸的延长修饰，成功构建了表达该类似物的重
组菌株 P. pastoris GS115/pPIC9K/A-GGH ；摇瓶发酵
该重组菌，控制 2% 的甲醇浓度，经过 72 h 的诱导
表达，估算表达量达到 150 mg/L ；经过 Blue Sepha-
rose 6 Fast Flow、Phenyl Sepharose Fast Flow、Q Sepha-
rose Fast Flow、Sephadex G-25 四步层析，得到纯度
达 97% 的产物 ；初步的体外活性显示 A-GGH 的活
性比 GGH 提高了 10 倍。
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）