全 文 :·综述与专论· 2015, 31(12):34-41
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN
脂肪氧合酶(Lipoxygenase,LOX,EC1.13.11.12)
是一类含有非血红素铁,能够专一催化氧化含有 Z,
Z-1,4-戊二烯结构的多元不饱和脂肪酸,形成具有
共轭双键的脂肪酸氢过氧化物的双加氧酶[1]。LOX
的催化反应过程如下 :(1)连接共轭双键的 C 原子
发生脱氢作用 ;(2)自由电子发生重排向 +2 或者 -2
位转移,同时在此过程中产生变位异构体 ;(3)在
带有自由电子的 C 原子发生双加氧反应,并在此过
程中产生手性异构体(图 1)。一般情况下,LOX 的
天然底物为亚油酸、亚麻酸和花生四烯酸,不同来
收稿日期 :2015-04-21
基金项目 :国家自然科学基金项目(31401638),国家高技术研究发展计划项目(2011AA100905)
作者简介 :刘松,男,博士,研究方向 :酶工程 ;E-mail :liusong@jiangnan.edu.cn
通讯作者 :堵国成,男,博士,研究方向 :发酵工程 ;E-mail :gcdu@jiangnan.edu.cn
脂肪氧合酶结构、分子改造与发酵研究进展
刘松1 陆信曜1 周景文1 堵国成1 陈坚1,2
(1. 江南大学工业生物技术教育部重点实验室,无锡 214122 ;2. 江南大学粮食发酵工艺与技术国家工程实验室,无锡 214122)
摘 要 : 脂肪氧合酶(EC 1.13.11.12)能专一催化氧化含有 Z,Z-1,4-戊二烯结构的多元不饱和脂肪酸,形成具有共轭双键的
脂肪酸氢过氧化物,广泛应用于食品加工、化工、医药等领域。1932 年首次在大豆中发现脂肪氧合酶以来,人们已在多种动植物
组织和微生物中检测到脂肪氧合酶。广泛的来源使脂肪氧合酶结构亦呈现多样性,包括经典结构、融合结构、无 N 端 β-折叠结构
及含锰离子结构等。为提高应用性能,定点突变和融合自组装双亲短肽等分子改造技术已用于提高脂肪氧合酶比酶活和热稳定性。
基于发酵法的天然优势,构建高产脂肪氧合酶的重组菌成为近年研究的热点。总结了典型脂肪氧合酶的结构、分子改造及发酵法
生产研究进展,旨为后续研究提供参考。
关键词 : 脂肪氧合酶 ;结构与功能 ;分子改造 ;发酵
DOI :10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.12.005
Research Advance on the Structure,Molecular Modification,and
Fermentation of Lipoxygenases
Liu Song1 Lu Xinyao1 Zhou Jingwen1 Du Guocheng1 Chen Jian1,2
(1. Key Laboratory of Industrial Biotechnology of Ministry of Education,Jiangnan University,Wuxi 214122 ;2. National Engineering
Laboratory for Cereal Fermentation Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122)
Abstract: Lipoxygenases(EC1.13.11.12)catalyze and oxidize the polyunsaturated fatty acids containing Z, Z-1, 4-pentadiene
structures to form the conjugated hydroperoxides of fatty acid, and they are widely used in food industry, chemical industry and pharmaceutical
industry. Since lipoxygenase was firstly discovered in soybean in 1932, it has been detected in many animal and vegetable tissues as well as
microorganisms. Broad sources led to various structure types of lipoxygenase, including classic, fusing, β-sheet deleted, and Mn2+-containing
structures. To improve the application performance, molecular modification techniques, such as site-directed mutagenesis and fusing with self-
assembling amphiphilic peptides, have been used to enhance the specific activity and thermal stability of lipoxygenase. Considering the natural
advantages of fermentation method, the construction of recombinant strains producing high-yield lipoxygenase has become the research hotspot
recently. The advances on the structure, molecular modification, and fermentation of classic lipoxygenases were briefly summarized for providing
a reference for further studies.
Key words: lipoxygenase ;structure and function ;molecular modification ;fermentation
2015,31(12) 35刘松等 :脂肪氧合酶结构、分子改造与发酵研究进展
随着 LOX 应用领域的拓展,获得应用性能优
良的 LOX 并实现其高效生产成为国内外相关研究的
重要方向。对各来源 LOX 结构与功能的解析,是理
性改造 LOX 的重要前提。目前,商品化的 LOX 主
要来源于大豆提取,其批次稳定性易受大豆产地和
同工酶的影响,不利于其应用推广[25]。基于质量稳
定性、生产周期和成本方面的优势,发酵法生产是
LOX 工业化生产的首选方法。本文简要总结了典型
LOX 的结构、分子改造及发酵法生产的研究进展,
旨为其后续应用性能改造及生产提供参考。
1 脂肪氧合酶的结构
1.1 脂肪氧合酶结构类型
LOX 广泛分布于动植物和原核生物,其分子
结构类型多样。基于结构域组成,大致分为四类 :
(1)经典结构(图 2-A):LOX 分子 N 端为多个反向
平行的 β-折叠组成的桶状结构域,分子量在 25-30
kD ;C 端由 α-螺旋组成的催化结构域,在催化活性
中心含有一个非血红素铁,分子量在 55-65 kD ;植
物和哺乳动物 LOX 一般为此类结构。(2)融合结构
(图 2-B):具有该类结构的 LOX 的末端融合了其他
酶分子。如珊瑚 LOX N 端融合一个丙二烯氧合酶分
子,鱼腥藻 LOX N 端融合了具有过氧化氢酶特征的
结构域[26]。(3)无 N 端 β-折叠结构(图 2-C):已
发现细菌 LOX 具有该类结构。如 P. aeruginosa 42A2
LOX 分子仅由 α-螺旋组成,其 N 端 α-螺旋形成“盖
子”状结构,覆盖在底物结合区域上方(图 2-C)。
(4) 含 锰 离 子 结 构 :禾 顶 囊 壳(Gaeumannomyces
graminis)等少数真菌 LOX 催化活性中心含有一个
锰离子[27]。目前尚无这类酶晶体结构的报道。
1.2 脂肪氧合酶结构域的功能
关于结构域功能的研究主要集中于具有经典结
构的 LOX。研究人员分别对该类 LOX 的 N 端 β-折
叠结构域与 C 端催化结构域的功能进行了深入分析。
LOX N 端 β-折叠结构与胰脂肪酶的 C2 结构域
(亦称为 PLAT 结构域)相似,表明该 β-折叠可能同
样参与了酶与膜的结合[31,32]。事实上,缺失或定
点突变大豆[33]、兔子[34]、珊瑚[35]和人[36]等来源
LOX 的 β-折叠结构域,不仅能改变酶与生物膜的结
合能力,还能引起底物亲和力、转化数、结构稳定
H H
COOH
COOH
COOH
Oxygen insertion
Radical rearrangemen
Hydrogen abstraction
COOHCOOH
COOH
HOO
C.
[+2] [-2]
H C.
C. 3
33
3
OOH
图 1 LOX 催化的反应过程[3]
源 LOX 对于同种底物的催化效率存在的差异[2]。
LOX 来源多样,在生物体内参与多种重要生
命活动。1932 年,Andre 等[4] 首次在大豆中发现
了 LOX,是不饱和脂肪酸氧化引起豆腥味形成的关
键酶。LOX 催化形成的脂肪酸氢过氧化物进一步
酶解成茉莉酸等信号分子,调节破损植物细胞的程
序性死亡、细胞性别、生长和发育及抵御外界胁迫
等[5,6]。LOX 还分布于鼠[7]、兔[8]和人[9]等哺乳
动物中,参与白细胞三烯等信号分子的合成,影响
炎症、细胞程序性死亡、哮喘和心脏病等生理或病
理过程[10,11]。藻类[12]、真菌[13]及酵母[14]等真
核微生物也是 LOX 的重要来源。在这些生物体中,
LOX 参与细胞间信号传导过程及具有抑菌作用的细
菌内酯合成等[15,16]。最近,人们在念珠藻(Nostoc
punctiforme)[17,18] 和 铜 绿 假 单 胞 菌(Pseudomonas
aeruginosa)[19]等原核生物中发现了 LOX,但其生
理功能尚不清楚[20]。
基于特殊的催化作用,LOX 已在食品、化工、
医药和造纸等工业应用或展现了较大的应用前景。
LOX 催化产生的脂肪酸氢过氧化物能够破坏 β-胡萝
卜素的双键结构,从而提高面粉白度。随着溴酸钾
和过氧化苯甲酰化学增白剂的禁用,无毒、无害的
LOX 成为其最具竞争力的替代产品[21]。LOX 合成
的部分不饱和脂肪酸氢过氧化物经酶解等可生成不
同香味化合物,较化学合成香料具有更高的商业价
值[22]。LOX 催化产生的不饱和脂肪酸氢过氧化物可
用于涂料、洗涤剂、聚氯乙烯、染料等化工产品的
生产。LOX 将花生四烯酸转化为能抑制淋巴细胞增
殖的前列腺素 E2、D2 和 F2α 等
[23]。LOX 能够降低造
纸沉积物中的沥青含量,对纸浆进行漂白和脱墨[24]。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.1236
性、活性中心铁离子的可逆结合能力发生变化。这
些结果表明,N 端 β-折叠结构域尽管对 LOX 催化活
性是非必需的,但能一定程度上调节酶整体结构与
催化活性中心。研究还发现,兔 LOX 可能通过 N 端
β-折叠结构域随溶剂环境变化产生“摆动”来调节
酶结构和活性[37]。软珊瑚(Gersemia fruticosa)LOX
的晶体结构显示,β-折叠结构域保守序列 FPCYRW
中 Trp107 与其 C 端催化结构域中的 Lys172 之间存
在一个阳离子 - 芳环作用,进而影响催化结构域底
物结合口袋的构象[38]。上述研究从分子水平上揭示
了 N 端 β-折叠结构域调节 LOX 结构与活性的机制。
已知晶体结构的 LOX 中,催化活性中心均位于
C 端 α-螺旋结构域,非血红素铁参与构成催化活性
中心。由于 LOX 底物为疏水性不饱和脂肪酸,各来
源酶的底物结合通道主要由亮氨酸、异亮氨酸、缬
氨酸和苯丙氨酸等具有疏水性侧链的氨基酸残基组
成[20]。但不同 LOX 的底物结合通道各具特点(图 3):
兔子 12/15-LOX 底物结合区域呈较浅的“靴形”;柳
珊瑚 8R-LOX 存在一个两头通透的“U 形”底物结
合通道 ;大豆 LOX-1 则形成“T 形”底物结合通道。
由于无法得到结合氧分子的 LOX 晶体结构,目前仅
通过定点突变预测氧分子入口。兔 12/15-LOX L367
突变增加的空间位阻降低了氧分子扩散,表明该位
点是可能的氧分子入口[39];大豆 LOX-1 中的氧分
子扩散通道则受到 Ile553 调控[28];柳珊瑚 8R-LOX
的氧分子通道尚不清楚。
1.3 脂肪氧合酶结构与产物特异性的关系
基于 LOX 催化反应的特点,其产物特异性主要
包括位置异构体特异性和手性异构体特异性[40]。尽
管尚无理论能够解释所有 LOX 的产物特异性,但针
对真核生物 LOX 的相关研究已取得一定进展。
通过结构模拟确定了黄瓜 LOX 分子影响产物
特异性的 H608,将该氨基酸突变为缬氨酸后,催化
产物由亚油酸 13 位氢过氧化物变为 9 位氢过氧化
N-ᵛㄟβ-ᣈਐ४
α-㷪४ LOX㔃ᶴฏ
щҼ✟≗ਸ䞦㔃ᶴฏ
N-ᵛㄟ
α-㷪४ NㄟLoopL6 Loop
C-ㄟۜॆ४ฏ
A B
C
Ღփ㔃ᶴ ⽪മ
A :大豆 LOX-1 晶体结构(PDB No :1YGE)[28];B :柳珊瑚 LOX-丙二烯氧合酶融合蛋白晶体结构(PDB No :
3DY5)[29];C :P. aeruginosa 42A2 LOX 晶体结构(奶酪色为两个 α-螺旋形成的 N 端盖子结构,白色部分为催化结
构域,橙色为氧进入活性中心的通道,盖子下方空腔显示的是结合在酶分子中的磷脂)[30]
图 2 LOX 的结构
2015,31(12) 37刘松等 :脂肪氧合酶结构、分子改造与发酵研究进展
物[41]。序列比对分析揭示了哺乳动物 LOX 分子中
存在与产物位置异构体特异性相关特征区域,如人
体 15-LOX 417-418 位氨基酸等[42]。底物结合研究
显示,哺乳动物 15-LOX 通过分子内底物结合口袋
与底物(甲酯化的不饱和脂肪酸)疏水端结合,酶
分子表面与底物亲水端的碱性氨基酸残基结合,进
而控制位置异构体的比例[43]。因此,LOX 催化产物
的位置异构体类型可能受底物进入催化活性中心方
式的影响,单点氨基酸可改变该产物特异性。目前,
已在真核 LOX 的 C 端发现了与产物手性异构体相关
的保守序列,命名为“coffa site”。LOX 分子在该位
点的保守氨基酸为丙氨酸和甘氨酸时,产物的手性
异构体分别为 S 型和 R 型[44-46]。随着不同来源 LOX
底物通道的深入解析[20],其产物手性异构体特异性
的分子机制将被进一步阐明。
近年来,部分结合底物或底物类似物的 LOX 晶
体结构被解析,如来源于哺乳动物的 15-LOX2 与底
物类似物[47]和 8R-LOX 与底物[48]的复合物晶体结
构等,为 LOX 催化机制及产物特异性的研究提供了
更精确的结构信息。
2 脂肪氧合酶的分子改造
多数真核生物 LOX 具有较高的热稳定性,分子
改造主要以提高酶催化效率为目标。如前所述,大
豆等植物 LOX 的 C 端结构域为催化活性区域,N 端 β-
折叠结构域对 LOX 活性有重要调控作用。研究显示,
缺失 N 端 β-折叠区域能使大豆 LOX 疏水区域的暴
露增多、酶分子柔性增加,比酶活提高 3 倍,但热
稳定性下降[49,50]。在橄榄 LOX-1 的 C 端结构域中,
分别将底物结合位点 Phe277 和 Tyr280 突变为侧链
体较小的丙氨酸和异亮氨酸残基后,LOX-1 突变体
比酶活提高 93 倍[51]。
作者对 P. aeruginosa BBE LOX 热稳定性和比酶
活进行了改造。结构分析显示,P. aeruginosa LOX
N 端 30 个氨基酸残基及分子内部 201-206 位氨基酸
残基均为高柔性的 loop 结构(图 2-C)。通过缺失了
N 端 前 30 个 氨 基 酸,P. aeruginosa LOX 于 50℃ 的
半衰期较野生酶提高 2.1 倍,比酶活亦保持 90% 以
上[52]。将该 Gly201 和 Gly206 之间的序列替换为刚
性更强的 PT linker,LOX 热稳定性有进一步提高[52]。
由于 LOX 底物主要为疏水性的不饱和脂肪酸,作者
将疏水较强的自组装双亲短肽(图 4-A)融合至 P.
aeruginosa LOX N 端,使其比酶活及 50℃半衰期分
别提高 2.8 倍和 3.6 倍,并指出寡聚化是融合酶热稳
定性提高的重要原因之一[53](图 4-B)。
3 脂肪氧合酶的发酵法生产
目前,商品化的 LOX 主要从大豆中提取。由于
大豆中存在多种 LOX 同工酶,其含量和种类随大豆
的批次变化,导致 LOX 的产品质量不稳定[25]。与
传统提取法相比,微生物发酵法能保证 LOX 产品
批次稳定性的同时,产量更高、生产成本更低。由
于产量极低或致病性等原因,自然环境中筛选得到
的 LOX 生 产 菌, 如 寄 生 水 霉(Saprolegnia parasi-
tica)[54]、G. graminis[55]和 P. aeruginosa[56]等,不
适合工业生产。因此,构建高产重组菌成为发酵法
生产 LOX 的关键。
ᓅ⢙
L386
L432
L628
R183
Y179
R429
Fe3+
B ḣ⧺⪊LOX
ބ15-LOX 1418
F353
O2
L408
L367
R403
L597
Fe3+
1593A ᓅ⢙
L541
L546
T259
V354
R707 1553
R203
O2
Fe3+
C བྷ䉶LOX1 ᓅ⢙
图 3 LOX 底物通道和氧分子通道示意图[20]
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.1238
真 核 生 物 LOX 异 源 表 达 已 有 大 量 报 道, 但
总体产酶水平不高。其中,大豆 LOX 在大肠杆菌
(Escherichia coli)中的表达量最高(4.5 U/mL),但
为胞内表达[57]。通过融合不同分泌信号肽,豌豆[58]、
猪白细胞[59]和 G. graminis[55]等来源的 LOX 可被
酿酒酵母或毕赤酵母分泌至培养基中,但产量极低,
远不能满足工业化生产要求。原核生物来源 LOX
的异源表达同样面临表达量低、难分泌至胞外等问
题。 尽 管 N. punctiforme[17]、P. aeruginosa[60] 等 多
个原核生物 LOX 在大肠杆菌中表达,但未见产量
的相关报道。最近报道显示,鱼腥藻(Anabaena sp.
PCC 7120)LOX 在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
168 nprB 介导下可被 B. subtilis WB800 分泌至胞外,
实现了 LOX 在食品级宿主中表达的突破[61]。但按
标准酶活定义计算[57],其胞外 LOX 产量仅为 0.01
U/mL,产酶水平有待进一步提高。作者的研究发
现,P. aeruginosa LOX 的天然信号肽可促进其在 E.
coli BL21(DE3)中分泌[40],经 3 L 罐表达条件优
化,胞外 LOX 酶活达到 8.3 U/mL[62]。然而,较低
的产酶温度(20℃)是 LOX 的工业化生产亟待解决
问题[62]。
由于发酵法产 LOX 的总体水平不高,从发酵
液中提取 LOX 的报道较少。目前尚需多步柱纯化
才能获得较高纯度的 LOX,且酶活收率低,纯化技
术仍停留于研究阶段。重组 B. subtilis WB800 分泌
的 LOX 需经 DEAE-Sephacel、Sephadex G-100 和 Ni-
NTA agarose 三步柱纯化才能达到电泳纯,酶活收
率仅为 5%[61]。在重组 E. coli 中获得 13.5 倍纯化的
LOX 需经 Q High Performance 和 Mono Q 两步柱纯化,
酶活收率也仅达到 10%[40]。导致收率低的重要原因
之一,可能是上述重组 LOX 的稳定性不佳[40]。因此,
进一步提高 LOX 的稳定性,压缩纯化工艺流程是实
现工业规模纯化 LOX 的关键。
4 结论
随着应用研究的深入,LOX 在食品加工、化工、
医药等领域展现良好的应用前景。在此背景下,如
何获得具有良好应用性能的 LOX 并实现其高效发酵
生产,将是 LOX 后续研究的重点。由于目前尚无可
供工业化生产的野生菌株,基于食品级表达系统(枯
草芽孢杆菌、解脂亚洛酵母和米曲霉等)构建高效
分泌 LOX 的重组菌是实现发酵法生产 LOX 最紧迫
的任务之一。基于分泌效率的优势,原核生物来源
的 LOX 较真核生物来源的 LOX 更适于通过基因工
程菌进行工业化生产。然而,与大豆脂肪氧合酶相比,
原核生物来源(如 P. aeruginosa BBE 和 P. aeruginosa
42A2 等)LOX 的热稳定较差[40]。因此,加强对原
核 LOX 热稳定性改造同样应引起足够重视。
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A
B
⮿≤ᙗሑ㚊
LOX Linker ৼӢ⸝㛭Ӣ≤䶒 ⮿≤䶒
Ӣ≤ח⮿≤ח ⭥㦧 + + + +- ---
A :自组装双亲短肽结构 ;B :自组装双亲短肽促进 LOX 寡聚化
图 4 融合自组装双亲短肽提高 LOX 热稳定的机制
2015,31(12) 39刘松等 :脂肪氧合酶结构、分子改造与发酵研究进展
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(责任编辑 狄艳红)