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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第10期
收稿日期 : 2012-04-08
基金项目 : 河南省科技攻关重点项目（092102310069）
作者简介 : 郭端强 , 男 , 讲师 , 硕士 , 研究方向 : 环境微生物学 ; E-mail: gdqlyh@hncj.edu.cn
通讯作者 : 单林娜 , 女 , 教授 , 博士 , 研究方向 : 环境生物技术 ; E-mail: lnshan@hncj.edu.cn
随着工业化和城市化进程的加快，我国含氮
废水进入水体引发的水质恶化及富营养化问题日益
严重，因此氮素污染问题亟待解决。生物脱氮技术
因其经济、有效、易操作、无二次污染等特点，是
近年来的研究热点之一。传统生物脱氮包括好氧硝
化和厌氧反硝化两个过程，即硝化细菌在好氧条件
下进行氨氧化形成硝酸盐氮，反硝化细菌在厌氧
或缺氧的条件下将硝酸盐氮或亚硝酸盐氮还原为
N2，硝化和反硝化两个过程需要在两个隔离的反应
器中进行。但自 20 世纪 80 年代 Robertson 等［1］首
次分离出好氧反硝化细菌泛养副球菌（Paracoccus
pantotropha）、假单胞菌属的某一种（Pseudomonas
一株好氧反硝化细菌的分离鉴定及反硝化特性研究
郭端强 刘海龙 万亚涛 李小卫 陈艳艳 管丽冰 单林娜
（河南城建学院，平顶山 467000）
摘 要： 通过对采集水样进行富集培养，利用溴百里酚蓝（BTB）选择性培养基初筛和活性测定复筛得到一株好氧反硝化
细菌 N22，发现该菌在好氧条件下能有效去除培养液中的 NO3--N。硝酸盐氮初始浓度为 125 mg/L，培养 40 h后硝酸盐氮去除率达
86.39%；扫描电镜照片显示，菌株 N22为短杆菌，无鞭毛，大小约为（0.75-1.25）μm×（0.5-0.75）μm范围内，菌落表面呈乳白色。
通过形态、生理生化特征及 16S rRNA 基因序列分析，初步判断菌株 N22为不动杆菌属 Acinetobacter sp.。反硝化性能测试结果表明，
该菌反硝化作用的最适温度为 25-30℃，pH值 7.0。
关键词： 好氧反硝化 不动杆菌 16S rRNA 系统发育
Isolation and Identification of an Aerobic Denitrifier and Its
Denitrifying Characteristic
Guo Duanqiang Liu Hailong Wan Yatao Li Xiaowei Chen Yanyan Guan Libing Shan Linna
（Henan University of Urban Construction，Pingdingshan 467000）
Abstract: An aerobic denitrifying bacterial strain N22 was isolated from water using selective medium. The reduction efficiency was up
to 86.39% under aerobic conditions after 40 hours respectively with initial NO3--N concentration of 125 mg/L. The morphology of strain N22 was
a brevibacillus with an average size of （0.75-1.25） μm×（0.5-0.75） μm and an ivory-white surface. N22 was identified as Acinetobacter sp. by
morphological/biochemical characteristics and molecular properties. The denitrifying experiment results showed that the optimal conditions for
the aerobic denitrification were about 25-30℃ and at pH7.0.
Key words: Aerobic denitrification Acinetobacter sp. 16S rRNA Phylogenetic analysis
sp.）和粪产碱菌（Alcaligenes faecalis）等以来，好
氧反硝化细菌的分离及其反硝化性能的研究与应用
得到了迅速发展［2-4］，并发展出在有氧条件下同步
硝化反硝化的污水处理脱氮新工艺［5］。利用好氧反
硝化细菌进行生物脱氮，可以大大降低投资费用和
系统运行成本，是最经济的脱氮方法［6］。因此，开
展其生物学特性的研究对好氧反硝化细菌的应用具
有重要的理论价值和实践意义。
本研究从河南省平顶山市白龟山水库大坝下
游水体分离得到一株能在好氧条件下进行高效反硝
化的菌株，命名为 N22，对其形态、生理生化特
性、系统进化进行了研究，鉴定该菌为不动杆菌
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第10期206
Acinetobacter sp.。对 N22的反硝化能力及影响因素
温度和 pH 进行了初步探讨，旨在为好氧反硝化细
菌用于生物脱氮的工程实践提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株来源 菌株分离样品采自河南省平顶山
市白龟山水库大坝下游水体。
1.1.2 培养基
1.1.2.1 液体培养基（LB） KNO3 2 g，K2HPO4 1 g，
KH2PO4 1 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，柠檬酸钠 5 g，微
量盐溶液 2 mL ；蒸馏水 1 000 mL，用 1 mol/L NaOH
调节 pH7.0-7.3 ［4］。
1.1.2.2 溴百里酚蓝（BTB）选择性培养基 琼脂 20 g，
KNO3 1 g，KH2PO4 1 g，FeCl2·6H2O 0.5 g，CaCl2·
7H2O 0.2 g，MgSO4·7H2O 1 g，琥珀酸钠 8.5 g，BTB
（1% 溶于酒精）1 mL ；蒸馏水 1 000 mL，用 1 mol/L
NaOH 调节 pH7.0-7.3［7］。
1.1.2.3 反硝化培养基（测定性能） KNO3 0.6 g，
KH2PO4 1 g，K2HPO4 1 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，柠檬
酸钠 5 g ；蒸馏水 1 000 mL，用 1 mol/L NaOH 调节
pH7.0。
灭菌条件 ：所有培养基经 121℃，灭菌 20 min。
1.2 方法
1.2.1 好氧反硝化菌的筛选
1.2.1.1 采样与富集 将采集的水样与泥样先在 LB
液体培养基中培养 18-24 h 后，将培养物在 LB 培养
基固体平板中进行稀释涂布，选取生长良好的单个
菌落反复划线分离进行纯培养。
1.2.1.2 初筛与复筛 将富集培养得到的单菌落涂布
于 BTB 培养基上，30℃恒温培养 3 d 后，挑取周围培
养基出现蓝色的单菌落作为初筛菌。将初筛菌以 2%
接种量接种于装有 100 mL 反硝化培养基的 500 mL 三
角瓶中，30℃、120 r/min 摇床培养 2 d，进行复筛。
1.2.1.3 菌株好氧反硝化活性的测定 将筛选菌株
接种于 LB 培养基中，30℃、120 r/min 摇床振荡培
养 12 h，此时 OD600 值为 1.4 左右。按 10%（体积
比）的接种量接种到装有 100 mL 反硝化培养基的
500 mL 三角瓶中，30℃，120 r/min 下摇床振荡培养，
每隔 4 h 取样 1 次，每次取样 3 瓶，先测定细菌光
密度 OD600，然后经 3 500 r/min 离心，取上清液测定
亚硝酸盐氮和硝酸盐氮。
测定方法 ：硝酸盐氮采用酚二磺酸分光光度
法［8］，亚硝酸盐氮采用 N-（1-萘基）-乙二胺分光光
度法［9］，菌体量采用比浊法，pH 用精密 pH 试纸测定。
1.2.2 菌株的鉴定
1.2.2.1 形态学鉴定 将筛选菌株于 LB 平板上划
线，获得单菌落，观察其菌落形态；用扫描电镜（SEM）
KYKY-EM3200 观察其形态、大小等。
1.2.2.2 生理生化鉴定 依据《常见细菌系统鉴定
手册》［10］进行。
1.2.2.3 16S rRNA 的扩增测序和系统发育分析 用
于 16S rRNA PCR 反应的引物为通用引物，PF：5-GA-
GCGGATAACAATTTCACACAGG-3，PR：5-CGCCA-
GGGTTTTCCCAGTCACGA-3，大连宝生物公司合
成。PCR 反应体系（50 μL）：5 μL 10×PCR 缓冲液，
3.5 μL MgCl2，0.5 μL 模 板 DNA，0.5 μL PF 和 PR，
2 μL dNTP，1 μL Taq DNA 聚合酶，37 μL 超纯水。
PCR 扩增程序为：94℃预变性 5 min；94℃变性 60 s，
50℃退火 60 s，72℃延伸 90 s，循环 30 次 ；72℃延
伸 5 min。PCR 产物直接测序。测序由宝生物工程有
限公司完成。将 16S rRNA 所测序列通过 BLAST 检
索程序与 GenBank 中已知 16S rRNA 序列一起进行
分析，利用 CustalX1.8 进行序列比对，用 MEGA5.0
构建系统发育树。
2 结果
2.1 菌株的分离筛选
经 3 次富集筛选得到 9 株反硝化菌株，分别测
定其反硝化能力，筛选到一株好氧反硝化能力较强
的菌株 N22。
2.2 菌株N22的反硝化能力
以 NaNO3 为唯一氮源，测定菌体生长过程中
NO3--N 和 NO2--N 的变化，确定菌株 N22在好氧条
件下的反硝化能力。从图 1 中可以看出，N22对该
反硝化培养基具有较强的反硝化能力，培养 40 h 后
将 NO3--N 从 125.578 mg/L 降至 17.085 mg/L，脱氮
率 86.39%。菌株 N22在 24 h 进入对数生长期，其
反硝化作用明显加强。在整个培养过程中，出现了
亚硝酸盐的积累，于 40 h 达到其最大积累值为 2.986
2012年第10期 207郭端强等 ：一株好氧反硝化细菌的分离鉴定及反硝化特性研究
mg/L，培养 52 h 后 NO2--N 浓度降至 0.766 mg/L，很
少积累 NO2--N。菌株 N22的生长停滞期为 24 h，说
明适应新环境能力较弱，但是其对数期较长，达
16 h 左右，这对该菌株应用于环境工程领域有着积
极的意义。
度为 125 mg/L 左右时，20℃时，细菌生长与反硝化
性能发挥表现出了较明显的抑制作用 ；25℃时，脱
氮率为 85.01% ；30℃时，脱氮率达到 86.39% 以
上。温度上升到 35℃时，脱氮率下降到 79.42%。因
此，菌株 N22在 25-35℃温度范围内都具有较高
的脱氮效率。菌株 N22的反硝化最适宜的温度为
25-30℃。
图 1 菌株 N22的好氧反硝化活性曲线
2.3 pH对菌株N22反硝化能力的影响
等量接种对数期生长的菌株 N22，在 30℃条
件下培养。图 2 表明，pH 值对菌株 N22的反硝化
能力影响显著。不同 pH 值下，反硝化效率不同。
pH 为 7.0 时能获得最大的反硝化效率，其脱氮率
能达到 86.39%。pH 为 5.0 和 6.0 时的反硝化率分
别为 61.15% 和 66.21%，pH 为 8.0 时的反硝化率为
60.49%。可见在酸性（pH≤6.0）和碱性（pH≥8.0）
的条件下，菌株好氧反硝化能力较弱。由上可知，
菌株 N22的反硝化最适宜的 pH 为 7.0 左右。
图 2 不同 pH下菌株 N22反硝化特性
2.4 温度对菌株N22反硝化能力的影响
本试验设置了 20℃、25℃、30℃、35℃共 4 个
不同的温度条件，将处于对数期的菌株 N22接种到
培养液中，培养 40 h 之后，找出温度与好氧反硝化
效率的关系（图 3）。从图 3 中可以看出，温度对菌
株 N22的反硝化效率的影响显著。起始 NO3- -N 浓
图 3 不同温度下菌株 N22的反硝化特性
2.5 菌株 N22的鉴定
2.5.1 形态学鉴定 菌株 N22的菌落形态表观为
边缘整齐、圆形隆起、表面光滑、呈乳白色、不透
明。扫描电子显微镜照片（图 4）显示，菌株 N22
为短杆菌，无鞭毛，大小约为（0.75-1.25）μm×
（0.5-0.75）μm 范围内。
图 4 菌株 N 22 的扫描电子显微镜照片
2.5.2 生理生化鉴定 生理生化鉴定结果如表 1
所示。
2.5.3 16S rRNA 的序列测序及系统进化分析 获
得菌株 N22的 16S rRNA 基因序列（1 479 bp），在
GenBank 序列登录号为 JQ687406。在 GenBank 数据
库中通过 Blast 方法比对，采用 MEGA 5.0 软件用 NJ
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第10期208
法构建进化树（图 5）。用于系统发育树构建的相关
参比菌株的细菌名称、菌株编号和序列登录号见表
2。结果表明，菌株 N22与多株 Acinetobacter sp. 的
同源性达 99%。根据形态特征、生理生化特性和
16S rRNA 的同源性分析，初步鉴定菌株 N22为不
动杆菌属 Acinetobacter sp. 的细菌。
有助于解决传统生物脱氮工艺中硝化产酸、反硝化
产碱均需投加试剂中和的弊端。这对突破生物脱氮
的困境、研究生物脱氮新工艺具有重要意义。
本研究从河南省平顶山市白龟山水库大坝下游
水体样品中筛选得到一株好氧反硝化细菌 N22，通
过形态、生理生化及分子特性研究对其进行了初步
鉴定。菌株 N22与多株 Acinetobacter sp. 的同源性为
99%，推测为不动杆菌 Acinetobacter sp.。
温度对反硝化速率的影响很大，反硝化细菌的
最适宜温度在 30℃左右，低于 5℃或高于 40℃，反
硝化的作用几乎停止［11］。本研究结果表明，水温在
25-35℃时，该菌可以正常生长，并保持较高的反硝
化活性，而水温 30℃是该菌生长及反硝化活性发挥
的最适温度。20℃时，细菌生长与反硝化性能发挥
表现出了较明显的抑制作用。这一特性与安健等［12］
研究结果相符。菌株 N22更适于高水温条件下的硝
酸盐氮去除，这可能与该菌生长及反硝化酶的耐热
机制有关，需要进一步研究。
Gupta［13］和 Timmermans 等［14］研究表明，细
菌生长及反硝化酶活性的最适 pH 值是中性或微碱
性，pH 值过高或过低均会对菌株生长及反硝化性能
的发挥产生影响。李卫芬等［15］对好氧反硝化菌株
Pseudomonas stutzeri的研究也同样表明，pH 为中性
条件最有利于菌株生长及反硝化性能的发挥。本研
表 1 菌株 N22的生理生化特性
鉴定指标 鉴定结果 鉴定指标 鉴定结果
革兰氏染色 G- MR 试验 +
鞭毛染色 - 淀粉水解 +
穿刺运动性 - 明胶液化 +
葡萄糖发酵 + 硫化氢试验 -
吲哚试验 + 接触酶试验 +
VP 试验 + 氧化酶试验 -
“＋”为阳性 ；“－”为阴性
分支节点的数值表示自引导值（Bootstrap），重复 1 000 次
图 5 菌株 N22与相关菌株的系统发育树
3 讨论
目前国内对反硝化细菌的研究多集中于利用生
物技术对污水进行处理，减轻环境污染程度。在好
氧反硝化菌的作用下，硝酸盐氮可在有氧情况下被
还原为氮气，硝化反硝化作用在同一反应体系中同
时进行。能够降低运行成本和缩短脱氮周期，而且
反硝化释放出的 OH-可补偿硝化反应所消耗的碱，
表 2 用于系统发育树构建的相关参比菌株的信息
细菌名称 菌株编号 序列登录号
Acinetobacter junii S33 AB101444.1
A.grimontii NIPH 2283 AM410706.2
A.baumannii MMG 5e N162445.1
A.beijerinckii mj01-PW12-OH8 HQ425649.2
A.tjernbergiae DSM 14971 FR822986.1
A.baylyi NBRAJG74 EU734817.1
A.radioresistens S13 GU145275.1
A.johnsonii 3B2 EU337121.1
A.haemolyticus NK 2.BH-7 EU352764.1
A.parvus LUH4616 NR_025425.1
A.rhizosphaerae 21 MSMN FN600413.1
A.calcoaceticus ATCC 23055 AJ888984.1
A.qyllenbergii RUH 422 = NIPH 2150 = ACI 651 NR_042026.1
A.venetianus ZX-PKU-001 DQ912805.1
Bacterium sp. L200B.180 EU935227.1
Acinetobacter sp. N22 JQ687406
2012年第10期 209郭端强等 ：一株好氧反硝化细菌的分离鉴定及反硝化特性研究
究表明菌株 N22在 pH5.0-8.0 的条件下都有较高的
硝酸盐氮去除率，可在较宽的 pH 范围内保持正常
生长及反硝化性能的稳定发挥。
对菌株 N22反硝化特性研究表明，反硝化作用
主要发生在对数生长期，随着菌体的快速增殖，水
体中硝酸盐氮和亚硝酸盐氮的量会迅速下降。试验
结果与刘晶晶等［16］和马放等［17］研究结果相符。在
整个反硝化的过程中并未出现大量的亚硝酸盐氮的
积累，推测菌株 N22将部分氮用于构建细胞的同时
将大部分的氮直接转化为 N2 等气态形式的氮除去，
其好氧反硝化作用的机理及菌株的工程应用有待进
一步研究。
4 结论
本研究从河南省平顶山市白龟山水库大坝下游
水体样品中筛选得到一株好氧反硝化细菌 N22，经
形态、生理生化试验以及 16S rRNA 基因序列分析，
菌株 N22判定为不动杆菌 Acinetobacter sp.。pH 对
N22的反硝化能力影响很大，反硝化最适 pH7.0 ；
N22在 25-35℃温度范围内均可发挥良好的反硝化
效果。菌株 N22能在好氧条件下以 NO3--N 作为电
子受体进行反硝化，在适宜条件下，培养 40 h 后其
对 NO3--N 的去除率达 86.39%。菌株 N22的生长停
滞期为 24 h，但是其对数期较长，达 16 h，该菌发
挥较强反硝化作用的时间比较长，这对该菌株应用
于环境工程领域有着积极的意义。
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（责任编辑 马鑫）