全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 6期
脂肪酸组分分析在不动杆菌鉴定中的应用
张晓霞 1 　王直强 2 　李世贵 1 　顾金刚 1 　姜瑞波 1
(1 中国农业科学院农业资源与农业区划研究所 ,北京 100081; 2 云南省昭通市第一人民医院 , 昭通 657000)
　　摘 　要 : 　以不动杆菌属 (A cinetobacter)中的 A1 baum annii、A1 haem oly ticus、A1 johnson ii、A1 junii、A1 lw off ii模式菌株为参比
菌株 ,对中国农业微生物菌种保藏管理中心 (ACCC)所保藏的 6株不动杆菌进行脂肪酸组分分析及 16S rRNA基因系统进化
分析。结果表明 ,利用脂肪酸分析可将 6株菌完全准确地鉴定到属的水平上 ,这一点与 16S rRNA基因分析结果一致 ;在种的
水平上 , 16S rRNA基因进化分析与脂肪酸组分分析的结果可互为补充 ,相互印证。同时 ,通过对不动杆菌部分模式菌株及供
试菌株的脂肪酸组分分析 ,报道了不动杆菌的特征性脂肪酸为 C18: 1 w9c、C16: 00和 C16: 1w7c /C16: 1w6c。
关键词 : 　不动杆菌 　脂肪酸组分分析 　16S rDNA系统进化分析
Identif ication of Acinetobacter spp1 Using Fatty
Ac id Compositions Analysis
Zhang Xiaoxia1 　W ang Zhiqiang2 　L i Shigui1 　Gu J ingang1 　J iang Ruibo1
(1 Agricultural Cultural Collection of China, Institute of Agricultural Resources and Regional P lanning, Chinese Academ y of
Agricultural Sciences, B eijing 100081; 2 Zhaotiong F irst People’s Hospita l, Zhaotong 657600)
　　Abs trac t: 　 In order to exp lore the app lication of fatty acid composition in taxonomy of A cinetobacter spp1, the fatty acid constitu2
tions of six strains from Agricultural Cultural Collection of China (ACCC) and the type strains of the species of A1 baum annii, A1 hae2
m oly ticus, A1 johnson ii, A1 lw off ii were detected byM icrobial Identification System (M ID I) 1The clusters of fatty acid constitutions and
16S rRNA gene sequences were analyzed by M ID I system and Mega410, respectively1 The results showed that this method could be
used to identify the A cinetobacter spp1 to genus level, some of strains to the species level but not all1 This paper firstly reported the
characteristic fatty acid compositions of the genus Acinetobacter were C18: 1 w9c , C16: 00 and C16: 1w7c /C16: 1w6c 1
Key wo rds: 　A cinetobacter　Fatty acid compositions analysis　16S rRNA phylogenetics
收稿日期 : 2009201204
基金项目 :公益性行业 (农业 )科研专项经费 (200803029201, 2008030332A002G) ,国家科技资源平台项目 (2005DKA21200)
作者简介 :张晓霞 (19742) ,女 ,助理研究员 ,博士 ,主要从事细菌资源的收集、保藏、分类及应用研究　　不动杆菌属 (A cinetobacter)在自然界中广泛分布 ,除大量存在于水和土壤中外 ,亦常存在于人的皮肤、呼吸道、消化道和泌尿生殖道中。目前该属已发现 17个种 ,分别为 A1 baum annii、A1 bay ly i、A1 bou2vetii、A1 ca lcoaceticus、A1 gerneri、A1 grim ontii、A1 hae2m oly ticus、A1 johnson ii、A1 jun ii、A1 lw off ii、A1 parvus、A1 rad ioresistens、A1 sch ind leri、A1 tandoii、A1 tjernber2g iae、A1 tow neri、A1 ursing ii[ 1 ]。不动杆菌是一类条件致病菌 ,其中主要的致病菌为鲍曼不动杆菌 (A1baum annii) ,而一些原本认为非致病或致病性弱的种类 ,如琼氏不动杆菌 (A1 jun ii)、约翰逊不动杆菌 (A1 johnson ii)等多重耐药菌所引起的感染也屡有报道 [ 2 ]。此外 ,不动杆菌在环境修复和生物技术中的应用也倍受关注。该属的某些菌株可对多种污染物进行生物降解 ,如联苯和氯化联苯氨基酸、苯酚、苯甲酸、原油、乙腈等 ;有些不动杆菌还可产生具有经济价值的胞内或胞外产物 ,如生物乳化剂、多糖、聚脂、蛋白酶和脂肪酶等重要的生物制品 [ 3 ]。因此 ,准确的种属鉴定不仅对于该类细菌的流行病学、微生态学规律的研究十分重要 ,而且对其在实践中的安全使用也具有重要的指导意义 [ 4, 5 ]。鉴于不动杆菌分类的复杂性 ,使得寻找和建立这类细菌准确的分类方法颇受关注 ;由于细菌不同
生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 6期
属、种甚至不同株之间脂肪酸碳链长度、双键位置、
取代基团等都存在差异 ,因此脂肪酸分析技术在细
菌的分类中具有重要作用 [ 6, 7 ]。目前随着脂肪酸分
析技术的日益成熟 ,基于脂肪酸分析技术的气相色
谱 Sherloch微生物鉴定系统 ,使脂肪酸分析更加快
速、准确 ,在细菌分类中被广泛应用。脂肪酸分析可
区分属、种并进行聚类 ,其结果与 16S rRNA基因序
列分析有较好的一致性 [ 8, 9 ]。本研究对中国农业微
生物保藏管理中心所保藏的 6株不动杆菌和相关的
模式菌株进行了脂肪酸组成分析 ,并与 16S rDNA
系统进化分析进行了比较。
1　材料与方法
111　菌种来源
所有供试菌株来自于中国农业微生物菌种保藏
管理中心 (ACCC) ,参比菌株来自于中国普通微生
物菌种保藏管理中心 (CGMCC)、德国微生物及细胞
系保藏中心 (DSMZ)及美国典型培养物保藏中心
(ATCC) ,详见表 1。
表 1　菌种来源
菌株编号 菌株中文名称 学名 来源 分离源
ACCC01130 鲍曼不动杆菌 A1baum annii ACCC←中国农科院资源区划所 淤泥
ACCC01635 乙酸钙不动杆菌 A1calcoaceticus ACCC←中国农科院生物技术所 炼油炼焦废水
ACCC01501 乙酸钙不动杆菌 A1calcoaceticus ACCC←新疆农科院微生物所 土壤样品
ACCC01656 抗辐射不动杆菌 A1radioresistens ACCC←广东省微生物研究所 肥料
ACCC02205 约氏不动杆菌 A1 johnsonii ACCC←中国农科院资源区划所 石油
ACCC01091 鲁氏不动杆菌 A1 lw offii ACCC←中国农科院资源区划所 鱼饲料
ATCC19606 鲍曼不动杆菌 A1baum annii ATCC←Hugh←E1O1King← I1G1 Schaub,模式菌株 尿液
CGMCC112005 鲁氏不动杆菌 A1 lw offii CGMCC←PCM,模式菌株 /
ATCC17908 琼氏不动杆菌 A1 jun ii ATCC←NCTC←W1Stenzel,模式菌株 尿液
DSM 6962 溶血不动杆菌 A1heam olytius DSMZ←ATCC←NCTC←W1 Stenzel,模式菌株 人唾液
112　方法
11211　菌株活化 　所有供试菌株及参比菌株均使
用 LB培养基进行活化 ,培养温度 28℃。
11212　16S rRNA基因序列测定及系统发育分析 　
用热裂解法提取基因组 DNA[ 10 ] , 通用引物 27f和
1492r扩增细菌 16S rDNA部分片段 , 1492r: 5′2GGT2
TACCTTGTTACGACTT23′, 27f: 5′2AGAGTTTGATCCT2
GGCTCAG23′[ 11 ]。 PCR 扩增条件 : 94℃变性 45 s,
55℃退火 60 s, 72℃延伸 60 s, 30个循环 , 72℃延伸 8
m in。扩增片段约 1 450 bp,采用 AB I3730型自动测
序仪完成序列测定。16S rRNA序列经校对后与 Gen2
Bank数据做相似性分析 ,通过 ClustalX 1183程序多
重比对 ,系统进化矩阵根据 Kimura模型估计 ,用
Mega410软件采用邻接法 (Neighbour2joining)进行聚
类分析 ,并构建进化树。同时采用 1 000次自展值
(Bootstrap value)分析来评估系统进化树拓扑结构的
稳定性 [ 12 ]。
11213　菌种的培养、菌体收集及脂肪酸提取 　所有 供试及参比菌株均在 TSA (D IFCO )培养基上培养 ,培养时间为 24 h,温度为 28℃。菌体的收集及脂肪酸的提取参照文献 [ 13, 14 ]描述的方法进行。11214　样品分析 　使用 HP 6890N气相色谱仪 ,配备分流 /不分流进样口 ,氢火焰离子化检测器 ( F ID )及 HP气相色谱化学工作站 ;色谱柱为 U ltra22柱 ,长25 m,内径 012 mm ,液膜厚度 0133μm;炉温为二阶程序升温 : 起始温度 170℃, 以 5℃ / m in 升至260℃,随后以 40℃ / m in升至 310℃,维持 115 m in;进样口温度 250℃, 载气为氢气 ,流速 015 m l/m in,分流进样模式 ,分流比 100∶1,进样量 2μl;检测器温度 300℃,氢气流速 30 m l/m in,空气流速 216 m l/m in,补充气 (氮气 )流速 30 m l/m in。由于细胞脂肪组成受培养条件、仪器运行状况等影响较大 ,本试验采用了相应的模式菌作为参比 ,以确保数据的可靠性及可比性。11215　数据分析 　细胞脂肪酸组分分析采用 m i2crobial identification system (M ID I)鉴定系统。
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2009年第 6期 张晓霞等 :脂肪酸组分分析在不动杆菌鉴定中的应用
2　结果分析
211　16S rRNA基因系统发育分析
对于所测的 16S rRNA基因序列 ,截去结果中两
端不稳定的序列 ,每株菌获得序列长度约 1 380 bp基
因片段。将所获得的序列分别与 GenBank中的已知
序列进行对比 ,并获得与之相似性较高的序列 ,采用
ClustalX 1183软件进行多序列匹配排列 ,并通过
Mega410软件构建系统进化树 (图 1)。该图是根据
Neighbor 2Joining法和 Kimura双参数矫正模型建立
起来的 ,通过 1 000次取样计算其 Bootstrap值。
从图 1可以看出 ,约氏不动杆菌 (A1 johnsonii)
ACCC02205和溶血不动杆菌 (A1heam oly tius) AC2
CC02175及其两个种的模式菌株位于同一进化分支 ;
鲁氏不动杆菌 (A1 lw off ii) ACCC01091、乙酸钙不动杆
菌 (A1calcoaceticus) ACCC01501和 ACCC01635、放射
不动杆菌 (A1radioresistens) ACCC01656均与其相应的
模式菌株单独形成一个分支 ,并与其他几个不动杆菌
的种明显分开 ;鲍曼不动杆菌 (A1baum annii) AC2
CC01130与琼氏不动杆菌 (A1 jun ii)和鲍曼不动杆菌
(A1baum annii)的模式菌株聚为同一分支。从上述分
析可以看出 ,利用 16S rRNA基因序列的系统发育分
析不能将约氏不动杆菌和溶血不动杆菌、鲍曼不动杆
菌与琼氏不动杆菌明显地区分开来。
212　脂肪酸组成分析
对不动杆菌属 7个不同种中的 10株菌进行了
脂肪酸组成的测定。不同菌株间的脂肪酸组成及比
较见表 2。从表 2可以看出 ,除约氏不动杆菌 AC2
CC01901和其模式菌株 GCMCC 112005的主要脂肪
酸成分为 C16: 1w7c /C16: 1w6c外 ,其他不动杆菌的主要脂
肪酸成分均为 C18: 1 w9c , 其次是 C16: 00 和 C16: 1w7c /
C16: 1w6c。因此可以初步确定不动杆菌属的特征性脂
肪酸应为 C18: 1 w9c、C16: 00和 C16: 1w7c /C16: 1w6c。
图 1　根据 16S rRNA基因构建的系统进化树
表 2　标准培养条件下供试菌株及模式菌株的脂肪酸含量 ( > 2%)
11: 00 12: 00 12: 0 2OH 12: 0 3OH 14: 00 16: 00 17: 00 18: 00 17: 0 iso 17: 1 w8c 18: 1 w9c S2a S3b S8c
01635 / 416 212 315 / 2115 219 / / 410 3819 211 1515 /
01501 / 316 210 317 / 1414 315 / / 717 3614 119 2117 /
01901 / 511 / 313 310 2111 / 817 / / 1711 / 3016 716
02205 / 715 / 615 / 1517 / 215 212 / 3215 / 2315 419
01656 / 315 / 316 / 2113 / 411 / / 4213 / 1511 216
01130 316 515 711 / 1915 215 4116 / 1418 212
CGMCC112005 / 618 / 413 2102 2014 / 617 / / 1719 / 3510 516
ATCC 17908 2119 / 314 315 / 1411 314 317 / 212 3810 / 251 /
ATCC19606 / 416 212 314 / 2011 117 118 / 314 4219 310 1219 /
DSM 6962 / 510 416 718 / 1417 211 / / 317 4112 / 1716 /
a1Sum In Feature 21C14: 0 3OH /C16: 1 iso I; b1Sum In Feature 31C16: 1 w7c /C16: 1 w6c ; c: Sum In Feature 8: C18: 1 w7c
　　利用 M ID I系统提供的软件系统 ,选取数据库 中不动杆菌属的相关数据 ,对供试菌株及参比的模
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式菌株进行聚类分析 (图 2)。结果发现 ,所有的模
式菌株完全与数据库中相应的种类归为一类 ,说明
本试验所所获得的数据准确可靠。从构建的聚类图
上可以看出 ,利用脂肪酸分析方法 ,将供试菌株鲁氏
不动杆菌 ACCC01091、约氏不动杆菌 ACCC02205
和溶血不动杆菌 ACCC 02175与相关的种类聚为一
类。其他的供试菌株 ,包括乙酸钙不动杆菌、放射不
动杆菌及鲍曼不动杆菌则不能利用脂肪酸聚类法与
相应的模式种类聚为一类。
图 2　脂肪酸组成聚类图
3　讨论
细胞脂肪酸分析 (m icrobial identification system
,M ID I)鉴定系统的应用使微生物脂肪酸分析标准
化、自动化 ,操作简单 ,检测结果迅速而准确 ,且费用
低廉 ,因此近些年被广泛地应用于细菌的分类鉴定
中 [ 9 ]。另外 ,由于 16S rRNA基因高度保守 ,亲缘关
系在种以上水平的菌株具有很好的分辨率 ,但对亲
缘关系比较近的种分辨率不高。一般来讲 ,菌株之
间 16S rRNA基因序列相似性 > 97% ,可能属于同一
种 ;但 16S rRNA基因序列相似性在 99%以上 ,仍可
能属于不同的种 [ 15 ] ,需要 DNA2DNA杂交等试验来
进一步确定。本研究发现 ,在不动杆菌的分类中 ,由
于 16S rRAN 基因同源性十分接近 , 利用 16S
rRNA基因序列的系统发育分析不能将约氏不动杆
菌与溶血不动杆菌、鲍曼不动杆菌与琼氏不动杆菌
明显的区分开。利用脂肪酸组成分析 ,可将 6株供
试菌株完全准确地鉴定到属的水平上 ,这一点与
16S rDNA的分类结果一致 ;在不动杆菌“种 ”的分
类地位上 , 16S rDNA进化分析与脂肪酸分析两方面
的结果可互为补充 ,相互印证。说明脂肪酸组成分
析可快速而准确地对不动杆菌类群的菌株进行初步
的鉴定。同时 ,通过对不动杆菌部分模式菌株及试
验菌株的分析 ,首次报道了不动杆菌的特征性脂肪
酸为 C18: 1 w9c、C16: 00和 C16: 1w7c /C16: 1w6c。
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