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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2016, 32(1):187-194
纳豆激酶（Nattokinase，NK）是由枯草芽孢杆
菌（Bacillus subtilis）代谢产生的一种丝氨酸蛋白酶，
是目前国内外研究和开发溶栓药物的热点［1］。产
生纳豆激酶的菌种大多来源于日本纳豆或中国豆豉
等传统的发酵食品经筛选获得，这些筛选方法是建
立在纤溶活性基础上的，如纤维平板法和纤维降解
法［2］，然而有很多类似的酶具有相同的纤溶活性，
如 subtilisin DJ-4、subtilisin DFE 和纤溶酶 BSF1［3-5］，
对纳豆激酶产生菌的筛选带来了干扰。纳豆激酶的
基因 aprN，在这些纤溶活性的酶中具有专一性［6］，
收稿日期 ： 2015-05-06
基金项目 ：河南省重点实验室建设专项项目（122300413214），河南省重点科技攻关项目（142102210087），郑州市攻关计划项目
（141PPTGG415）资助项目。
作者简介 ：王雪妍，女，研究方向 ：微生物发酵工程 ；E-mail ：1060877396@qq.com
通讯作者 ：李锋，男，博士，研究方向 ：微生物技术与应用 ；E-mail ：lifengac@126.com
一株高产纳豆激酶菌株的鉴定与分析
王雪妍  孙玉飞  冯菲  陈晓飞  李锋  周伏忠
（河南省科学院生物研究所有限责任公司 河南省微生物工程重点实验室，郑州 450008）
摘 要 ： 鉴定高产纳豆激酶菌株 Td，分析纳豆激酶的分子特征。利用菌体形态、生理生化特征、以及分子生物学方法对菌
株 Td 进行鉴定 ；并采用 MALDI-TOF 质谱测定与分析、SDS-PAGE 和纤溶活性测定等方法检测纳豆激酶特性，利用 PCR 方法扩增
纳豆激酶的基因全长。结合菌体形态、生理生化特征和 16S rDNA、gyrA 基因序列、DNA-DNA 杂交率等实验结果，鉴定菌株 Td 为
枯草芽孢杆菌枯草亚种（Bacillus subtilis subsp. subtilis）；菌株 Td 发酵产生的纳豆激酶产量可达 300 mg/L 以上，占发酵液总蛋白的
40% 以上 ；纤溶活性达 230 U/mL 以上 ；氨基酸序列与 subtilisin E 的序列相似性最高 ；基因全长序列为 1 143 bp。枯草芽孢杆菌枯
草亚种 Td 是一株高产、高活性纳豆激酶的产生菌，具有优良的工业化开发价值。
关键词 ： 枯草芽孢杆菌枯草亚种 ；纳豆激酶 ；菌株鉴定
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.01.030
Identification and Analysis of a Nattokinase-producing Strain
WANG Xue-yan SUN Yu-fei FENG Fei CHEN Xiao-fei LI Feng ZHOU Fu-zhong
（Institute of Biology Co.，Ltd.，Henan Academy of Sciences，Key Laboratory of Microbial Engineering of Henan Province，Zhengzhou
450008）
Abstract: The objective of this work is to identify an isolate Td of yielding high nattokinase, and to analyze the molecular characteristics
of its nattokinase. The morphologic, biochemical and physiological characterizations, and molecular biological methods were used to identify
the taxonomic position of isolate Td ；mass spectrometric determination and analysis of MALDI-TOF, SDS-PAGE and fibrinolytic activity
were employed to measure the characteristics of nattokinase, and PCR method was adopted to clone the full length of nattokinase gene. The
bacterial strain Td was identified as Bacillus subtilis subsp. subtilis according to the results of morphologic, biochemical and physiological
characterizations, as well as 16S rDNA, the sequences of 16S rDNA gyrA, hybrid rate of DNA-DNA. The yield of nattokinase produced by strain
Td reached 300 mg/L, accounted for over 40% of the total protein. Fibrinolytic activity was over 230 U/mL. Amino acid sequence of nattokinase
produced by Td showed the highest similarity to the subtilisin E. and the full length of the gene was 1143 bp. Conclusively, as a high-yield and
high-activity strain for nattokinase, B. subtilis subsp. subtilis Td is a promising candidate for industrial development and utilization.
Key words: Bacillus subtilis subsp. subtilis ；nattokinase ；strain identification
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.1188
因此，采用 PCR 方法检测纳豆激酶基因和测定纤溶
活性两者相结合的方法为一种高效筛选获得纳豆激
酶产生菌的途径，几乎未检索到这方面的报道。
目前纳豆激酶发酵活性或产量不高，阻碍了产
业化开发进程。近年来通过基因工程手段，研究人
员获得了一些纳豆激酶的基因工程菌种，但酶活力
或产量也并不理想。在基因水平上，纳豆激酶产生
菌（纳豆菌）的基因组信息获得了解析并已经公开
发表［7］，因此，从分子水平上对纳豆激酶进行研究
奠定了基础。各国学者对纳豆激酶发酵工艺［8-10］、
分离纯化技术［11］、高产菌株诱变与选育［12］以及纳
豆激酶代谢动力学和作用机理等［13，14］诸多方面进
行了大量研究，获得许多较为重要的进展。同时继
续寻找不同来源的纳豆激酶高产菌，以得到具有工
业化潜在应用价值的新菌株，也越来越受到人们的
关注。本课题组经多年的研究，从发酵豆制品中选
育出 1 株纳豆激酶高产菌株，前期对纳豆激酶酶学
性质、发酵培养、分离纯化及体外溶栓特性等方面
进行过研究［15-17］，现在正进行纳豆激酶保健产品的
开发和应用研究。然而，前期的工作未对纳豆激酶
和菌株名称进行确切的鉴定，一直是以测定纤溶活
性这种传统方法为基础进行研究的。本研究拟利用
检测纳豆激酶分子（蛋白和基因）与测定纤溶活性
相结合的方法对纳豆激酶进行鉴定，同时结合分子
生物学方法将该高产菌株的名称定名到亚种的水平，
旨在为产纳豆激酶菌株的鉴定提供借鉴和参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试样品 分离菌株的样品分别来源于中国
传统食品自然发酵的豆豉 ；枯草芽孢杆菌枯草亚种
（B. subtilis subsp. subtilis）168 菌株来自于中国普通
微生物菌种保藏管理中心。
1.1.2 主要试剂 凝血酶、人纤维蛋白原均购自中
国药品生物制品检定所 ；酵母粉、胰蛋白胨为 Oxoid
公司产品 ；其他试剂均为国产分析纯试剂。
1.1.3 培养基 LB 培养基 ：酵母粉 5 g/L，胰蛋白
胨 10 g/L，NaCl 10 g/L，pH7.2（固体加 1.5% 琼脂粉）；
发酵培养基 ：葡萄糖 5 g/L，蛋白胨 10 g/L，酵母粉
5 g/L，NaCI 5 g/L，pH 值 7.2-7.4。
1.2 方法
1.2.1 菌种的分离纯化 用无菌牙签挑取少量豆豉
表面的黏性物质，接种到 10 mL 无菌水的试管中充
分搅拌，制成悬浊液。取少量悬浊液，涂布在 LB
培养基平板上，待风干后倒置于 37℃恒温培养箱中
培养 12-24 h，挑取平板上长出的有皱褶的白色菌落，
镜检观察。继续划线纯化 1 次，挑取单菌落，保存
于 LB 培养基斜面上。
1.2.2 纤溶活性测定 采用纤维蛋白平板法测定纳
豆激酶活性［18］。将分离获得的不同菌株接种到液
体发酵培养基中于 37℃下振荡培养过夜，发酵液
8 000 r/min 离心 5 min 得到上清粗酶液。取粗酶液
10 μL 点于纤维蛋白平板上，倒置于 37℃恒温培养
箱中培养 18 h 后测量透明圈直径，计算纳豆激酶的
纤溶活性，筛选获得活性最高的菌株，编号为 Td。
1.3 菌株鉴定
1.3.1 菌株形态及生理生化特性测定 观察高产菌
株 Td 的菌落和菌体形态，参照《常见细菌鉴定手册》
并与枯草芽孢杆菌枯草亚种 168 对比进行生理生化
鉴定试验［19］。
1.3.2 分子鉴定及系统发育树构建 参照《分子
克隆实验指南》描述的方法提取菌株 Td 的基因组
DNA［20］。分别应用 16S 引物（27F ：5-AGAGTTTG-
ATCCTGGCTCAG-3 ；1492R ：5-GGTTACCTTGTTA-
CGACTT-3）和解旋酶 gyrA 引物（gyrA-42F ：5-CA-
GTCAGGAA ATGCGTACGTCCTT-3 ；gyrA-1066R ：
5-CAAGGTAATGCTCCAGGCATTGCT-3） 进 行 PCR
扩增［21］，目的产物纯化后由北京华大基因有限公
司 进 行 测 序。 将 获 得 的 16S rDNA 和 gyrA 序 列 在
GenBank 数据库中进行 BLAST 比对，确定与其亲
缘关系最近的属种，并从数据库下载获得相关种属
的 gyrA 基因序列，构建系统发育树。序列比对用
ClustalX 2.1 进行，系统进化树的构建采用 MEGA 5.0
软件进行，应用 Neighbour-Joining 方法进行 bootstrap
分析，重复次数为 1 000。
1.3.3 基 因 组 DNA-DNA 杂 交 分 析 根 据 上 述 方
法 提 取 菌 株 Td 和 菌 株 168 的 基 因 组 DNA， 用 仪
器 DU800 进行 DNA-DNA 杂交分析。通过超声断裂
法（400 W，2 s，6 次）剪切基因组 DNA，使 DNA
2016,32(1) 189王雪妍等：一株高产纳豆激酶菌株的鉴定与分析
片 段 在 1 000-2 000 bp 之 间。 将 剪 切 过 的 DNA 用
0.1×SSC 精确配置成 OD260 为 1.5-2.0。取 Td、168
（分别标记为 a，b）各 300 μL 及两者各 150 μL 的混
合物（标记为 m），分别加到 1.5 mL 离心管中，于
沸水浴中变性 10 min，并用预热的枪头吸取 75 μL
预热的 10×SSC 溶液加入变性样品中，吹打混匀，
使终浓度为 2×SSC，固定温度为最适复性温度（Tor），
以 2×SSC 为空白对照，复性 45 min，在 260 nm 波
长下，每隔 25 s 测一次吸光值，作出复性曲线，计
算复性速率 Va、Vb、Vm，并用下式计算 DNA-DNA
杂交度 D%=［4Vm-（Va+Vb）］/2（VaVb）1/2。
1.4 纳豆激酶的鉴定
1.4.1 SDS-PAGE 凝胶电泳检测纳豆激酶产量 配
制浓度为 5% 浓缩胶、12% 分离胶的聚丙烯酰胺凝
胶用于纳豆激酶产量的 SDS-PAGE 分析，每个点样
孔加入 1.2.2 中描述的发酵液 16 μL 进行电泳。电泳
完毕后对凝胶用考马斯亮蓝 R-250 染色蛋白质条带，
使用 quantity one 软件对蛋白进行定量分析。
1.4.2 MALDI-TOF 质谱分析鉴定纳豆激酶 将菌株
Td 培养得到的发酵液进行 SDS-PAGE 电泳分离，切
胶回收目的大小的条带，用胰蛋白酶（Trypsin）进
行胶内酶切处理来进行 MALDI-TOF 质谱分析。获得
的肽质量指纹图谱应用 MASCOT 2.0 软件进行 NCBI
蛋白质数据库的检索分析。
1.4.3 纳豆激酶基因的克隆 根据 1.4.2 的结果，并
参照 GenBank 公布的纳豆激酶基因来设计一对引物，
序列分别为 F ：5-TCAGCATAATGAACATTTACTCA
-3 和 R ：5-GGTTGATCCTCCGGTGCTTGTGA-3。参
照 1.3.2 中方法提取菌株 Td 基因组 DNA 为模板进行
PCR 扩增纳豆激酶基因。PCR 反应体系（50 μL）：
10×rTaq Reaction Buffer 5 μL，rTaq DNA聚合酶2.5 U，
上下游引物（10 mmol/L）各 2 μL，10 mmol/L dNTPs
3 μL，补足 ddH2O 至 50 μL。反应条件 ：94℃预变
性 5 min 后 进 入 循 环，94℃ 50 s，56℃ 40 s，72℃
2 min，循环 30 次，最后 72℃延伸 10 min。PCR 产
物经纯化后连接到质粒 pMD18-T 载体上，连接产
物转化大肠杆菌 DH5α 感受态细胞，碱裂解法提取
大肠杆菌转化子质粒。经酶切鉴定后，将验证为阳
性的重组质粒送至北京华大基因有限公司进行序列
测定。
2 结果
2.1 纳豆激酶高产菌株的筛选
从供试样品中共分离得到 18 株菌株，将筛选得
到的菌株经过再次纯化、发酵培养，用纤维蛋白法
测其纳豆激酶的活性大小。根据在纤维蛋白原平板
上产生透明圈的大小（图 1），最终确定 1 号菌株为
高产菌株，编号为 Td。
1
2
3
9
4
5
6
7
8
1 ：菌株 Td ；2-9 ：分离获得的其它编号菌株的纤溶活性大小
图 1 不同菌株发酵液的纤溶活性
2.2 菌种鉴定
2.2.1 菌株形态与生理生化反应 在 LB 培养基平
板上于 37℃恒温培养 24 h 后，菌株 Td 的菌落呈圆
形，表面粗糙有皱褶、微突起、边缘不整齐、无光
泽、呈乳白或灰白色，菌落直径 3-4 mm。显微镜下
观察菌体呈杆状，单个或链状排列，大小（2.0-3.0）
μm×（0.6-0.8）μm，有鞭毛，能运动，芽孢呈椭圆
或柱状。
以标准菌株 168 作为对照菌株，与菌株 Td 共同
进行生理生化特性的试验。结果（表 1）表明，菌
株 Td 与菌株 168 生理生化特性相同，因此可以确定
菌株 Td 符合芽孢杆菌属（Bacillus）的特征。
2.2.2 分子鉴定与系统发育树 根据 16S rDNA 序
列的测定结果，与 GenBank 中已经登录的序列进行
BLAST 检索比对，结果显示菌株 Td 的 16S rDNA 与
芽孢杆菌属（Bacillus）不同种具有高度相似，同源
性高达 99% 以上 ；而基因 gyrA 进行 BLAST 检索比
对结果表明，与枯草芽孢杆菌枯草亚种（B. subtilis
subsp. subtilis） 的 相 似 性 最 高， 达 100%。 根 据
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.1190
BLAST 检索结果，筛选芽孢杆菌属相关物种的 gyrA
基因序列与供试菌株 Td 的序列进行系统发育树的构
建。结果（图 2）表明，菌株 Td 与枯草芽孢杆菌枯
草亚种聚为一个分支上，而与其他物种相距较远。
表 1 菌株 Td 与菌株 168 的生理生化特性
实验项目
实验结果
实验项目
实验结果
菌株 Td 菌株 168 菌株 Td 菌株 168
革兰氏染色 阳性 阳性 碳水化合物产酸
细胞形状 杆状 杆状 葡萄糖 + +
运动性 + + 木糖 - -
形成芽孢 + + L- 阿拉伯糖 - -
接触酶 + + D- 甘露醇 - -
氧化酶 + + 乳糖 + +
厌氧生长 - - 利用柠檬酸盐 + +
伏 - 普试验 V-P + + pH5.7 生长 + +
7%NaCl 生长 + + 最高生长温度 50℃ 50℃
分解酪素 + + 淀粉水解 + +
硝酸盐还原 + + 甲基红 + +
B. subtilis subsp. subtilis NRS-744EU138658
B. subtilis subsp. subtilis 168255767013
B. subtilis subsp. subtilis BEST195674708758
Td
B. subtilis subsp. spizizenii B-23049DQ995271
B. subtilis subsp. inaquosus B-23052EU138205
B. tequilensis B-41771EU138625
B. atrophaeus NRS-213EU138654
B. amyloliquefaciens BD-601EU138645
B. licheniformis DSM 13AE017333
B. sonorensis B-23154EU138611
B. cereus ATCC 109874277908110010047 100 6882 10010097
0.02
图 2 芽孢杆菌属部分菌种的 gyrA 基因系统发育树（括号内数字表示 GenBank 的登录号）
2.2.3 DNA-DNA 杂交分析 经 DU-800 测定与分析，
根据表 2 的结果，计算菌株 Td 与标准菌株 168 的复
性速率为 Va=0.002 7 和 Vb=0.002 3，混合样品的复
性速率 Vm=0.002 4，代入杂交率计算公式得出菌株
Td 与标准菌株 168 的 DNA 杂交率 D%=92.3%，显著
高于 80% 的阈值，因此可以确定两者为同一个亚种。
综合形态特征和分子鉴定的结果，鉴定菌株 Td
为枯草芽孢杆菌枯草亚种。
2.3 纳豆激酶的活性与鉴定
2.3.1 纳豆激酶的溶解纤维蛋白活性 纳豆激酶活
性越高，在纤维蛋白平板上的透明圈直径则越大。
根据活性测定结果（图 1），Td 产生的透明圈明显比
其它菌株的大，因此菌株 Td 产生的纳豆激酶活性最
高，纤溶活性达 237 U/mL。
2.3.2 SDS-PAGE 电 泳 分 析 菌 株 Td 发 酵 液 进 行
SDS-PAGE 凝胶电泳的结果（图 3-A）显示，泳道
中的蛋白质杂质谱带较少，其中有 1 条明显较亮的
蛋白质谱带。与标准分子量蛋白比较和计算，得出
此条带的蛋白分子量大小约为 27 kD ；应用 quantity
one 软件计算蛋白产量可达 300 mg/L，占总蛋白的
40% 以上。
2016,32(1) 191王雪妍等：一株高产纳豆激酶菌株的鉴定与分析
个氨基酸，其中氨基酸序列的前 27 个氨基酸为信号
肽序列，随后的 77 个氨基酸为前导肽序列，最后的
275 个氨基酸为成熟肽。基因的 3 末端是 3 个连续
的终止密码子 TAA、TAG 和 TAA，转录终止序列位
于成熟蛋白区域 C 端下游 7 bp 处，该段终止序列可
形成茎环结构，即 ρ 因子非依赖性终止序列。
3 讨论
纳豆激酶（nattokinase）是枯草芽孢杆菌产生
的一种胞外丝氨酸蛋白激酶，在血栓、血脂、血压、
抗癌、糖尿病等方面均有预防和治疗的功能，已为
国际社会所接受，但是对其产生菌的定名却存在争
议。目前已经发表的文章采用的纳豆枯草芽孢杆菌
（Bacillus subtilis subsp. natto）或枯草芽孢杆菌纳豆亚
种（Bacillus subtilis subsp. natto），严格意义上来说并
非一个合法有效的名称，只是人们的传统习惯命名。
目前有效发表的枯草芽孢杆菌有 3 个亚种，分别为 B.
subtilis subsp. subtilis、B. subtilis subsp. spizizenii 和 B.
subtilis subsp. inaquosorum，已为研究人员所接受［22］。
本研究也遵从此命名法，认为定名为枯草芽孢杆菌
枯草亚种（Bacillus subtilis subsp. subtilis）较为适宜。
枯草芽孢杆菌及其近缘种群（简称枯草群）是
一群表型相似的革兰氏阳性、产芽孢的杆菌，但是
单一的鉴定技术不能完全胜任枯草群菌株的鉴定，
特别是通过生理生化等表型特征分析的方法。虽
然 16S rDNA 基因序列广泛应用于细菌鉴定或构建
细菌的系统进化关系，但对于枯草群的菌种由于序
列间的相似度太高而不能有效区分开来，因此通
过表型特性和 16S rDNA 序列分析将菌株鉴定到种
缺乏有力的证据。近年来研究者发现以编码蛋白
的基因作为系统发育鉴定标记可以弥补 16S rDNA
基因的不足，如 gyrA 基因、gyrB 基因、ropD 基因
等［23，24］。Rooney 等［21］利用 gyrA 基因研究了枯草
芽孢杆菌种间的复杂性发现，枯草芽孢杆菌的不同
菌株间存在很大的差异 ；可以基于 gyrA 基因的差异
分为不同的群。本研究结果显示，单独利用 gyrA 基
因进行 BLAST 搜索时，所获信息主要是 Rooney 等
登录的信息，利用这些信息构建系统发育树时，可
以发现菌株 Td 与已知菌株间的亲缘关系，因此根据
NCBI 上登录的 gyrA 基因信息来鉴定枯草芽孢杆菌
表 2 DNA 样品 a、b、m 的复性速率
时间 /min a 吸光度 b 吸光度 m 吸光度
0 1.7446 1.8811 1.6884
5 1.7371 1.9023 1.6851
10 1.7225 1.8863 1.6658
15 1.7084 1.8609 1.6534
20 1.6847 1.8463 1.6384
25 1.6750 1.8416 1.6210
30 1.6654 1.8322 1.6154
35 1.6530 1.8231 1.6098
40 1.6409 1.8186 1.6016
45 1.6380 1.8010 1.5882
kD
66.2
45.0
35.0
25.0
18.0
14.4
MA B1
bp
2000
1000
750
M 1
（A）菌株 Td 的发酵液 SDS-PAGE 电泳图，M ：protein marker，1 ：菌株 Td
的发酵液样品 ；（B）菌株 Td 的 PCR 扩增纳豆激酶基因的电泳图，M ：DNA
marker DL2000，1 ：菌株 Td 的 PCR 产物
图 3 纳豆激酶的 SDS-PAGE 和 PCR 扩增基因的电泳图
2.3.3 MALDI-TOF 质 谱 分 析 从 图 3-A 凝 胶 中 挖
取最亮的蛋白质条带采用胰蛋白酶进行胶内酶切
后用于 MALDI-TOF 分析。根据肽质量指纹谱和数
据库检索结果，MASCOT 值最高达 150，与枯草芽
孢杆菌的蛋白酶 Subtilisin E 相似性最高 ；验证了
7 条 序 列， 分 别 为 ：GAYSLSLR、GFFLFVEGGR、
GSSIFGLAPGK、SSGTSYPDVLK、VCNYVSWIK、
GSSIFGLAPGK、LNTLETEEWFFK， 这 与 纳 豆 激 酶
的序列完全相同。
2.3.4 纳豆激酶的基因序列 根据 PCR 扩增条带（图
3-B）和基因序列测定（图 4）结果，获得了菌株 Td
的纳豆激酶全基因序列。菌株 Td 的纳豆激酶基因
全长为 1 143 bp，以 GTG 为起始密码子，起始密码
子上游 -17- -11 bp 位点为核糖体结合位点 SD 序列，
SD 序列上游是 A/T 含量高达 72% 的转录调控区域。
随后是由 1 143 bp 组成的开放阅读框架，编码 379
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.1192
是可行的。
应用全基因组 DNA 杂交方法作为公认的标准
来划分细菌的种已为广大分类学家所接受，并且普
遍认为，细菌种内 DNA-DNA 杂交同源性为 60%-
100% ；80%-90% 以上的杂交同源性属于种内同一亚
种水平 ；60%-70% 以上的杂交同源性属于种内不同
亚种水平 ；而 20%-60% 的同源性则代表着待定菌
株是与参比菌株靠近的种。本研究中菌株 Td 与枯草
芽孢杆菌枯草亚种标准菌株 168 的 DNA-DNA 杂交
同源性达到了 92.3%，显著高于同一亚种的 DNA 杂
交同源性标准 ；同时参照 16S rDNA 和 gyrA 的基因
序列信息，因此将菌株 Td 定名为枯草芽孢杆菌枯草
亚种。
纳豆激酶的名称最初命名为 BSP［25］，随后改
为 subtilisin NAT［6］。比较纳豆激酶的氨基酸序列
与其他几种枯草杆菌蛋白酶发现它们有较高的同源
性，与枯草杆菌蛋白酶 E（Subtilisin E）的同源性
达到 99.5%，与枯草杆菌蛋白酶 amylosacchariticus、
subtilisin BPN 和 subtilisin Carlsberg 的同源性也分别
达 到 99.3%、86% 和 72%［6］。 本 研 究 应 用 MALDI-
TOF 质谱分析获得的结果与 subtilisin E 相似性最高，
这可能与两者序列高度相似有关。利用 PCR 克隆获
得的纳豆激酶全基因序列推导出的氨基酸序列也与
已报道的纳豆激酶的氨基酸序列完全一致。通过对
菌株 Td 发酵液进行 SDS-PAGE 测定纳豆激酶的分
子量大小、MALDI-TOF 分析氨基酸序列特征和 PCR
㺘⽪㓸→ᇶ⸱ᆀ˗ 㺘⽪㓸→ᒿࡇ117110961021946871796721
646
571
496
421
346
271
196
121
46
1
-28
-105
-180
1251
* * *㺘⽪-35४˗ 㺘⽪-10४˗ 㺘⽪SDᒿࡇ˗ 㺘⽪ؑਧ㛭˗ 㺘⽪ࡽሬ㛭˗
*
图 4 菌株 Td 的纳豆激酶基因及编码蛋白质序列
2016,32(1) 193王雪妍等：一株高产纳豆激酶菌株的鉴定与分析
克隆全基因序列，三者取得了一致的结果，相互印
证了纳豆激酶的氨基酸和核酸序列，为鉴定纳豆激
酶提供了依据。另外，本研究成功地克隆了纳豆激
酶全长基因，这为下一步的基因工程菌株的构建和
纳豆激酶的活性改造奠定了基础。
4 结论
根 据 菌 体 形 态、 生 理 生 化 特 征 和 16S rDNA、
gyrA 基因序列、DNA-DNA 杂交率等实验结果，鉴
定菌株 Td 为枯草芽孢杆菌枯草亚种（Bacillus subtilis
subsp. subtilis）；通 过 MALDI-TOF 质 谱 分 析 和 PCR
克隆基因，鉴定了菌株 Td 产生的纳豆激酶的分子特
征 ；SDS-PAGE 和纤溶活性测定表明菌株 Td 是一株
高产纳豆激酶菌株。
参 考 文 献
［1］Sumi H, Hamada H, Tsushima H, et al. A novel fibrinolytic enzyme
（nattokinase）in the vegetable cheese Natto ：a typical and popular
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（责任编辑 李楠）