全 文 ：·综述与专论·
生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 8期
纳豆激酶的研究现状与展望
逯京华　孙智杰
(北京理工大学生命学院 ,北京 100081)
　　摘 　要 : 　纳豆激酶是从日本传统食品纳豆中提取的一种枯草杆菌蛋白酶 ,具有高效的抗血栓作用。与其他传统溶栓剂
相比 ,纳豆激酶具有安全性好、成本低、易被人体吸收、作用直接迅速、作用持续时间长等优点 ,因此极有可能开发为新一代的
溶栓剂。概括了纳豆激酶的分子结构、理化性质、溶栓作用机理、活性检测方法 ,介绍了其分子生物学研究进展 ,并对其开发
应用进行了展望 ,证明纳豆激酶具有广阔的市场应用前景。
关键词 : 　纳豆激酶 　溶栓活性 　活性测定
The Research Advance and Prospect of Nattokinase
Lu J inghua　Sun Zhijie
( School of L ife Science B eijing Institu te of Technology, B eijing 100081)
　　Abs trac t: 　Nattokinase, extracted from the Japanese food2natto, has been found as strong fibrinolytic enzyme1 Compared with oth2
er thrombolytics, it is safer, lower in cost, easier to be absorbed by body and has more persistent effect on thrombosis, and longer half2
life1 In this paper, the structure, biochem istry characteristics, activity test on nattokinase, as well as the p rogress of nattokinase genet2
ic engineering in recent years were revieved1
Key wo rds: 　Nattokinase　Fibrinolytic function　Activity test
收稿日期 : 2009204201
作者简介 :逯京华 (19832) ,女 ,山东滨州人 ,硕士研究生 ,研究方向 :酶的活性测定 ; E2mail: lu2jing2hua@1631com
通讯作者 :孙智杰 , E2mail: sunzhijie@ bit1edu1cn
　　纳豆是盛行于日本的传统发酵大豆食品 ,至今
已有近 2000年的历史。经研究发现 ,纳豆含有大量
丰富的生理活性物质 ,具有抗血栓、降血压、抗菌、抗
氧化、预防癌症等多种显著的生理调节功能 ,日益受
到世界各国的重视。1987年 ,日本的 Sum i等 [ 1 ]首
先在这种日本传统食品中发现并且提取出具有溶解
血栓功能的活性物质 ———纳豆激酶 ( nattokinase,
NK)。此后研究人员对纳豆激酶从不同角度进行了
研究 ,并取得了一定的进展。
1　纳豆激酶的结构
111　纳豆激酶的分子结构
Nakamura等 [ 2 ]于 1992年首次测定了纳豆芽孢
杆菌 NC221的 1 473 bp的 NK全基因序列。NK基
因从第 181个碱基开始 ,以 GTG为起始密码子 ,随
后是 1 143 bp组成的阅读框架 ,分为 3个部分 :信号
序列、前序列和成熟序列 ,分别编码 29个氨基酸的
信号肽、77个氨基酸的前肽和 275个氨基酸的成熟
肽。结构基因的 3′末端为连续的 3个终止密码子
TAA、TA和 TAA。终止密码子之后的一段序列 : TA2
AAAAGAAGCAGGTTCCTCCATACCTGCTTCTTTTA ,
位于成熟蛋白区域 C端下游 7 bp处 ,此段终止序列
可形成茎环结构 ,即ρ因子非依赖性终止序列。起
始密码子上游 17 bp 处为核糖体结合位点 S2D 序
列 : AAAGGAG。S2D序列上游是一个 A + T含量高
达 72%的转录调控区域 ,但在此区域尚未找到与已
知枯草杆菌启动子相类似的保守序列。
112　纳豆激酶的蛋白质结构
纳豆激酶在酶学分类上称为枯草杆菌蛋白酶
NAT( Subtilisin NAT)。根据纳豆激酶基因的 DNA
序列推测氨基酸的一级序列 [ 3, 4 ] ,可知该激酶是由
275个氨基酸残基组成的单链多肽 ,准确分子量应
为 271728 kD。纳豆激酶的序列中含有 8个赖氨酸
残基 ,没有半胱氨酸残基 ,内肽酶可将其水解成为 9
个小肽。纳豆激酶的活性部位在 A sp232, H is264和
生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 8期
Ser2221处 [ 5 ] ,与底物的结合部位在 Ser2125, Leu2
126, Gly2127处 [ 6 ] , 3个活性位点位于纳豆激酶底物
结合口袋表面 ,而 3个底物结合位点位于底物结合
口袋的底部 [ 7 ]。纳豆激酶与其他枯草杆菌蛋白酶
同源性极高 [ 8 ] :与枯草杆菌蛋白酶 E在核苷酸序列
组成上一致性达 9915% ;与枯草杆菌蛋白酶 Amy2
losacchariticus一致性达 9913% ;与 Subtilisin Carls2
berg, Subtilisin BNP和 Subtilisin DY分别具有 69%、
85%和 70%的同源性。
2　纳豆激酶的理化性质
211　纳豆激酶的稳定性
纳豆激酶在自然 pH值状态下 ,相对比较稳定 ,
在 pH值从 7升至 12时 ,室温下 10 m in内稳定 ;当
纳豆激酶与煮沸的小麦提取液、煮沸的肉汤以及血
清蛋白和胃粘液蛋白 (1～50 mg干重 /m l)混合后 ,
纳豆激酶的稳定性有明显增加 ,甚至在 pH 2～3的
酸性条件还可保持 715%的活性。这说明纳豆激酶
可以在粘性环境提高耐酸性 ,由此推测其在胃肠中
可以达到较好的稳定性 ,具有口服药物的开发价值。
在温度低于 45℃时 ,酶活性相对稳定 ,在 40℃保温
30 m in活力也无变化 ,但温度超过 50℃,活力逐渐
丧失 ,超过 60℃时则因蛋白变性而迅速失活。若添
加明胶 ,可使其热稳定性提高 5倍以上 [ 9 ]。添加甘
油、丙二醇、牛血清蛋白、明胶、海藻酸钠等有利于提
高酶的热稳定性。反复冻融 5个循环时 ,其活性仍
保存 95%以上 ,表明冻融对纳豆激酶的活性无较大
影 [ 10, 11 ]。纳豆激酶的活性受金属离子影响 , Ca2 + 、
Cu2 + 、Zn2 +和 A l3 +等金属离子对其有不同程度的抑
制作用 , Hg2 +可使其完全失活 ,而 Mg2 +和 Co2 +对该
酶则有激活作用。此外 ,纳豆激酶可与血浆 α2 2巨
球蛋白按摩尔比 2∶1结合而失去活性 [ 12 ]。此外 ,纳
豆激酶的活性不因 5 mM半胱氨酸 (Cys)的存在与
否而改变 , 但是 1 mM 的二异丙基氟代硫酸盐
(DFP)和 5 mM的敌百虫 (Neguvon)则完全抑制酶
的活性 , 从而证明纳豆激酶为一种丝氨酸蛋
白酶 [ 13 ]。
212　纳豆激酶的等电点 (p I)值
用 Svunsson的柱型电泳法 ,等电聚焦测定纳豆
激酶具有对称的单一纤溶酶峰 ,其 p I值为 816 ±
013[ 14 ]。在分离纯化纳豆激酶时 ,可以考虑调节 pH
值到 p I值附近 ,有利于酶的纯化。
213　纳豆激酶的底物专一性
Sum i等 [ 1 ]利用几种人工合成的小分子短肽作
反应底物 ,研究纳豆激酶的酰胺水解活性 ,发现纳豆
激酶最敏感的底物是血浆纤溶酶底物 H2D2Val2Leu2
Lys2pNA ( S22251 )。而对于尿激酶底物 Pyro2Glu2
Gly2A rg2pNA ( S22444)和弹性蛋白酶底物 Pyro2Glu2
Pro2Val2pNA ( S22484)不起作用 ,说明纳豆激酶有其
特异的蛋白水解作用位点和识别位点。以氧化型胰
岛素 B链为作用底物 ,研究纳豆激酶的酶切特性发
现 ,纳豆激酶有严格的识别位点及限制性酶切位点 ,
首选酶切位点在 Leu152Tyr16,其次在 Ser92H is10,在
Gln42H is5及 H is52Leu6也有微弱的水解活性。与其
他一些枯草杆菌蛋白酶不同的是 ,纳豆激酶对氧化
型胰岛素 B链 C端 Tyr162A la30之间的肽段却无任
何酶切特性 [ 15 ]。因此 ,使用纳豆激酶作为溶栓药
物 ,可以避免类似使用尿激酶、链激酶类药物引起的
出血反映。
3　纳豆激酶的作用机理
目前市场上使用的溶栓药物 ,如链激酶、尿激
酶、t2PA等都属于纤溶酶原激活剂 ,它们都需要通
过激活靶酶 ———纤维蛋白溶酶原转变为纤维蛋白溶
酶 ,再与纤维蛋白结合 ,发挥溶栓作用 ,而它们本身
并不能直接作用于纤维蛋白。这类药物在体内的半
衰期比较短 ,要使其达到应有的疗效 ,必须大剂量长
期用药 ,导致机体出现出血和渗血现象 [ 16 ] ;而且价
格比较昂贵。纳豆激酶与上述溶栓药物相比成本
低、安全性好、分子量小、口服效果好、溶栓活性高、
作用持续时间长等 ,有望被开发为一种市场竞争能
力强的新型溶栓药剂。
纳豆激酶具有多元化的溶栓机制 ,对于纤维蛋
白尤其是交联状态的纤维蛋白更为敏感 [ 17 ] ,动物体
内实验和健康人群口服性实验显示 ,服用纳豆激酶
后血液中的优球蛋白溶解时间明显缩短 ,纤维蛋白
的降解产物迅速增加 [ 18 ]。有实验表明纳豆激酶直
接纤溶活性与间接激活溶栓活性比为 17∶1[ 19 ] ,因
此直接溶解纤维蛋白占主导地位。纳豆激酶除了直
接降解纤维蛋白 [ 20 ]以外 ,还可以刺激血管内壁产生
内源纤溶酶原激活剂 ,进一步增加溶栓效果。另一
方面 ,纳豆激酶可以激活由肾脏产生的尿激酶原 ,使
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2009年第 8期 逯京华等 :纳豆激酶的研究现状与展望
其转化成有活性的尿激酶 [ 21 ] ,激活后的尿激酶作为
组织激活物激活纤溶酶原起到溶栓作用。体内正常
分泌的纤溶酶原激活剂会受到纤溶酶原激活剂抑制
物的抑制而失去活性 ,研究发现纳豆激酶具有溶解
纤溶酶原激活剂抑制物的作用 ,以保证纤溶酶原激
活剂的生理活性 [ 22 ]。
4　纳豆激酶活性检测
纳豆激酶的活性反映了纳豆的保健功效 ,是纳
豆激酶研究的基础 ,因此其活性测定是纳豆研究和
质量控制中必需也是关键的技术之一。目前测定纳
豆激酶活性的方法主要有琼脂糖 2纤维蛋白平板法、
纤维蛋白块溶解时间法、四肽底物法、血清板法和酶
联免疫吸附法 [ 23 ]等。
411　琼脂糖 2纤维蛋白平板法
琼脂糖 2纤维蛋白平板法是根据 A strup ( 1952)
方法改进的 ,是目前最常用的纤溶酶溶栓活力的测
定方法 [ 3 ] ,也是最早用于纳豆激酶溶栓活力的测定
方法之一 [ 1 ]。将琼脂糖、纤维蛋白原溶液和凝血酶
按一定比例混合 ,制成人工血栓平板。以不同浓度
的尿激酶点样于平板 ,并绘制关于尿激酶浓度和该
浓度下溶解圈直径平方的坐标曲线 ,根据待测纳豆
激酶样品溶解圈直径 ,在坐标曲线上读取相应的酶
活浓度。此法简便易行 ,可同时测定多个样品 ,但由
于溶解圈面积完全是表观值 ,受恒温孵育时间影响
很大。当恒温时间增加时 ,对应值反而会显著减少 ,
因此对恒温时间的控制十分重要。与纳豆激酶精制
产品相比 ,粗制酶活性测定受孵育时间影响更大 ,这
可能是由于粗酶中杂质的影响 [ 24 ]。
412　纤维蛋白块溶解时间法 [ 25 ]
在 0℃依次向试管中加入凝血酶、巴比妥钠缓
冲液、纳豆激酶样品溶液和纤维蛋白原。迅速摇匀 ,
置于 37℃下恒温观察 ,以产生的气泡上升至液体体
积一半时为终点。同样以标准品作对照 ,可以算出
样品的活力值。此法迅速快捷 ,分辨率较大 ,更适于
粗酶的活性测定 ,但由于需要精确判断反应时间 ,所
以不太适合灵敏度要求较高的样品的活性测定 ,也
不方便多个样品的同时测定。
413　四肽底物法 [ 26 ]
纳豆激酶与枯草杆菌蛋白酶 E只有两个氨基
酸的差异 [ 1 ]。二者的催化中心和结合中心相同 ,因
此有人用测定枯草杆菌蛋白酶 E的方法来测定纳
豆激酶的活性 [ 27 ]。在四肽底物 Suc2A1a2A la2Pro2
Phe2pNA溶液中加入纳豆激酶样品 , 37℃孵育 1
m in,测定单位时间内波长 410 nm处吸光度值的变
化。杨明俊等 [ 28 ]从线性和精密度两个方面对纤维
蛋白平板法和四肽底物法测定纳豆激酶活性的两种
方法进行了比较研究 ,验证了两种方法测定值之间
有很好的直线相关性 (R2 = 019942)。该法简便、快
捷、灵敏度高 ,适用于纳豆激酶的快速测定及发酵工
艺、分离纯化等需要高通量筛选的分析。但不能直
接反映纳豆激酶的溶栓活性。
414　血清平板法 [ 26 ]
血栓纤维在波长 655 nm处吸光度值最大 ,随着
其浓度降低 ,吸光度值也将下降。在血清平板的小
孔内按纤维蛋白平板的制作方法制成微型血栓 ,然
后各孔内加入纳豆激酶样品和标准品 ,反应开始 4 h
内 ,每 30 m in测 1次 OD655值。根据每次 OD655值同
初始 OD655值之差 (ΔOD655 ) ,以 2ΔOD655 /h为斜率 ,
同纳豆激酶样品浓度作图。
该方法样品消耗少 ,成本低 ,可多样品同时进
行 ,可信度高。但人工血栓的制备对吸光值的测定
有一定影响 ,不过如果反应开始时小孔内的血栓的
吸光值在 012以上时 ,那么人工血栓的调制对 OD655
值影响不大。
415　酶联免疫吸附法 ( EL ISA ) [ 29 ]
将纳豆激酶的特异性单克隆抗体吸附在于微孔
平板 ,用牛血清蛋白 2磷酸盐缓冲液冲洗并填补空
位。加入纳豆激酶样品与单克隆抗体结合 ,使纳豆
激酶固定于微孔平板 ,加入连有过氧化氢酶的多克
隆抗体与纳豆激酶 2单克隆抗体结合物 ,然后加入新
配置的底物溶液和 1 mol/L 的 H2 SO4 ,测定波长
490 nm处的吸光度值。此方法灵敏度高 ,可达 011
μg/L,可进行定量定性分析 ,但是操作成本高 ,难
度大。
5　纳豆激酶的分子生物学研究进展
根据 Nakamura等 [ 2 ]测出的纳豆激酶全序列 ,现
已对纳豆激酶基因进行克隆重组等研究 ,很多研究
者都克隆出了纳豆激酶基因并表达成功。有学者已
成功从分泌纳豆激酶的枯草杆菌基因组 DNA中扩
增得到了纳豆激酶基因 ,构建了纳豆激酶基因的表
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 8期
达载体 ,并在大肠杆菌中进行了表达 [ 30～32 ]。张锋
等 [ 33 ]获得了纳豆激酶基因并将其整合到番茄基因
组中的生物反应器 ,但活性和含量仍需进一步测定。
利用调控基因及转基因技术组建工程菌的方法来提
高纳豆激酶产量方面的研究正在逐步深入。
当前的表达系统多以原核表达系统为主 ,且酶
能够直接分泌到细胞外。高表达载体常使表达产物
以包涵体的形式存在 ,该包涵体可以保护蛋白免受
水解 ,但是溶栓活性较低 ,故常需体外诱导表现酶
活 ,另外 ,表达的蛋白背景杂蛋白很多 ,表达量一般
不高 [ 34 ]。虽然现有的研究能够利用基因工程菌生
产纳豆激酶样品。但是对此类基因工程菌下游工
艺 ,如工程菌的发酵、表达产物的分离纯化、表达产
物的产量及收率等方面的研究仍然处于探索阶段。
6　纳豆激酶的开发现状和应用前景
根据 WHO公布的统计数字 ,全世界现在患有
各种血栓性疾病的患者有 1 500万之多 ,其中每年
约有 300万患者死亡 ,同时 ,这种状况向低龄化发
展。所需的溶栓剂的潜在市场约 20亿美元 [ 35 ]。目
前临床注射的抗血栓药物普遍存在着稳定性差、药
效短、副作用大和成本高等缺点 ,因此 ,国内外在治
疗血栓病方面正趋向于低价高效、易吸收、体内半衰
期长以及可以口服的药物或保健食品的研究。纳豆
激酶来源于传统发酵食品 ,生产工艺简单 ,无副作
用 ,安全性高 ,完全符合治疗血栓病的药品或食品基
料的要求 ,因此有着很好的应用前景和广阔的市场。
目前大多数公司所生产的纳豆激酶产品既可作
为单一制剂又可与其他成分如 SOD、DHA、VE、卵磷
脂、银杏提取物、蜂蜡等复合 ,制成粉剂、片剂、软硬
胶囊或口服液 [ 36 ] ,作为保健品来食用 ,调节体内免
疫系统 ,促进和改善血液循环 ,预防心脑血管性疾
病。日本已有 10余家大公司生产出多种以纳豆激
酶为主要成分的产品 ,大和制药公司的 NKCP已经
上市 ,美国国际医卫生技术制药股份有限公司的
NK胶囊也已面市 ,韩国和朝鲜也有类似产品问世。
在我国 ,黑龙江省科学院应用微生物研究所的豆激
酶制剂 ———恩开胶囊的生产工艺已经到中试阶
段 [ 37 ] ,纳豆激酶的口服药剂也有多家投产上市 ,如
草仙药业的净血酶纳豆胶囊、燕京啤酒公司的纳豆
胶囊、天津宝恒生物的蛋白硒纳豆胶囊、湖南贵生坊
的纳豆素胶囊、北京龙兴的纳豆激酶胶囊等。但真
正用于急救的纳豆激酶针剂生产情况鲜见报道 ,可
见在纳豆激酶的分离纯化方面还有待进一步研究。
另据报道 ,纳豆激酶中含有血管紧张素转化酶抑制
剂 (ACE I)的成分 ,这种抑制剂是一种抗高血压良
药 ,因此可以进一步研究纳豆激酶在治疗高血压方
面的应用 [ 38 ]。由于纳豆激酶良好的降纤作用和广
泛廉价的微生物来源 ,还可以将其应用在木质纤维
或皮毛的处理等方面 ,用以改良产品的柔软度、可着
色性、洁白度等性质。
综上所述 ,纳豆激酶在我国具有广阔的开发前
景 ,由于其许多良好的生理调节功能和特殊的溶血
栓活性 ,它将为预防和治疗血管栓塞性疾病 ,解决血
栓溶解药物口服性差、价格昂贵、并发症多等问题带
来巨大的福音。
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