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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2016, 32(2):172-177
一氧化氮（NO）作为内源性气体信号分子［1］
在调节植物生长发育［2-9］和胁迫响应［10-17］等方面
起着重要的作用。干旱是世界最为严重的自然灾害
之一，据统计全球由于水分胁迫导致的作物减产，
可以超过其他因素造成减产的总和［18］。而我国国土
总面积的 52.5% 是干旱和半干旱地区［19］，严重阻碍
了农业和林业生产及生态环境的改善［20，21］。
细胞骨架作为细胞生物学发展中较晚发现的一
种新的细胞器，参与动植物的各种生长发育和生理
活动［22］，而真核生物细胞骨架的重要成分有微管、
收稿日期 ：2015-09-29
基金项目 ：国家自然科学基金项目（30870137），山西省高等学校科技创新基金项目（20101129）
作者简介 ：马晓丽，女，博士研究生，副教授，研究方向 ：植物细胞学 ；E-mail ：mxl425@126.com
一氧化氮对干旱胁迫下白菜幼苗微管蛋白的影响
马晓丽  冀瑞萍
（晋中学院 生物科学与技术学院，晋中 030600）
摘 要 ： 旨在探讨一氧化氮对干旱胁迫后白菜叶片微管蛋白的影响，以津育 11 白菜种子为实验材料，分别采用 15、18、
21、24 和 27 g/mL 5 种不同浓度的 PEG6000 溶液对 7 日龄白菜幼苗进行模拟干旱处理，通过紫外分光光度计和 SDS-PAGE 聚丙烯
酰胺凝胶电泳研究不同处理组白菜幼苗叶片微管蛋白含量的差异，确定 PEG6000 最佳处理浓度为 27 g/mL。50、100 和 150 μmol/L
3 个不同浓度的一氧化氮对 PEG6000 处理组进行熏蒸，观察不同处理组白菜幼苗叶片微管蛋白含量的变化差异。结果显示，与对
照组相比不同浓度 PEG6000 对白菜幼苗叶片微管蛋白含量都呈增加的趋势，经一氧化氮处理后降低 ；且在干旱胁迫的过程中白菜
体内编码一氧化氮的基因表达量和一氧化氮含量都有大幅上调。因此，生理浓度的一氧化氮对干旱引起的微管蛋白的解聚有一定
的缓解作用，减少胁迫对植株造成的损害。
关键词 ： 白菜 ；一氧化氮 ；干旱 ；微管蛋白
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.02.023
The Influence of Exogenous Nitric Oxide on Microtubulin of Brassica
pekinensis Under Drought Stress
MA Xiao-li JI Rui-ping
（College of Life Sciences，Jinzhong University，Jinzhong 030600）
Abstract: In order to study the effect of nitric oxide（NO）on microtubulin in drought-stressed Brassica pekinensis, using B. pekinensis
cultivar Jinyu-11 as experimental material, and the drought situation was simulated by treating 7-day seedlings with 15, 18, 21, 24, 27 g/mL
of PEG6000 concentrations. Ultraviolet spectrophotometry and SDS-PAGE were used to investigate the differences of microtubulin content in
cabbage seedling leaves, and the optimal treatment concentration of PEG6000 was determined to be 27 g/mL. Then the pretreated seedlings were
fumigated with various concentrations of NO ：50, 100, and 150 μmol/L respectively, and the variations of microtubulin content in the treated
cabbages were observed. Results showed that the contents of microtubulin in cabbage seedling leaves demonstrated the trend of increasing with
PEG6000 pre-treatments compared to control, but decreased after NO treatment. Moreover, both the content of endogenous NO and the expression
of NO-related genes increased significantly under drought stress. Therefore, physiological concentration of NO alleviated the disaggregation of
microtubulin caused from drought stress at certain level, which eliminated the damages to plants from the stress.
Key words: Brassica pekinensis ；nitric oxide ；drought stress ；microtubulin
2016,32(2) 173马晓丽等：一氧化氮对干旱胁迫下白菜幼苗微管蛋白的影响
微丝和中间纤丝，其中微管主要由微管蛋白 α、β 亚
基聚合形成直径为 25 nm 的中空管状结构，参与细
胞形态的发生和维持、细胞内物质运输、细胞运动
和细胞分裂等过程［23，24］。干旱胁迫虽一直是植物研
究热点，但是对于 NO 对干旱胁迫下白菜幼苗细胞
骨架的影响还未见报道。
本研究以白菜幼苗为材料，研究聚乙二醇 6000
（PEG6000）模拟干旱处理和一氧化氮后续处理幼苗
叶片中微管蛋白的含量的变化，以期探讨微管蛋白
在 PEG6000 模拟干旱和 PEG6000 模拟干旱 - 一氧
化氮复合处理后在植物中的功能，从而为研究 NO
气体信号分子对调控植物生长发育的作用和增强植
物抗逆影响等方面提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
津育 11 号白菜（Brassica rapa pekinensis）由山
西省农业科学院蔬菜研究所提供。
1.2 方法
1.2.1 材料培养 选取籽粒饱满大小均匀的白菜种
子用次氯酸钠消毒 3-5 次，并用无菌水漂洗数次后，
培养于铺有湿滤纸的培养皿内，30 粒 / 盘，每组 3
次重复，温度（22±1）℃，相对湿度 65%，光照
强度 180 μE/（m2·s），光周期为 16/8 h（昼 / 夜），7
d 后开始对白菜幼苗进行处理。设对照（CK）、PEG
处理、PEG+NO 处理、PEG+PTIO 处理共 4 组。
1.2.2 PEG6000 处理 PEG 处理参考张仪章［25］的
方法，7 日龄白菜幼苗，吸去培养皿中水分，分别
加入 15 mL 不同质量浓度（15、18、21、24 和 27 g/mL）
的 PEG6000 处理 12 h。
1.2.3 一 氧 化 氮 处 理 NO 供 体 硝 普 钠（sodium
nitrop russide，SNP）购买自 Sigma 公司。经 27 g/mL
PEG6000 干旱胁迫的白菜幼苗，分别再用浓度为
50、100 和 150 μmol/L 的 NO 密闭熏蒸处理 24 h。
1.2.4 白菜幼苗叶片微管蛋白提取 称取白菜幼苗
叶片 0.1 g（除去叶柄和叶脉），放入已加入 1 mL 微
管蛋白提取缓冲液的预冷的研钵中，置于冰盒上研
磨， 用 超 高 速 离 心 机（Micro Ultracentrifuge GX Ⅱ
Hitachi）离心（53 600×g，4℃，20 min），离心后
取上清液［26］。
1.2.5 测定白菜幼苗叶片的微管蛋白含量 参照李
合生［27］方法，取上清液样品提取液 20 μL，加蒸馏
水 780 μL，CBB 200 μL，总体积共 1 mL，混匀后在
595 nm 下比色测定吸光值，并通过查实验室中已得
的标准曲线［标准曲线公式 ：y=0.0019x+0.352，y 为
测出值，x 为蛋白含量（μg）］计算得出蛋白质的含量。
提取液样品中微管蛋白含量的计算公式如下 ：
VS×WF×1000
C×VT㳻ⲭ䍘ਜ਼䟿mg/g
其 中，C ：实 验 室 查 到 的 标 准 曲 线 对 应 值（μg）；
VT ：加入的提取液的总体积（μL）；VS ：分光光度计
测定时的加样量（mL）；WF ：样品鲜重量（g）。
1.2.6 SDS-PAGE 凝 胶 电 泳 用 SDS-PAGE 凝 胶 电
泳，采用 3% 的浓缩胶和 10% 的分离胶，厚度为 0.75
mm。上样前按体积比 1∶1 加入 20 μL 的提取液和
20 μL 的 2×上样缓冲液，然后放入沸水中热处理 3
min。点样 20 μL，80 V 电压下电泳 30 min，接着换
成 130 V 电压，电泳 60 min。
1.2.7 NO 含量的测定 NO 浓度的测定用硝酸还原
酶法，按照 NO 浓度测试盒说明书进行测定，按上
述公式计算 NO 浓度。
1.2.8 白菜 NOS 基因相对表达量的测定 取不同
处理组白菜幼苗叶片各 0.05 g，提取 RNA。BraNOS
引 物 为 F（5-GCTCGTAGACTGCCTCTTC-3） 和 R
（5-GACGCTTGCCACGCGAGATAC-3）；内 参 基 因
18S rRNA 为 F（5-CCTGCATACCGCAGCTAGGA-3）
和 R（5-GCGGCAATACGAATGCCCC-3）， 由 TaKa-
Ra 公司合成。采用 2-△△CT 方法对实时荧光定量 PCR
的结果进行基因表达的相对定量分析计算。
1.2.9 统计分析 结果为 3 次重复的平均值，数据
使 用 STATISTICA（Stat Soft Inc，Tulsa，OK） 软 件
进行分析，多重比较用 Duncan 新复极差法。
2 结果
2.1 干旱胁迫对白菜幼苗叶片微管蛋白含量的影响
对照组和经不同浓度 PEG6000（15、18、21、
24 和 27 g/mL）处理后微管蛋白含量变化（图 1）显
示， 与 对 照 组 相 比，PEG6000 在 5 个 浓 度 处 理 后
的白菜幼苗微管蛋白含量都表现为增加的趋势，且
PEG6000 浓度越高，微管蛋白含量增加越明显，增
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.2174
加百分比分别为 28.87%、34.51%、36.62%、44.37%
和 51.39%。因此选定 27 g/mL 作为干旱胁迫最佳处
理浓度。
已有研究可知，纯化的微管蛋白主要由 α 亚基
和 β 亚基以 1∶1 的二聚体形式存在，分子量大小是
110 kD。经 SDS-PAGE 电泳（图 2）显示，出现分子
量大约为 53 kD 的条带，而 55 kD 是微管蛋白单体
分子量，推测可能是由于非共价键遭到破坏使所提
取的白菜幼苗叶片微管蛋白发生解聚，因此该电泳
图谱显示的是微管蛋白的单体分子量。此外，从图
2 可看出对照组和各处理组的电泳条带大小基本相
同，说明经干旱胁迫后的白菜幼苗叶片的微管蛋白
都发生降解，且根据条带的粗细不同可知干旱胁迫
浓度越高降解程度越大，与 PEG 浓度对白菜微管蛋
白含量影响（图 1）得到的结果一致。
旱胁迫后的白菜幼苗再经 50、100 和 150 μmol/L 3
个浓度的 NO 处理后，白菜幼苗叶片的微管蛋白含
量分别有不同程度的下降。浓度为 50 μmol/L 时的
作用并不明显，推测浓度偏低，对植物的影响较小。
随着处理浓度的提高，微管蛋白含量发生较大的变
化，浓度为 150 μmol/L 时能最大程度的降低胁迫后
引起的微管蛋白含量的升高。说明在生理浓度范围
内较高浓度 NO 在一定程度上对 PEG6000 模拟干旱
胁迫处理的白菜幼苗叶片微管蛋白的解聚有一定的
缓解作用。
图 4 不同处理组对微管蛋白含量的影响
图 3 外源 NO 对干旱胁迫下白菜幼苗微管蛋白含量的影响
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ᗞ㇑㳻ⲭਜ਼䟿μg·g-1 
0
a
b
b b
c
d
15 18 21 24 27
PEG⎃ᓖg·mL-1
不同大小写字母分别表示处理在 P<0.01、P<0.05 水平存在极显著差异和显
著差异 , 下同
图 1 不同浓度 PEG 对白菜微管蛋白含量的影响
1-6 ：PEG 浓度分别为 0、27、24、21、18 和 15 g/mL
图 2 不同浓度 PEG 对白菜微管蛋白影响的 SDS-PEG 凝
胶电泳图
GADPHᗞ㇑㳻ⲭ1 2 3 4 5 6
2.2 外源NO对干旱胁迫下白菜幼苗叶片微管蛋白
含量的影响
不同浓度的 NO 对对照组幼苗叶片中的微管含
量的影响（图 3）表明，没有明显差异。而经过干
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ᗞ㇑㳻ⲭਜ਼䟿μg·g-1 
50
A
a
A
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b
100 150
处理组/μg·mL-1 0 g/mL PEG27 g/mL PEG
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ᗞ㇑㳻ⲭਜ਼䟿μg·g-1 
CK
a
b
a
b
PEG PEG+NO PEG+PITO
各处理组
2.3 不同处理组白菜幼苗叶片微管蛋白含量的变化
为进一步研究 NO 在白菜抵御干旱胁迫中的作
用，用 150 μmol/L 的 NO 供体 SNP 和 NO 合成抑制
剂 PITO 对白菜幼苗进行预处理，观察微管蛋白的含
量变化。与对照组 CK 相比（图 4），PEG 处理组微
管蛋白含量大幅增加，胁迫后的幼苗再经 NO 处理
后发现能在一定程度上降低微管蛋白的含量，这种
2016,32(2) 175马晓丽等：一氧化氮对干旱胁迫下白菜幼苗微管蛋白的影响
降低又能被 NO 清除剂 PITO 抑制，表现出该组微管
蛋白的含量低于干旱胁迫组却高于 PEG+NO 组，且
差异显著。
2.4 干旱胁迫后白菜幼苗叶片NO合成相关基因的
表达量及内源NO含量的变化
为了进一步探究外源 NO 对干旱胁迫后微管
蛋白含量发生变化的原因，对白菜叶片中编码一
氧化氮酶的基因和幼苗体内内源含量进行了测定。
BraNOS 是白菜体内产生一氧化氮酶的主要编码基
因，白菜幼苗在经干旱胁迫后该基因的表达水平
相对于未经处理的对照组都显著上调且在处理 12
h 后达到最高。同时叶片内源 NO 含量也显著升高
（图 5），即在受到干旱胁迫后白菜幼苗体内 NO 含量
显著升高，说明 NO 可能参与到白菜响应干旱胁迫
的抗逆调节过程中。
管蛋白。目前我们已知微管骨架主要由微管蛋白和
微管结合蛋白组成，并且通过其亚单位不断延伸和
缩短发生踏车现象，从而改变它的存在状态。高素
娟等［29］研究发现，光是其中一种调控微管组织的
影响因素，且在受到化学试剂及环境胁迫时，体
内胞质微管会迅速组装或解聚。程娜娜等［30］研究
发现，当拟南芥叶片受到增强 UV-B 辐射累积到一
定程度时，体内微管蛋白单体含量显著升高。时兰
春［31］的研究表明，当膨压下降时，微管会弯曲、
解聚甚至出现荧光斑点，微丝在质壁分离部位解聚，
而在不发生质壁分离的部位其排布模式则发生改变；
当膨压上升时，微丝解聚，但是微管随原生质体膨
胀而被拉伸，不仅无解聚现象甚至可以观察到新微
管合成。
本实验使用不同浓度 PEG6000 处理 7 日龄的
白菜幼苗，采用 SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴
定所提取的白菜幼苗叶片的微管蛋白。经 5 种不同
PEG6000 浓度下模拟干旱处理后，白菜幼苗叶片微
管蛋白含量都呈现增加的趋势，推测由于 PEG6000
模拟干旱处理后，幼苗叶片中的微管发生了解聚，
使体系中的微管蛋白的单体含量增加，而微管解聚
可能是白菜幼苗在 PEG6000 模拟干旱处理下形成的
自我保护功能，这与郭爱华［26］研究的小麦微管蛋
白和程娜娜［30］研究拟南芥微管蛋白的结果一致。
胁迫后再经 3 个浓度的 NO 复合处理时，随着 NO 浓
度的增加，白菜幼苗叶片微管蛋白单体含量呈现逐
渐减少的趋势，可能是生理浓度范围内较高浓度处
理下，白菜幼苗叶片微管发生聚合，从而使测得的
体系中微管蛋白单体含量降低。在干旱胁迫过程中
植物为了应对干旱所造成的伤害，产生 NO 的相关
基因表达量显著提高，同时体内 NO 含量也随之显
著升高，而在没有干旱胁迫的对照组中编码 NO 的
相关基因的相对表达量并没有发生显著变化。所以，
NO 可能参与到了白菜幼苗应对干旱胁迫的过程，并
只在受到胁迫时才发生变化。综上所述，NO 处理提
高了植物的抗干旱能力，参与到了植物抗逆生理过
程中。在 PEG6000 模拟干旱和 NO 熏蒸处理后，白
菜幼苗叶片微管蛋白含量的增减，取决于 PEG6000
的浓度、NO 的浓度和植物对 PEG6000 和 NO 的敏
感程度差异。至于 NO 以何种机制影响干旱胁迫下
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CK PEG
A
B
图 5 干旱胁迫对白菜幼苗一氧化氮合酶基因表达量（A）
和内源一氧化氮含量（B）的影响
3 讨论
植物微管的研究与动物微管相比较而言相对落
后，其主要原因是从植物细胞中提取微管蛋白相对
较困难。Morejohn 等［28］首次在体外成功聚合在玉米、
烟草、胡萝卜和玫瑰悬浮细胞中分离纯化得到的微
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.2176
白菜幼苗叶片微管蛋白的机理还有待进一步研究。
4 结论
干旱胁迫下白菜幼苗生长受到抑制，白菜幼苗
叶片中的微管蛋白发生解聚致使单体含量增加。经
干旱胁迫后的白菜幼苗接着给予外源 NO 的处理，
可以显著缓解干旱胁迫对白菜幼苗生长的抑制。与
PEG 组相比，PEG+NO 处理组白菜幼苗叶片微管蛋
白单体含量减少且差异显著，PEG+PITO 组则几乎
恢复到 PEG 组水平。在 PEG 干旱胁迫期间，白菜
幼苗叶片内产生 NO 的主要基因 BraNOS 大量表达，
与在此期间 NO 含量急剧升高的结果一致。说明在
胁迫条件下，可以通过提高白菜幼苗体内 NO 含量
来降低胁迫后微管蛋白的伤害程度，从而缓解干旱
胁迫对白菜幼苗生长的抑制作用。
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（责任编辑 李楠）