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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第7期
植物激素通过调节有关基因的表达来调控植物
的生长发育和植株对逆境胁迫的应答反应。其中乙
烯可以调控植物的生长发育。如花的发育［1］，果实
的成熟过程［2］，以及对病源侵染［3，4］、低氧［5］、低
温及干旱等逆境胁迫的应答反应［6］。在一些植物
中，已知被植物激素乙烯调节的相关基因含有顺式
作用元件 GCC 盒（AGCCGCC 序列）［7］。乙烯反应
元件因子（ERF）可以辨认结合 GCC 盒［8］，是乙烯
收稿日期 ：2013-02-06
作者简介 ：高蓝，女，博士，教授，研究方向 ：生化与分子生物学 ；E-mail ：gaolangdpu@yahoo.cn
栀子 ERF 基因的克隆及其在果实成熟
过程中的表达
高蓝  卢静雯
（广东药学院基础学院，广州 510006）
摘 要 ： 乙烯反应元件因子（ethylene-responsive element-binding factor，ERF）是一类植物 DNA 结合蛋白，是乙烯信号传导
过程中的一类转录因子，与植物的生长发育和生理过程有关。从栀子（Gardenia jasminoides Ellis）果实的 cDNA 文库中筛选获得栀
子乙烯反应元件因子 GjERF 的 cDNA。该基因全长 962 bp，5 端非翻译区长 82 bp，3 端非翻译区长 100 bp，预测 ORF 为 780 bp，
编码 259 个氨基酸，分子量为 28.6 kD。序列分析表明 GjERF 含有 59 个氨基酸构成的 AP2/ERF 结构域及 N 端的 MC（MCGGAII）模体，
它属于 ERF 家族的第Ⅶ亚类。RT-PCR 分析表明 GjERF 基因在栀子成熟叶片中的表达高于在果实中的表达，并且在果实中的表达
与果实的成熟过程无关。
关键词 ： 栀子 乙烯反应元件反应因子 克隆 表达
Molecular Cloning and Expression Analysis of ERF Transcription
Factor Gene in Gardenia jasminoides During Fruit Development
Gao Lan Lu Jingwen
（School of Basic Courses of Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou Higher Education Mega Center，Guangzhou 510006）
Abstract:  Ethylene-responsive element-binding factor（ERF）genes constitute one of the DNA-binding protein gene families in plants,
and are transcription factors associated with ethylene signal transduction, developmental and physiological processes. In this paper, a new member
of the AP2/ERF transcription factor family, GjERF, was isolated from Gardenia jasminoides fruit cDNA library. The GjERF cDNA is 962 bp,
contains a predicated 780 bp open reading frame that encodes a protein of 259 amino acids with calculated molecular mass of 28.6 kD, and with
a 82 bp non-coding region at 5 end, a 100 bp of non-coding region flank at 3 end. Sequence analysis showed that GjERF contained an AP2/
ERF domain of 59 amino acids and a N- terminal MC motif（MCGGAII）. It belonged to a group Ⅶ protein in the ERF subfamily. The RT-PCR
analysis indicated that the transcription of GjERF gene accumulated primarily in mature leaves of G.jasminoides, and was not related with fruit
developmental stages.
Key words:  Gardenia jasminoides ERF Clone Expression
信号传导中涉及的一类转录因子，已在多种植物中
被分离鉴定。如烟草中的 NtERF［9］、拟南芥的 AtE-
RF［10］、番茄的 leERF 和 Pti［3，11］、矮牵牛（Petunia
hybrida）的 PhERF［1］、水稻的 OsERF［12］和大豆的
GmEREBP1［13］等。ERF 转录因子家族都含有一个
保守的由 60 个左右氨基酸组成的结构域（ERF 结构
域），与拟南芥中的蛋白 APETALA2 的 AP2 结构域
相似［14］，是 AP2/ERF 转录因子家族中的 ERF 亚类，
2013年第7期 61高蓝等 ：栀子 ERF 基因的克隆及其在果实成熟过程中的表达
与 DNA 以单体的形式结合。ERF 结构域含有 3 个反
平行的 β-折叠和一个 α-螺旋结构［15］，其中这 3 个 β-
折叠结构在识别顺式作用元件的过程中具有重要作
用。全基因组分析表明，拟南芥有 122 个 ERF 蛋白
基因，水稻有 139 个 ERF 蛋白基因［12］。对各种植
物的 ERF 的功能和表达研究则相对不多，如在拟南
芥中只有少数 ERF 蛋白已经确认参与了对胁迫或对
乙烯的应答反应［10，16］。在番茄中，已知 Pto 蛋白激
酶是对丁香假单胞杆菌番茄致病变种（Pseudomonas
syringae pv.Tomato）的抗性蛋白，Pti4、Pti5 和 Pti6
蛋白可结合于 Pto 蛋白激酶基因的顺式作用元件，
促进该激酶的表达［3］。苹果的 MdERF3，MdERF4，
MdERF5 和 MdERF6 因 子 在 灰 霉 病 菌（Botrytis
cinerea）感染时表达增加，并可受乙烯的诱导［4］，
瞬间在烟草中表达 MdERF3 可增加含 GCC 盒的几丁
质酶的表达。在番茄中的 LeERF1 与果实的成熟相关，
过表达 ERF 可增进番茄果实的软化和成熟［2］。
ERF 类转录因子参与植物的多种生理过程和生
长发育的调节，对于相关基因的分离及其表达和功
能的研究有重要意义。本研究从栀子中分离 GjERF
的 cDNA，并分析其在栀子不同组织和发育时期转
录水平的表达，旨为研究其作用机理奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
栀子（Cardenia jasminoides）培养于广东药学院，
随着栀子果实的发育，采摘果肉为无色（发育期Ⅰ）
及果肉为橙黄色（发育期Ⅱ）的栀子果实。并采摘
栀子的成熟叶片。果实及叶片均经液氮中速冻后，
冷冻于 -80℃。
1.2 方法
1.2.1 栀子 cDNA 文库的构建及随机测序获得 GjERF
基因序列 从栀子果实（发育期Ⅱ）中以 CTAB［17］
改良法提取总 RNA，在液氮中研磨栀子果实，加入
65 ℃ CTAB 提 取 液（2% CTAB（W/V），2% PVPK30
（W/V），100 mmol/L Tris-HCl（pH8.0），25 mmol/L
EDTA（pH8.0），2.0 mol/L NaCl）和 4%（V/V）β-疏
基乙醇，保温 30 min。接着以 12 000×g 在 4℃离心
10 min， 上 清 液 加 等 体 积 苯 酚∶ 氯 仿∶ 异 戊 醇
（25/24/1，V/V）抽提，接着以 12 000×g 离心 20 min。
水相加等体积 4 mol/L LiCl 溶液沉淀 RNA，4℃过夜。
以 12 000 ×g 离心 20 min，RNA 沉淀以 DEPC 水溶解，
接以 0.1 体积的 3 mol/L NaOAC（pH5.2）和 2 倍体
积的无水乙醇在 -20℃沉淀 1 h。最后以 12 000 ×g
离心 20 min，RNA 沉淀以 75% 乙醇洗涤，挥干后以
DEPC 水溶解。总 RNA 用于构建 cDNA 文库，采用
Creator TM SMARTTM cDNA 文库构建试剂盒（Clontech
公司，美国）构建栀子果实的 cDNA 文库，按试剂
盒说明书提供的方法操作。栀子的 cDNA 插入在质
粒 pDNR-LIB 中，转入 Escherichia coli strain DH5α。
在 cDNA 文库中，随机挑取单克隆，分别对每
个单克隆进行菌落 PCR。挑取单克隆加入到 25 μL
的 超 纯 水 中， 在 PTC-200 PCR 仪（MJ Research，
USA）上加热至 95℃裂解 5 min，制得裂解液。接
着 以 M13 引 物 对 用 于 检 测 pDNR-LIB 中 的 插 入 序
列（CreatorTM SMARTTM cDNA 文库构建试剂盒中提
供），即对以上裂解液进行 PCR 扩增反应。采用
PrimeStarTM HS DNA polymerase（TaKaRa 公 司， 大
连宝生物公司），反应条件为 ：94℃变性 5 min，40
轮循环的 94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 2 min，最后
72℃延伸 7 min。扩增产物以 1.2% 的琼脂糖凝胶电
泳检测，将片段长度大于 750 bp 的相应的单克隆挑
出进行液体培养，送华大基因完成测序。在随机测
序的序列中获得了 GjERF 序列。
为了获得 GjERF 基因的 ORF 序列，设计了以
下引物，5 端引物为 5-GGAATTCCATATGTGTGGA
GGTGCAATCATCGACG-3，含有 NdeI 酶切位点。 3
端 引 物 为 5-CCGACTCGAGTTAATACAGCAGATTAT
TAGGCTGCTGGGCT-3，含有 Xho I 酶切位点。将含
有目的基因的菌种加入含氯霉素抗性的 LB 培养液，
在 37℃，150 r/min 摇床培养过夜。接着以 4 000 r/min
离心菌液 5 min。挑取菌体沉淀加入到 50 μL 的超纯
水中，95℃裂解 5 min，制得裂解液。做菌落 PCR，
得到目的 DNA。PCR 反应条件为 94 ℃变性 5 min，
接 35 轮 循 环 的 94 ℃ 30 s，63.5 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5
min，最后 72℃延伸 7 min。扩增产物以 1.2% 的琼
脂糖凝胶电泳检测。
1.2.2 序 列 分 析 和 空 间 结 构 预 测 基 因 序 列 中
的 ORF 以及预测编码蛋白的保守域的搜索以 ORF
Finder（http ：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/） 和 BLAST
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第7期62
进行。多重序列比对以在线 ClustalW2（http ：//www.
ebi.ac.uk/clustalw/index.html）进行。进化分析以 Me-
ga 4 软件中的 neighbor-joining 算法完成。空间结构
预测以 SWISS-PDB 软件在线分析完成。
1.2.3 GjERF 基因的转录水平表达分析 分别取栀
子发育期Ⅰ和Ⅱ的果实及栀子的成熟叶片，3 种样
品按 1.2.1 方法提取总 RNA，以 Prime Script one step
RT-PCR 试剂盒（TaKaRa，大连宝生物公司），按试
剂盒说明书将 GjERF 的 mRNA 反转录为 cDNA。引
物为 ：正向 ：5-GCTTCCAAGCTCAGCCTTACTA-3，
反 向 ：5- AGATCATCCAGCATCCAGAGAC-3。RT-
PCR 的内标为栀子的 RPS25-1（核糖体小亚基的 25-1
蛋白，GenBank 登录号 GU797554），其扩增引物为 ：
正向 ：5- CAGAAGAAGAAGAAGTGGAGCAA-3，反
向 ：5- GTTCTTGAACCACTTGATGGTCT-3。扩增反
应进行二次，PCR 反应条件均为 ：94℃变性 5 min，
接 35 轮 循 环 的 94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，
最后 72℃延伸 10 min。
2 结果
2.1 栀子GjERF基因的克隆
从栀子果实 cDNA 文库中随机筛选获得栀子乙
烯反应元件结合蛋白 ERF 的 cDNA，命名为 GjERF，
GenBank 登录号为 HQ599862。该基因全长 962 bp，5
端非翻译区长 82 bp，3 端非翻译区长 100 bp，预测
ORF 为 780 bp，编码 259 个氨基酸，分子量为 28.6
kD，等电点为 6.764。GjERF 基因的 ORF 扩增结果
见图 1。
2.2 GjERF蛋白序列分析和空间结构预测
通 过 BLAST 分 析，GjERF 的 蛋 白 质 序 列 含
有 AP2/ERF 结构域，与多种植物的 ERF 相似。经
ClustalW2 比对和 MEGA4.0 分析，得到 GjERF 与 20
条在 BLAST 比对中与 GjERF 最相似的 ERF 的亲缘
关系图，见图 2。GjERF 与唇形超目唇形科的丹参
（Salvia miltiorrhiza）的 ERF 关系最近（序列相似度
50.57%），栀子和丹参同属唇形超目。GjERF 与金缕
梅超目山毛榉科的欧洲栗（Castanea sativa）的关系
较远（序列相似度 25.86%）。将 GjERF 与丹参、棉
花（Gossypium hirsutum）、 葡 萄（Vitis vinifera）、 番
茄（Solanum lycopersicum）的 ERF，以及来自拟南
芥（Arabidopsis thaliana）AtERF1 的 ERF 结构域（在
PDB 中的编号为 1GCC_A，序列范围 145-206）进
行 了 比 对， 序 列 相 似 度 分 别 为 50.57%、49.09%、
48.39%、44.09% 和 16.54% ；而 GjERF 的 AP2/ERF
结构域（序列范围 75-133）与这几种植物 ERF 的
AP2/ERF 结 构 域 的 相 似 度 则 在 68.25%-86.89% 范
围，而在此结构域中推测与 DNA 有相互作用的氨基
酸残基则在所有参比的 ERF 中完全相同，见图 3。
以 1GCC_A 为 模 板， 由 Swiss-model 预 测 的 GjERF
中 AP2/ERF 结构域的二级结构也在图中标出。按照
GjERF 的序列结构，其 N 端具有未知功能的 MC 结
M
2000
bp
1000
750
500
250
100
1
M ：DL2000 ；1 ：GjERF 的扩增片段
图 1 GjERF 的 ORF 扩增电泳图
Ghi: Gos sypium hirsutum AAX68525
Vvi: Vitis vinifera XP_002272426
Mdo: Malus x domestica ADE41108
Eja: Eriobotrya japonica AFG26326
Ade: Actinidia deliciosa ADJ67435
Ath: Arabidopsis thaliana BAA32418
Hal: Halimodendron halodendron ACM79120
Gja: Cardenia jasminoides AEF59493
Smi: Salvia miltiorrhiza ABR92333
Dca: Daucus carota BAF75652
Sly: Solanum lycopersicum AEZ64000
Phy: Petunia x hybrida ADP37420
Mtr: Medicago truncatula XP_003591474
Lja: Lotus japonicus BAG50065
Ahy: Arachis hypogaea AFU07641
Cme: Cucumis melo BAD01556
Rpa: Rumex palustris AEQ58797
Can: Coffea canephora AAS01337
Iba: Ipomoea batatas ABP35524
Gma: Glycine max NP_001238300
Csa: Castanea sativa AEF30544
0.05
棉花 Ghi ；葡萄 Vvi ；苹果 Mdo ；枇杷 Eja ；猕猴桃 Ade ；拟南芥 Ath ；铃铛
刺 Hai ；栀子 Gja ；丹参 Smi ；胡萝卜 Dca ；番茄 Sly ；矮牵牛 Phy ；截形苜
蓿 Mtr ；百脉根 Lja ；花生 Ahy ；甜瓜 Cme ；沼泽酸模 Rpa ；中粒咖啡 Can ；
甘薯 Iba ；大豆 Gma ；欧洲栗 Csa ；下同
图 2 GjERF 的聚类分析
2013年第7期 63高蓝等 ：栀子 ERF 基因的克隆及其在果实成熟过程中的表达
a ：沿着 α-螺旋轴方向的 ERF-DNA 复合物 ；b ：ERF-DNA 复合物 ；c ：预测的 GjERF ERF 结构域（Tyr75-Phe130）的空间结构 ；肽链以灰色 trace 模
式表示，3 段 β-折叠和一段 α-螺旋以 ribbon 模式表示
图 4 1GCC-A 中 ERF 结构域与 DNA 复合物的空间结构及预测的 GjERF 中 ERF 结构域的空间结构
Ca b c
N
strand 1
strand 2
strand 3 strand 3
strand 2
strand 1
strand 1 strand 3
strand 2
N
C
C
N
α helix
α helix α helix
complementary strand
coding stand
coding strandcomplementary strand
5˃ 5˃
5˃
5˃
构域（MCGGAII），因为这个显著特征，将其划分为
ERF 因子中的第Ⅶ类。
以来自拟南芥的 AtE-RF1 的 ERF 结构域（序列
范围 145-206）与 DNA 的 GCC 盒双链的复合物（即
1GCC_A）为模板，该复合物中的 DNA 编码链序列
为 ：5-GCTAGCCGCCAGC-3， 划 线 序 列 为 GCC 盒
核心序列，另一条为互补链。1GCC_A 的蛋白序列
与 GjERF 的 ERF 结构域（序列范围 75-133）的相
似度为 75.44%，由该复合物作为模板预测的 GjERF
的 ERF 结构域的 3D 结构，见图 4。
在 1GCC_A 结构中，拟南芥的 ERF 结构域与
GCC 盒通过 3 个 β 折叠在 DNA 的大沟处相互作用。
从 N 到 C 端方向的第二个 β-折叠几乎与 α-螺旋平行，
也与 DNA 编码链的 5 到 3 方向平行。主要涉及的
作用有，结构域中的精氨酸的胍基与 GCC 盒中的鸟
嘌呤经氢键互相作用，而精氨酸的骨架结构则与嘧
Gja
Smi
Ghi
Vvi
Sly
1GCC_A
82
98
117
116
118
30
219
190
218
216
223
63
259
232
256
259
254
Gja
Smi
Ghi
Vvi
Sly
1GCC_A
sss hhhhhhhhhhhhhhhh
ssss s s ss sssss s s sss
:
Gja
Smi
Ghi
Vvi
Sly


       
黑色下划线为 ERF 结构域 ；“·”为高度保守的 MC 结构域 ；“*”为 ERF 结构域中与 GCC 盒相互作用的氨基酸残基 ；S 和 h 分别代表 β-折叠和 α-螺旋结构
图 3 GjERF 与 5 个 ERF 的序列对比
啶碱基有疏水性相互作用。色氨酸与嘌呤碱基有疏
水性相互作用。这些精氨酸和色氨酸残基除与碱基
作用外，还与糖磷酸骨架有疏水性相互作用。DNA
分子则在大沟的 CG 碱基对有约 20℃的弯曲，有利
于蛋白质与 DNA 之间的相互作用。预测的 GjERF
的空间结构与 1GCC_A 相似。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第7期64
2.3 GjERF基因在果实发育过程中的表达
GjERF 在栀子成熟叶片，发育期Ⅰ和Ⅱ的果
实中的转录水平的表达，见图 5。以特异引物扩增
cDNA，以栀子 RPS25-1 作为内标。可看到，GjERF
在叶片中的表达水平比在果实中高，随着果实的发
育过程，GjERF 转录水平的表达维持不变。
VvERF057、VvERF058 和 VvERF059 在葡萄由转熟
期到全熟期的表达没有任何变化，而第Ⅸ类的两个
ERF 转录因子 VvERF078 和 085 则与几丁质酶，β-1，
3-葡聚糖酶和甜蛋白随葡萄果实的发育过程同步表
达［24］。对甜瓜品种河套蜜瓜果实中的第Ⅶ类 ERF
因子 CMeERF2 的表达的研究发现，随着果实的发育
成熟过程及乙烯含量的增加而逐渐增加，在受粉后
38 d 内其转录水平较低，乙烯含量较少 ；在受粉后
40 d 时，果实内源乙烯含量达到峰值，其转录水平
也达到峰值 ；在受粉后 45 d 之后，随着果实内源乙
烯水平的下降，其转录水平也下降。同时，也发现
不属于第Ⅶ类 ERF 因子的 CMeERF1 的表达也有类
似的规律［25］。所以第Ⅶ类 ERF 因子与果实的发育
过程的关系也是复杂的，有时并不相关，而其它亚
类的 ERF 因子也有可能与果实的发育成熟过程有关。
本研究获得的 GjERF 基因在栀子叶片中的表达强于
在果实中的表达，并不随果实的发育而增强，显示
其表达与果实的发育无关并具有组织特异性。随着
对植物 AP2/ERF 转录因子基因的克隆及基因的表达
和功能的研究，将更有助于对植物的抗逆机制和生
长发育的调控机理的深入了解。这是首次在栀子中
分离 ERF 类转录因子及考察其在不同组织和发育时
期表达的报道。
4 结论
克隆了栀子的 GjERF 基因，该基因预测编码第
Ⅶ类 ERF 转录因子。该转录因子的 ERF 结构域预
测可与顺式作用元件 GCC 盒发生相互作用。GjERF
在栀子叶中的转录水平的表达强于在果实中的表达，
并不随果实的发育而改变其表达水平。
参 考 文 献
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［3］ Zhou J, Tang X, Martin GB. The Pto kinase conferring resistance to
图 5 GjERP 在叶片和果实两个发育时期（Ⅰ和Ⅱ）转录
水平的表达
Leaves Fruits I Fruits II
GjERP
RPS25-1
3 讨论
ERF 类转录因子作为 AP2/ERF 类转录因子中的
一类，参与植物多种基因的表达从而调节植物的生
长发育和对乙烯、生物和非生物性胁迫的反应。按
照其蛋白质一级结构上的特点，有几种分类方法将
ERF 类转录因子进一步分类［11，12，18，19］。其中 Nak-
ano 等［12］将拟南芥的 122 个 ERF 蛋白分为 12 族，
包 括Ⅰ-Ⅴ，Ⅵ-Ⅹ，Ⅵ-L 和 Xb-L。 其 中 第 Ⅶ 类
ERF 类转录因子在其蛋白序列 N 端具有 MC 结构域。
在对第Ⅶ类 ERF 的研究中发现其在植物不同
组织中的表达往往不同，并有多个 ERF 参与果实
的成熟和衰老过程［20］。如番茄的 LeERF2 属于第Ⅶ
类，它可被乙烯诱导，随果实的成熟转录水平的表
达增加，在成熟抑制的番茄突变体 Nr（Never-ripe），
nor（non-ripening）和 rin（ripening inhibitor）中几乎
不表达［20］。苹果（Malus domestica）的 MdERF1 主
要在成熟果实中表达，在其它组织中很少表达［21］。
从 李（Prunus salicina） 中 分 离 得 到 的 PsERF2a 和
PsERF2b 随果实的发育过程的表达则没有呈现递增
或递减的规律，而是在花中高水平表达［22］。在猕
猴桃（Actinidia deliciosa）中，AdERF4，AdERF5 和
AdERF6 的表达则是 AdERF4、AdERF 6 随果实的发
育成熟表达逐渐下降。另外，AdERF4 在叶中的表
达仅次于果实发育初期的水平 ；AdERF5 的表达水
平在所有组织和果实发育过程中均很低，相对的在
花和成熟果实中有少量表达［23］。葡萄中的第Ⅶ类的
2013年第7期 65高蓝等 ：栀子 ERF 基因的克隆及其在果实成熟过程中的表达
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（责任编辑 狄艳红）