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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2016, 32(1):74-79
苹果树腐烂病、梨枝枯病、杨树溃疡病等枝干
皮层病害严重影响树木的生长，甚至导致植株的死
亡。目前对此类病害的防治以施用化学药剂为主，
但该方法易引发农药残留、环境污染、病原物产生
抗药性等问题。20 世纪 80 年代，微生态防治在植
物病害防治中兴起［1］。植物微生态学是研究植物
内微生物的组成、功能、演替、微生物互作及其与
寄主间相互关系的生命分支。以往人们采用纯培养
技术研究微生物的种群结构，但环境中大多数微生
物处于存活但不能培养的状态［2］。Illumina 公司的
收稿日期 ：2015-03-24
基金项目 ：国家自然科学基金项目（31101476，31171796），陕西省科学技术研究发展计划项目（2013K01-45），杨凌示范区科技计划项目
（2014NY-41），果树腐烂病防控技术研究与示范项目（201203034）
作者简介 ：赵玲云，女，硕士研究生，研究方向 ：微生物资源与利用 ；E-mail ：hebeizhaolingyun@163.com
通讯作者 ：颜霞，女，博士，副教授，研究方向 ：微生物资源与利用 ；E-mail ：yanxia@nwsuaf.edu.cn
黄丽丽，女，教授，研究方向 ：果树病害综合治理 ；E-mail ：huanglili@nwsuaf.edu.cn
枝干树皮宏基因组 DNA 的提取
赵玲云1，3  范东颖1，3  李燕芳1，3  颜霞1，3  黄丽丽2，3
（1. 西北农林科技大学生命科学学院，杨凌 712100 ；2. 西北农林科技大学植物保护学院，杨凌 712100 ；
3. 旱区作物逆境生物学国家重点实验室，杨凌 712100）
摘 要 ： 旨在得到一种适用于提取多种枝干树皮的高质量 DNA 的方法。参考前人提取植物 DNA 的经验，综合了研磨时
加 PVP、缓冲液洗涤、SDS 与 CTAB 结合使用、高浓度 KAc 低温冻融、高浓度 NaCl 条件下异丙醇沉淀、DNA 完全溶解后加微量
RNase A 处理等操作，所得 5 种基因组 DNA 浓度介于 190-970 ng/μL，纯度都很高，皆能被限制性内切酶切割，都可用作模板扩增
到细菌 16S rRNA 基因片段，以苹果树皮 DNA 为模板扩增到苹果 BIP 和 PDI 基因且苹果树皮基因组 DNA 经测序公司检测，质量
满足高通量测序法研究微生物多样性对环境宏基因组的要求。
关键词 ： 枝干树皮 ；DNA 提取 ；KAc ；RNase A ；高通量测序
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.01.018
The Extraction of Metagenom DNA in Branch Bark
ZHAO Ling-yun1，3 FAN Dong-ying1，3 LI Yan-fang1，3 YAN Xia1，3 HUANG Li-li2，3
（1. College of Life Sciences，Northwest A&F University，Yangling 712100 ；2. College of Plant Protection，Northwest A&F University，
Yangling 712100 ；3. State Key Laboratory of Crop Stress Biology for Arid Areas，Yangling 712100）
Abstract: A suitable method capable of extracting high-quality metagenom DNA from a variety of branch barks was developed based
on previous experiences of plant DNA extraction. The method consisted of several steps ：adding PVP while grinding materials, washing bark
powder with buffer Ⅰ , simultaneously using SDS and CTAB, low-temperature frozen and then melting samples after adding high concentration
of potassium acetate（KAc）, precipitating DNA using isopropanol under high concentration of NaCl, and adding trace RNase A after DNA
completely dissolved. Finally, the concentrations of genomic DNA obtained by this method ranged from 190 to 970 ng/μL with all in high purity.
All DNA can be digested by restriction endonuclease and used as templates for bacterial 16S rRNA gene amplification. The DNA of apple bark
as the template was amplified into gene BIP and PDI, then the genome DNA of apple bark was detected by a sequencing firm, and the quality
satisfied the requirements of environmental metagenome for studying microbial diversity by high-throughput sequencing.
Key words: branch bark ；DNA extraction ；KAc ；RNase A ；high-throughput sequencing
2016,32(1) 75赵玲云等：枝干树皮宏基因组 DNA的提取
MiSeq、Roche 公司的 454 等第二代测序技术直接提
取微生物环境宏基因组 DNA，扩增微生物保守区域
内的序列可变区进行高通量测序、比对、分析，为
研究环境微生物组成提供了新的手段［3］。例如 Sun
等［4］利用 16S rDNA V1-V3 区高通量测序技术研究
施用生防菌 Phlebiopsis gigantea 后挪威云杉树桩内
细菌群落的变化。若要使用高通量测序技术研究树
皮内微生物组成，进而借助微生态理论防治枝干皮
层病害，提取高质量的树皮宏基因组 DNA 是首要任
务。另外，以植物树皮为材料提取遗传物质，可以
降低空间和季节等因素对取样的限制，为植物分子
生物学研究提供便利条件。
目前人们已成功地从植物叶片、果实等材料中
提取出 DNA［5，6］。植物 DNA 的提取方法有很多，
传统的方法有 CTAB 法和 SDS 法，国内外生物公司
还开发了多种商品化的植物 DNA 提取试剂盒，但由
于不同植物中次生代谢产物的种类和含量差异很大，
有时同种植物不同器官或组织的次生代谢产物的种
类和含量也不一样，使得针对某种材料优化的 DNA
提取方法不一定适用于其它材料［7］。枝干树皮组织
厚且硬，富含多糖、多酚、单宁、色素及其他次生
代谢物质，用简易 CTAB 法分离出的 DNA 因多酚氧
化而呈褐色，多糖、单宁等物质与 DNA 结合成黏
稠的胶状物，用改良的 CTAB 法［8，9］、常用的 SDS-
CTAB 结合法［10-12］以及天根植物 DNA 提取试剂盒
也不能避免多糖与核酸共沉淀，提取的基因组 DNA
纯度低，不能进行稳定的 PCR 扩增和限制性酶切反
应。因此本研究继续尝试整合多步除杂步骤，旨在
得到一种适合提取多种枝干树皮高质量 DNA 的方
法，为应用高通量测序技术研究树皮内微生物组成
和其他植物分子生物学研究提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
试验样品 ：苹果树皮、杨树树皮、梨树树皮、
柳树树皮和枣树树皮采自西北农林科技大学经济树
木园和周边村落。样品采集后 4 h 内经液氮冷冻后
贮存于 -80℃冰箱。
仪 器 ：Thermo 702 超 低 温 冰 箱， 海 门 其 林 贝
尔 QL-901 漩 涡 混 合 器， 精 宏 XMTE 8112 水 浴 锅，
Eppendorf 5810R 高速冷冻离心机，Thermo NanoDrop
2000 分 光 光 度 计，Bio-Rad S1000TM Thermalcycler
PCR 仪，JUNYI JY600c 电 泳 仪，Gene Genius Bio-
imaging System 凝胶成像系统。
试 剂 ：PCR buffer、MgCl2 和 dNTPs 等 PCR 反
应试剂购自 TaKaRa，Taq DNA 聚合酶、限制性内
切酶 Hind Ⅲ、限制性内切酶 EcoR Ⅰ等购自 Thermo
scientific，2×Es Taq MasterMix、RNase A 购自康为
世纪，16S 引物由北京华大基因合成，引物 MdPDIF、
MdPDIR、MdBipF、MdBipR 由 Invitrogen 公司合成，
DNA Marker 购自 Vazyme，其他化学试剂为国产分
析纯。
缓冲液 Buffer Ⅰ：200 mmol/L Tris-HCl（pH8.0），
50 mmol/L EDTA（pH8.0），250 mmol/L NaCl，0.5% β-
巯基乙醇。
2% SDS 缓 冲 液 ：2% SDS，2% PVP，1 mol/L
NaCl，100 mmol/L Tris-HCl（pH8.0），50 mmol/L
EDTA（pH8.0）。
2% CTAB 缓冲液 ：2% CTA，2% PVP，1.4 mol/L
NaCl，100 mmol/L Tris-HCl（pH8.0），20 mmol/L
EDTA（pH8.0）。
1.2 方法
1.2.1 树皮宏基因组 DNA 的提取 实验首先以苹果
树皮为材料，主要参考文献［7-12］探索适合苹果
枝干树皮 DNA 的提取方法，之后用得到的方法提取
杨树、梨树、柳树、枣树树皮宏基因组 DNA，观察
该法通用性。具体步骤为 ：（1）取约 1 g 于 -80℃保
存的苹果树皮和 0.1 g PVP 放入预冷的研钵中，加液
氮用研杵碾压样品，待剩余少量液氮时快速用力研
磨，重复研磨 3-4 次，将适量彻底研碎的细粉迅速
转移至 2 mL 离心管（管中体积约 1 mL），加入 1.5
mL Buffer Ⅰ涡旋混匀后冰浴 10 min，期间不时摇
匀。（2）4℃，5 000×g 离心 10 min，弃上清，沉淀
中加入 700 μL 65℃预热的 2% SDS 缓冲液和 100 μL
β-巯基乙醇混匀，65℃水浴 1 h。（3）加入 300 μL 5
mol/L KAC（pH6.0），混匀后 -20℃放置 1 h。（4）4℃，
12 000×g 离心 10 min，取上清，加入 1/5 体积 65℃
预热的 2% CTAB 缓冲液，混匀，65℃水浴 40 min。（5）
冷却至室温，加入 1/2 体积酚∶氯仿∶异戊醇抽提 2
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次，每次 5 min。（6）4℃，12 000×g 离心 10 min，
取上清，加入 1/2 体积 5 mol/L NaCl 和等体积异丙醇，
混 匀 后 -20℃ 放 置 4 h。（7）4℃，12 000×g 离 心
10 min，弃上清，70% 乙醇洗涤沉淀两次，每次 10
min，过夜风干沉淀，加 100 μL 灭菌水，37℃水浴
2 h 溶 解 DNA 后 加 入 0.5 μL RNase A（10 mg/mL），
37℃过夜，最后置 4℃冰箱备用，若长期保存应放
于 -80℃。
1.2.2 DNA 质量检测
1.2.2.1 DNA 产量和质量分析 分别取 1 μL 苹果
树、杨树、梨树、柳树和枣树树皮 DNA，用 Thermo
NanoDrop 2000 分光光度计测定各样本 DNA 的浓度
及 A260/A280 和 A260/A230 值。
1.2.2.2 琼脂糖凝胶电泳检测各样本 DNA 质量 取
8 μL DNA 样品与 1 μL 10×loading buffer 混合，90 V
电压下 1% 琼脂糖凝胶中电泳 50 min，溴化乙锭染
色，Gene Genius Bio-imaging System 凝胶成像系统中
观察并拍照。
1.2.2.3 DNA 限制性内切酶酶切 选择限制性内切
酶 Hind Ⅲ和 EcoR Ⅰ分别酶切 5 种树皮 DNA。采用
10 μL 反应体系，其中 DNA 样品 2.5 μL，限制性内
切酶 1 μL，10×buffer 1 μL，灭菌水 5.5 μL。37℃放
置 2 h，90 V 电压下 1% 琼脂糖凝胶中电泳检测酶切
情况。
1.2.2.4 PCR 扩 增 树 皮 内 细 菌 16S rRNA 基 因 序
列 分别以 5 种树皮 DNA 为模板，用 16S 通用引物
27F ：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ；1492R ：
5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3 扩增苹果树、杨树、
梨树、柳树、枣树树皮环境中细菌的 16S rRNA 基
因。扩增体系为 25 μL，其中 10×PCR Buffer 2.5 μL，
25 mmol/L MgCl2 2 μL，10 μmol/L 引物各 0.5 μL，2.5
mmol/L dNTP 0.4 μL，5 U/μL Taq 酶 0.2 μL，灭菌水
18.4 μL，模板 DNA 0.5 μL。所用 PCR 扩增程序为 ：
95℃预变性 10 min ；95℃变性 30 s，55℃退火 30 s，
72℃延伸 90 s，34 个循环 ；最后 72℃延伸 10 min。
取 8 μL PCR 产物与 1 μL 10×loading buffer 混合，90
V 电压下 1% 琼脂糖凝胶中电泳检测扩增情况。
1.2.2.5 PCR 扩增苹果基因 以苹果树皮 DNA 为模
板，用两对引物 MdBipF ：5-ACACCATGGCTGGCT-
CTTG-3 ；MdBipR ：5-TTAAAGCTCGTCATGCGAC-
TC-3 和 MdPDIF ：5-TATGGCGTCGTCTTCTAGGGT
-3 ；MdPDIR ：5-CGTTAGAGGCTCCATCCTTTCCG-3
分别扩增苹果 Bip 和 PDI 基因，扩增体系为 25 μL，
其 中 2×Es Taq MasterMix 12.5 μL， 灭 菌 水 12 μL，
模板 DNA 0.5 μL。所用扩增程序同 1.2.2.4，取 5 μL
PCR 产物，90 V 电压下 1% 琼脂糖凝胶中电泳检测
扩增情况。
1.2.2.6 测序公司检验苹果树皮宏基因组 DNA 质量
将 6 份苹果树皮宏基因组 DNA 送北京诺禾致源公
司，经电泳检测合格后，以该 DNA 为模板扩增树皮
环境中细菌 16S 高变区，判断 DNA 质量是否满足后
续建库测序需求。
2 结果
2.1 DNA浓度及纯度测定
用分光光度计测定 DNA 的浓度和纯度，高纯
度 DNA 的 A260/A280 比值应在 1.8-2.0 之间，A260/A230
的数值处于 2.0 左右时，表明小分子盐离子、色素、
多糖或醇等杂质含量较少。表 1 显示，5 种植物树
皮的宏基因组 DNA 产量满足常规实验需求，且纯度
很高。
表 1 五种树皮 DNA 的浓度及纯度值
树皮材料 浓度 /（ng·μL-1） A260/A280 A260/A230
苹果树 968.2 1.99 2.29
杨树 197.5 1.91 2.03
梨树 211.1 1.92 1.94
柳树 556.4 1.98 2.16
枣树 920.6 2.04 2.29
2.2 DNA电泳检测
琼脂糖凝胶电泳（图 1）显示，5 种树皮 DNA
各显示出一条高分子量条带，点样孔较干净，均无
明显的拖尾现象，说明 5 种 DNA 都相对完整，多糖
等杂质去除干净，DNA 稳定无降解。
2.3 限制性内切酶酶切结果
图 2 显示，5 种 DNA 都能被 Hind Ⅲ和 EcoR Ⅰ
识别并在 2 h 内切割完全。说明所提 DNA 纯度高，
抑制内切酶活性的多糖等杂质含量很少。
2016,32(1) 77赵玲云等：枝干树皮宏基因组 DNA的提取
2.4 树皮内细菌16S rRNA基因和苹果基因PCR扩
增产物检测结果
以 5 种树皮 DNA 为模板，用 16S 引物扩增细菌
16S rRNA 基因 PCR 产物电泳及以苹果树皮 DNA 为
模板扩增 Bip 和 PDI 基因，结果（图 3）显示，所
有扩增产物主条带明亮清晰，16S rRNA 基因大小为
1 500 bp 左右，Bip 和 PDI 基因 3 000 bp 以上，符合
相应片段特征。此项结果进一步证明该方法提取到
高质量的树皮宏基因组 DNA。
2.5 测序公司检验苹果树皮DNA质量
经检测，本研究方法提取到的苹果树皮宏基因
组 DNA 电泳条带整齐明亮，送样过程中略有降解，
以此 DNA 为模板扩增到的 16S rRNA 基因 V4+V5 高
变区序列为 A 级，即 PCR 产物目的条带单一（图
4），大小正确，总量满足两次或者两次以上建库需
要。综合各项指标确定该宏基因组 DNA 质量合格，
可不经 PCR 扩增而直接用于后续建库测序。
M 1 2 3 4 5
10
kb
M ：1 kb DNA Marker ；1-5 ：依次为苹果树、杨树、梨树、柳树和枣树树皮
DNA
图 1 五种树皮基因组 DNA 电泳图
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1-5：依次为苹果树、杨树、梨树、柳树和枣树树皮 DNA Hind Ⅲ酶切图；6-10：
依次为苹果树、杨树、梨树、柳树及枣树树皮 DNA EcoR Ⅰ酶切图
图 2 五种树皮基因组 DNA 限制性内切酶酶切图谱
M1A B1 2 3 4 5 6
1500
bp
M2 7 8
3000
bp
M1 ：2 000 bp DNA Marker ；1 ：以水为模板的扩增产物 ；2-6 ：依次为以苹
果树、杨树、梨树、柳树及枣树树皮 DNA 为模板的 16S rRNA 基因扩增产物；
M2 ：1 kb DNA Marker ；7 ：Bip 基因 ；8 ：PDI 基因
图 3 五种树皮内细菌 16S rRNA 基因（A）及苹果 Bip 和
PDI 基因扩增产物（B）电泳图
M 1 2 3 4 5 6
M ：100 bp DNA Marker ；1-6 ：苹果树皮内细菌 V4+V5 区 PCR 产物，
上样 3 μL
图 4 苹果树皮内细菌 16S rRNA 基因 V4+V5 区 PCR 产物
电泳图
3 讨论
提取高质量的枝干树皮宏基因组 DNA 是应用高
通量测序技术研究树皮内微生物组成，进而借助微
生态理论防治枝干皮层病害的前提，以树皮为材料
提取遗传物质还可以使取样免受空间和季节等因素
的限制，为限制性酶切、PCR 扩增等植物分子生物
学研究提供便利。从当前发表的植物 DNA 提取文献
看，各种方法的建立大多基于 CTAB 和 SDS 两种提
取技术之上，但由于提取对象、缓冲液成分及提取
步骤的差异，使得 DNA 提取效果不尽相同［13］。顽
拗型枝干树皮材料厚且硬，富含干扰 DNA 提取的次
级代谢产物，需要更完善的提取操作才能得到质量
合格的 DNA。
研磨好的材料中加入洗涤液 Buffer Ⅰ，洗去了
大量色素等杂质，减轻后续除杂过程的负担。为了
去除植物中的酚类物质，防止其氧化变褐后与核酸
不可逆结合，普遍是在研磨时或提取液中加入适量
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.178
的高分子螯合剂 PVP 和抗氧化剂 β-巯基乙醇，也可
以用 TCEP、抗坏血酸、硼砂等试剂抑制氧化反应，
避免 DNA 褐化［14］。适当地提高 β-巯基乙醇的量还
能有效去除多糖等次生物质［15］。SDS 在高温（55-
65℃）条件下能裂解细胞，同时与蛋白质和多糖结
合成复合物，释放出核酸，之后加入高浓度 KAc 或
NH4Ac 低温放置，使形成的复合物转变为溶解度
更小的钾盐形式，沉淀更加完全，离心后除去［16］。
CTAB 能与核酸形成复合物，此复合物在高盐（>0.7
mol/L）浓度下可溶，并稳定存在，经过酚∶氯仿∶
异戊醇（25∶24∶1）抽提去除蛋白质、多糖、色素
等杂质，最后用异丙醇或乙醇将 DNA 沉淀出来，离
心弃上清后，CTAB-核酸复合物再用 70% 酒精浸泡
可洗脱掉 CTAB［17，18］。
植物组织往往富含多糖，多糖污染是提取植物
DNA 时遇到的最棘手的问题。多糖的许多理化性质
与 DNA 很相似，所以很难将它们分开。Dellaporta
等［19］ 认 为 加 入 高 浓 度 的 KAc 有 利 于 除 去 多 糖 ；
Fang 等［20，21］ 认为在 1.0-2.5 mol/L NaCl 的高盐 TE
中，用无水乙醇沉淀 DNA 能除去多糖。
以往在提取植物 DNA 时，大多选用植物叶片等
材料，选取以上操作的几个方面即可满足植物分子
生物学的要求［5，7，9，18，21］。本研究的目的是得到适
用于高通量测序的枝干树皮宏基因组 DNA，对 DNA
质量要求较高，又因枝干树皮属顽拗型植物材料，
实验综合多步抑制多酚氧化、除蛋白、除多糖等处理，
才得到质量合格的基因组 DNA 且该 DNA 适用于普
通植物分子生物学研究。研究中发现，略去 DNA 提
取过程中洗涤、加 KAc -20℃放置、加 CTAB 65℃水
浴、沉淀时加 NaCl、DNA 完全溶解后加 RNase A 中
的任何一步操作，都会影响 DNA 的质量和稳定性，
其中 KAc 和 RNase A 处理是至关重要的两个步骤，
分别对所提 DNA 的纯度和稳定性起着决定性的作
用。使用本实验方法提取 5 种树皮 DNA，产量差异
较大，可能与植物本身特性有关。
4 结论
本研究得到一种适合多种枝干树皮基因组 DNA
的提取方法，该法操作简单，所用试剂廉价易得，
仪器常见，所得 5 种树皮 DNA 完整性好，纯度高，
苹果树皮 DNA 满足高通量测序法研究微生物多样性
对环境宏基因组 DNA 的要求。经 PCR 扩增苹果基
因和 5 种树皮内细菌 16S rRNA 基因及酶切实验验证，
此方法得到的 DNA 也适用于植物分子生物学研究。
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（责任编辑 马鑫）