全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 8期
HBV前 S1蛋白与 HepG2细胞膜蛋白结合位点鉴定
丁岗强　张君　杨凤　杨健　唐霓　黄爱龙
(重庆医科大学感染性疾病分子生物学教育部重点实验室 ,重庆 400016)
　　摘 　要 : 　为鉴定 HepG2细胞膜蛋白识别 HBV包膜蛋白 p reS1区的位点。通过删除突变的方法构建 p reS1的不同区域片
段与 GST融合的重组表达质粒 ,将表达质粒转入 E. coli BL21菌株中原核表达 ,以生物素标记 HepG2细胞膜蛋白 , pull down试
验分析 HepG2细胞膜蛋白识别 p reS1的位点。结果表明 , 21～33位氨基酸是 HepG2细胞膜蛋白识别 p reS1的主要位点。通过
对 HepG2细胞膜蛋白与 p reS1结合的位点的分析 ,为进一步研究 p reS1在 HBV早期感染中的作用和 HBV包膜蛋白受体打下
基础。
关键词 : 　乙型肝炎病毒 　包膜蛋白 　前 S1蛋白 　识别位点
Attachment Site of Hepatitis B Virus PreS1 Doma in
for Prote in on HepG2 M embrane
D ing Gangqiang　Zhang Jun　Yang Feng　Yang J ian　Tang N i　Huang A ilong
( Key Laboratory of M olecular B iology of Infectious D isease, Chongqing University of M edical Science, Chongqing 400016)
　　Abs trac t: 　Deleted segments of p reS1 were recombined with GST tags and exp ressed in p rokaryotic exp ressing system. GST pull2
down assay was emp loyed to identify which segments is essential for the binding of p reS1 to p rotein on HepG2 membrane, using the p re2
cleared lysate of biotinylated HepG2 cells as a source of ligands. The results showed that am ino acid residues 21～33 was essential for
the binding of p reS1 to p rotein on HepG2 membrane.
Key wo rds: 　Hepatitis B virus　Envelope p rotein　p reS1 domain　A ttachment site
收稿日期 : 2009204203
基金项目 :国家青年科学基金项目 (30700707)
作者简介 :丁岗强 (19762) ,男 ,博士研究生 ,从事病毒分子生物学研究 ; E2mail: dgangqiang@ gmail. com
通讯作者 :黄爱龙 ,教授 ,博士生导师 ; Tel: 023268485230, E2mail: ahuang@cqu. edu. cn　　HBV包膜蛋白 p reS1区在 HBV早期感染过程中起着重要作用 ,本实验室在前期研究中 ,用 pulldown试验和免疫共沉淀试验分离到大小为 110 kD左右的 HepG2细胞膜蛋白 (p110) ,该蛋白特异黏附HBV p reS1,并与以前发现的任何一种可能的 HBV受体不同。通过删除突变的方法分段原核表达p reS1的不同区域片段 ,用 pull downy试验分析 p110识别 p reS1的位点 ,并通过结合阻止试验进行验证 ,首次证实了 21～33位氨基酸是 p110识别 p reS1的主要作用位点 ,为后续研究 p reS1在 HBV早期感染中的作用和包膜蛋白受体打下基础。1　材料与方法1. 1　p reS1删除突变体重组质粒的构建PCR引物及各片段的正反义链如下 : p reS1 N端 (1～61 aa)上游引物 5′2ATGGGATC2CACATGGGAGGTTGGTCA23′,下游引物 5′2ACGAA2GCTTTCCCACTCCTACCTGGT23′;p reS1 C端 (50～119 aa)上游引物 5′2ATCGGA2TCCAGACCACTGGCCAGCA23′, 下游引物 5′2ATC2AAGCTTGGCCTGAGGATGACT23′;1～44 aa上游引物 5′2ATGGGATCCACATGG2GAGGTTGGTCA23′,下游引物 5′2GCGAAGCTTGTC2CCAATCTGGATTGTT23′;20～61 aa上游引物 5′G2CCGGATCCACCCTCT2GGGATTCTTTC23′, 下游引物 5′2ACGAAGCTTTC2CCACTCCTACCTGGT23′;21～47 aa上游引物 5′2ATTGGATCCGCCCTCT2GGGATTCTTT23′,下游引物 5′2GCGAAGCTTGGGGT2
2009年第 8期 丁岗强等 : HBV前 S1蛋白与 HepG2细胞膜蛋白结合位点鉴定
TGAAGTCC23′;
11 ～ 21 aa 正义链 5′2GATCCGCGGCATGGG2
GACGAATCTTTCTGTTCCCAACCCTA23′,反义链 5′2
AGCTTAGGGTTGGGAACAGAAAGATTCGTCCCCAT2
GCC23′;
16～27 aa正义链 5′2GATCCGCCTTTCTGTTC2
CCAACCCTCTGGGATTCTTTCCCGAT23′,反义链 5′2
AGCTATCGGGAAAGAATCCCAGAGGGTTGGGAAC2
AGAAAG23′;
21～33 aa正义链 5′2GATCCGCCCTCTGGGAT2
TCTTTCCCGATCATCAGTTGGACCCTGCA23′, 反 义
链 5′2AGCTTGCAGGGTCCAACTGATGATCGGGAAA2
GAATCCCAGAGG23′;
31～47 aa正义链 5′2GATCCGCCCTGCATTCG2
GAGCCAACTCAAACAATCCAGATTGGGACTTCAAC2
CCC23′, 反 义 链 5′2AGCTGGGGTTGAAGTCCCAA2
TCTGGATTGTTTGAGTTGGCTCCGAATGCAGG23′;
41～53 aa 正义链 5′2GATCCGCCCAGATTGG2
GACTTCAACCCCATCAAGGACCACTGGCCA23′, 反
义链 5′2AGCTTGGCCAGTGGTCCTTGATGGGGTTGA2
AGTCCCAATCTGG23′。
其中分别引入 B am HⅠ和 H indⅢ酶切位点。以
含双拷贝 HBV adw2亚型基因全序列的质粒 pEcob6
(本实验室保存 )为模板 PCR扩增 p reS1 N端、C端、
1～44 aa、20～61 aa、21～47 aa片段 , PCR 条件 :
94℃预变性 5 m in; 94℃变性 10 s, 62℃退火 10 s,
72℃延伸 15 s, 35个循环 ; 72℃延伸 5 m in。凝胶电
泳鉴定扩增片段大小与预期相符后 ,用 Omega纯化
试剂盒纯化 PCR 产物。B am H Ⅰ和 H indⅢ (购自
TaKaRa公司 )双酶切后再次纯化得到各目的片段 ,
以 T4 DNA连接酶 (购自 Promega公司 )与经同样双
酶切的原核表达载体 pGST2MOLUC (由芝加哥大学
何通川教授馈赠 )连接。连接产物转化 E. coli JM109
菌株 (本实验室保存 ) ,挑取阳性克隆提取质粒进行
双酶切鉴定。p reS1 11 ～21 aa、16 ～27 aa、21 ～
33 aa、31～47 aa、41～53 aa片段各正、反义链溶于
退火缓冲液 ( 200 mM NaCl, 10 mM Tris, 1 mM
EDTA, pH7. 5～8. 0)至终浓度 100 mM , 95℃ 5 m in
后缓慢冷却至室温 ,退火片段纯化后进行双酶切 ,与
经同样双酶切的 pGST2MOLUC连接。各连接产物
转化 E. coli JM109菌株 ,采用载体测序通用引物直
接菌落 PCR扩增鉴定阳性克隆。
112　重组融合蛋白的表达纯化
将鉴定正确的重组表达质粒转化 E. coli BL21
(DE3)菌株 (本实验室保存 ) , 37℃下 1 mM IPTG诱
导表达 4 h, 10 000 r/m in冷冻离心 10 m in收集菌体
后超声破菌 ,破菌液 15 000 r/m in冷冻离心 20 m in
×2次 ,收集上清加入 400μl预先用 PBS平衡的
Glutathione2Sepharose24B (购自 Pierce公司 ,临用前
以 20倍柱体积的 PBS洗涤 2次 ,并用 PBS重悬制
备成 50%匀浆 ) , 4℃轻摇孵育 1 h后加入层析柱 ,
PBS充分洗涤层析柱后用洗脱液 (10 mM还原型谷
胱甘肽 , 50 mM Tris2HCl, pH8. 0)洗脱融合蛋白 , 4℃
下 200倍体积的 PBS透析纯化融合蛋白过夜 , BCA
试剂盒 (购自 Pierce公司 )测定蛋白浓度。
113　HepG2细胞的生物素标记与裂解
HepG2细胞 (购于上海细胞所 )用 MEM ( 10%
HyClone血清 )培养 ,胰酶 2EDTA消化生长状态良好
的细胞 , 800 r/m in离心 5 m in去除死细胞 ,预冷 PBS
洗涤细胞 3次 ,每 2. 5 ×107 细胞用 1 m l预冷 PBS
重悬后加入 1 m l生物素 (购自 Pierce公司 ) , 800
r/m in离心 5 m in,弃生物素溶液 ,用预冷含 100 mM甘
氨酸的 PBS洗涤细胞沉淀 3次以去除残留在细胞间
的生物素和死细胞。将生物素标记的每 2. 5 ×107 细
胞沉淀用 1. 5 m l细胞裂解液 (50 mM Tris, 300 mM
NaCl, 1%NP240, 0. 5%DOC, 0. 1% SDS, pH7. 4;用前加
入 10μl蛋白酶抑制剂混合物 ) 4℃裂解 30 m in后
12 000冷冻离心 15 m in,收集上清 , BCA法测定总
蛋白浓度。
114　Pull down试验分析 p110识别 p reS1的位点
取 2 mg总蛋白量的细胞裂解液 ,加入纯化的
GST蛋白 (本实验室制备 ) 80μg, 4℃轻摇孵育 4 h;
加入 40μl预先用细胞裂解液平衡的 Glutathione2
Sepharose24B , 4℃轻摇孵育 4 h; 10 000 r/m in冷冻离
心 30 s,静置 2 m in,收集预处理的细胞裂解液 ;分别
加入 p reS1不同片段的重组融合蛋白各 80μg于预处
理后细胞裂解液上清中 , 4℃轻摇孵育 4 h;加入 40μl
预先用细胞裂解液平衡的 Glutathione2Sepharose24B,
4℃轻摇孵育过夜 ; 10 000 r/m in冷冻离心 30 s,静置
2 m in后收集树脂 ;用 1. 5 m l洗涤液 ( 20 mM Tris,
121
生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 8期
pH7. 4; 300 mM NaCl; 0. 5%NP240; 0. 1 mM EDTA )洗
涤树脂 5 m in, 10 000 r/m in冷冻离心 30 s,静置 2 m in
弃上清 ,重复 6次 ;加入 20μl 1 ×蛋白上样缓冲液 ,煮
沸 5 m in, 10 000 r/m in离心 5 m in,上清用于 SDS2
PAGE电泳。以 HRP标记的链亲和素 (购自 Pierce公
司 )为一抗进行 W estern blot检测。结果显示 21～33
aa是 p110识别 p reS1的主要位点。
115　识别位点的鉴定
预先用含 p reS1 21 ～33 aa的重组融合蛋白
GST2(21～33)与细胞裂解液孵育 ,去除与之结合的
蛋白 ( p110 ) ,预处理后的细胞裂解液再与 GST2
p reS1进行结合反应 , W estern blot结果显示不能检
测到 p110蛋白条带 ,说明 GST2( 21～33)可以阻断
p reS1与 p110的特异结合。
2　结果
211　删除突变体克隆的构建及融合蛋白的表达
纯化
分别用 PCR方法或直接合成小片段正反义链
退火的方法获得删除突变体的 DNA片段 ,将其与用
相同限制性内切酶酶切的载体 pGST2MOLUC连接
转化宿主菌。大片段用双酶切进行鉴定 ,而较小的
片段由于双酶切鉴定相对比较困难 ,采用载体测序
通用引物直接菌落 PCR扩增鉴定阳性克隆 ,双酶切
和测序结果证实克隆构建成功 (图 1,图 2)。
1.λ2EcoT14 I digest DNA Marker; 2. pGST2p reS1N;
3. pGST2p reS1C; 4. 100bp DNA Marker
图 1　重组质粒的酶切鉴定
212　融合蛋白的诱导表达与纯化
IPTG诱导表达重组蛋白 ,在其相应大小位置均
见目的蛋白的高效表达。对表达产物的溶解性进行
分析表明 ,融合蛋白 90% ～95%以上存在于菌体裂
1. 100 bp DNA marker; 2. pGST2MOLUC; 3. pGST2(1～44) ; 4. pGST2
(20～61 aa) ; 5. pGST2(21～47 aa) ; 6. pGST2(11～21 aa) ; 7. pGST2
(16～27 aa) ; 8. pGST2(21～33 aa) ; 9. pGST2(31～47 aa) ; 10. pGST2
(41～53 aa)
图 2　重组质粒的菌液 PCR鉴定
解液的可溶部分。融合蛋白分子中含有谷胱甘肽硫
转移酶 ( GST) ,用 Glutathione2Sepharose24B 亲和凝
胶对表达产物进行快速方便的纯化 ,从 400 m l培养
液中可获得 20 mg左右的融合蛋白 ,纯度均在 90%
以上。融合蛋白的分子量大小与预期分子量大小相
符 ,并有蛋白二聚体存在。1～44、20～61及 21～47
的融合蛋白存在不同程度的降解 (图 3)。
1. GST2(21～33) ; 2. GST2( 31～47 ) ; 3. Protein Marker; 4. GST2( 1～
44) ; 5. GST2(20～61) ; 6. GST2(41～53) ; 7. GST2(21～47) ; 8. GST2
(16～27) ; 9. GST2(11～21)
图 3　融合蛋白的表达纯化
213　p110识别 p reS1的主要位点
生物素特异标记细胞膜后裂解细胞 ,全细胞裂
解液用于 pull down试验 ,通过 HRP标记的链酶亲
和素特异和生物素反应 ,可以使与融合蛋白结合的
膜蛋白特异显色 ,而未用生物素标记的细胞裂解液
则不能显色。通过逐步删除突变的 p reS1融合蛋白
直接与预处理后的生物素标记 HepG2细胞裂解液
进行 pull down试验 ,发现 p110与 p reS1的结合位点
在 p reS1的 N端 ( 1～61 aa) (图 42A ) ;进一步试验
表明 p110可以与 p reS1 (1～44 aa)和 p reS1 (20～61
221
2009年第 8期 丁岗强等 : HBV前 S1蛋白与 HepG2细胞膜蛋白结合位点鉴定
aa)结合 (图 42B ) ;进一步缩短 p reS1, p110可以与
p reS1 (21～47 aa)特异结合 ,而与 p reS1 (16～27 aa)
结合明显减弱 ,不能与 p reS1 ( 41～53 aa)及 p reS1
(11～21 aa)结合 (图 42C)。分段融合表达 p reS1
(21～47 aa)片段 ,W estern blot显示 p110结合位点
位于 p reS1 的 21 ～33 aa区域 (图 42D )。预先用
GST2(21～33)与细胞裂解液孵育 ,去除与 GST2( 21 ～33)结合的蛋白 ,预处理后的细胞裂解液再与GST2p reS1进行结合反应 , W estern blot检测不到p110蛋白条带 , 说明 GST2( 21 ～ 33 ) 可以阻断p reS1与 p110 的特异结合 ,进一步证明 p110 与p reS1的结合位点在 21～33 aa,而用 BSA则不能阻断 (图 42E)。
A 1. GST2p reSIN; 2. GST2p reS1C　B 1. GST2(1244) ; 2. GST2(20 - 6) 　C 1. GST2(11 - 21) ; 2. GST2(16 - 27) ; 3. GST2(21 - 47) ; 4. GST2(41 - 53)
D 1. GST2(31 - 47) ; 2. GST2(21 - 33) 　E 1. 加入 GST2(21 - 33) ; 2. 加入 BSA
图 4　preS I识别 p110位点分析及识别位点鉴定
3　讨论
HBV的包膜由 3种蛋白所组成 ,分别是主蛋白
( S)、中蛋白 (M )和大蛋白 (L)。这 3种蛋白分别有
含各自起始密码子的氨基端 ,具有共同的羧基末端
和终止密码子。主蛋白由 S基因编码 ,含有 226个
氨基酸 ;中蛋白由 S及 p reS2基因区编码 ,含有 281
个氨基酸 ;大蛋白由 p reS1、p reS2和 S片段组成 ,由
于 p reS1在不同病毒亚型中的大小不同 ,因此大蛋
白的大小为 389或 400个氨基酸不等。从病毒颗粒
的构型看 , HBV L蛋白和 M蛋白位于 Dane’s颗粒
的表面 ,是肝细胞表面受体和 HBV作用时与细胞接
触的前哨。较之 S,前 S区更有可能作为病毒黏附
肝细胞膜的吸附蛋白 ,介导病毒附着和侵入细胞。
前 S区同时具有多种生物学功能和较强的免疫活
性 ,研究提示前 S区与病毒的感染、复制和病毒颗粒
的装配密切相关 ,尤其在参与病毒与宿主细胞的相
互作用中发挥至关重要的作用 [ 1 ]。因此对 p reS1、
p reS2及其相关受体的研究也成为 HBV与靶细胞作
用研究的热点领域。
目前所报道的 HBV候选受体中 ,经证实其绝大
部分是与 p reS1相互作用的 ,在 p reS1上的结合位点
大多位于 21～47 aa[ 2 ]。有关 p reS1介导 HBV入侵
的证据最早来自 Neurath等 [ 3 ] 的报道 ,他们发现
HBV p reS1的 21～47 aa可能是 HBV与肝细胞和
HepG2细胞结合的最重要部位 :合成的 p reS1 ( 21～
47 aa)多肽可以与 HepG2细胞结合并能阻断 HBV
与 HepG2细胞的结合 ,而其他多肽则不能 ,而且多
种抗 p reS1 ( 21～47 aa)单抗能特异阻断大蛋白或
HBV病毒颗粒与 HepG2细胞和肝细胞的结合。Le
Seyec等 [ 4 ]通过功能研究也证实 p reS1 3～77 aa是
HBV感染所必需的。p reS1区 10～36 aa (基因型
D、E、G) 的缺失将显著降低其对肝细胞的黏附
能力 [ 5 ]。
近年来大量的研究结果也从不同的层面和角度
表明 p reS1在 HBV感染的早期过程中可能起着关
键的作用 ,主要有以下几点 : ( 1) L蛋白主要存在具
有感染力的病毒颗粒中 ,而非体内大量存在的不具
感染力的亚病毒颗粒中 [ 6 ] ; (2)体外试验中 ,人血浆
中富含 p reS1的病毒颗粒能特异性地结合在 70%的
原代培养肝细胞上 ,而只含有 S蛋白的病毒颗粒则
不能。如果在这些亚病毒颗粒的 S蛋白前加上
p reS1的 2～48 aa,则可将其结合 PTH的能力再恢
复到野生型的水平 [ 7, 8 ] ; (3) L蛋白 N端 77个氨基
酸的完整性对于保持 HBV 的感染力是必需的 ,而
p reS2区域则不是 [ 4, 9 ] ; (4) p reS1区 N端第二位甘氨
酸的豆蔻酰化是 HBV 在体外感染 PHH 的必需条
件 [ 7, 10～14 ] ; (5)酰化的含 p reS1 N端 47个氨基酸的
多肽在体内外均能够阻断 HBV 的感染 [ 15 ]。而
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Abou2Jaoudé等 [ 16 ]在近期的研究中证实如将豆蔻酰
化的位点从 L蛋白转移到 M蛋白或者 S蛋白后 ,以
HBV包膜蛋白包装的 HDV就失去了感染能力 ,进
一步说明了 p reS1区域在 HBV感染中的重要性。
本实验室在前期研究中发现 HepG2细胞膜蛋
白 p110能与 p reS1特异结合。用逐步删除突变的
方法融合分段表达 p reS1的各片段 ,并与预处理的
HepG2细胞裂解液反应 ,试验结果显示 p reS1的 21
～33 aa是其与 p110特异结合的关键位点。进一步
用 GST2(21～33)预先与细胞裂解液孵育 ,能有效的
阻断 p reS1 与 p110 的特异结合 , 从反面证实了
p reS1 (21～33 aa)是 p110的结合位点。Paran等 [ 17 ]
通过突变研究和单个细胞黏附分析 ,发现 p reS1 ( 21
～47 aa)的 QLDPAF序列对细胞的黏附尤为重要 ,
在其他病毒、细菌和细胞蛋白中也发现有类似的序
列 ,该序列在病毒或细菌的黏附、附着和融合过程中
起重要作用。而 p reS1 (21～33 aa)的氨基酸序列为
PLGFFPDHQLDPA,其中含有 QLDPAF的大部分序
列 ,试验结果与 Paran的研究结果相似 ,提示 p110
蛋白可能是 HBV 黏附入侵肝细胞的关键分子。
HepG2细胞膜蛋白与 p reS1结合位点的鉴定为后续
研究 p reS1在 HBV早期感染中的作用和包膜蛋白
受体打下了基础。
参 考 文 献
1　 Chouteau P, Le Seyec J, Cannie I, et al. B virus J V irol, 2001, 75
(23) : 11565～11572.
2　 Glebe D, U rban S. World J Gastroenterol, 2007, 13 (1) : 22～38.
3　 Neurath AR, Kent SB, Strick N, et al. Cell, 1986, 46 (3) : 429～
436.
4　 Le Seyec J, Chouteau P, Cannie I, et al. J V irol, 1999, 73 ( 3) :
2052～2057.
5　 L ian M, Zhou X, Chen B, et al. J Pep t Sci, 2008, 14 (3) : 307～
312.
6　 Heermann KH, Goldmann U, SchwartzW , et al. J V irol, 1984, 52
(2) : 396～402.
7　 Glebe D, U rban S, Knoop EV, et al. Gastroenterology, 2005, 129
(1) : 234～245.
8　 Glebe D, A liakbari M, Krass P, et al. J V irol, 2003, 77 ( 17 ) :
9511～9521.
9　 Le Seyec J, Chouteau P, Cannie I, et al. J V irol, 1998, 72 ( 7) :
5573～5578.
10　Engelke M, M ills K, Seitz S, et al. Hepatology, 2006, 43 ( 4 ) :
750～760.
11　 Gripon P, Cannie I, U rban S. J V irol, 2005, 79 ( 3 ) : 1613
～1622.
12　Barrera A, Guerra B, Notvall L, et al. J V irol, 2005, 79 ( 15 ) :
9786～9798.
13　B russ V, Hagelstein J, Gerhardt E, et al. V irology, 1996, 218
(2) : 396～399.
14　Gripon P, Le Seyec J, Rum in S, et al. V irology, 1995, 213 ( 2) :
292～299.
15　Petersen J, Dandri M, M ier W , et al. Nat B iotechnol, 2008, 26
(3) : 335～341.
16　Abou2Jaoude G, Molina S, Maurel P, et al. V irology, 2007, 365
(1) : 204～209.
17　Paran N, Geiger B, Shaul Y. EMBO J, 2001, 20 ( 16 ) : 4443
～4453.
(上接第 119页 )
段时 ,容易出现拖尾和非特异扩增的现象 ,且随着目
的片段的增长 ,扩增出的非特异性条带增多。可以
通过降低 Mg2 +浓度、引物量、模板量和逐步提高退
火温度减少 ,控制循环次数 (一般为 15～20个 )等措
施解决 [ 7～9 ]。
轮状病毒外壳蛋白 VP4是病毒中和反应的主要
目标 ,经胰蛋白酶裂解成蛋白 VP5或 VP8 ( P蛋白 )
两部分 ,可增强病毒的感染性。由于 VP4作为同源
抗原具有良好的异源中和抗体 ,因此以 VP4作为抗
原基因进行表达研究 ,将为研制开发有效的轮状病
毒口服基因工程疫苗探索一条新的途径。
参 考 文 献
1　 Penelope H. Vaccine, 2007, 25: 3137～3141.
2　 Glass R I, B resee JS, Parashar UR, et al. A rchives de pédiatrie,
2005, 12: 844～847.
3　 Heckman KL, Pease LR. Nat Protoc, 2007, 2: 924～923.
4　 RobertM, Henry D, Steffan N, et al. Gene , 1989, 77: 61～68.
5　 Shevchuk NA, B ryksin AV, Nusinovich YA, et al. Nucleic Acids Re2
search, 2004, 32 (2) : 19.
6　 Horton RM, Cai ZL , Ho SN, et al. B io Techniques, 1990, 8 (5) : 528
～535.
7　杨宇 ,吴元华 ,郑雅楠. 安徽农业科学 , 2006, 34 (9) : 1810～1811.
8　陈波. 生物技术 , 2008, 17 (4) : 43.
9　修佳祺 ,李云 ,张云建 ,等. 中国试验诊断学 , 2007, 11 ( 8 ) : 1091
～1094.
421