全 文 ：峨物技术通报

研 究报 告
刀爪口r E O 阴W 万刀 6 Y B U L L E 刀W 2
刃9 年增 刊
微量植物样本的 D NA 提取方法研究
张幼芳
(浙江警察学院 ,杭州 31 05 3)
摘 要: 为建立一种适于法庭科学实践的植物物证 D N A 提取优化方法 , 以期获得高质童的适于 PC R 分析的模板
D N A
用8 种方法从不同植物的干叶片中提取 D N A , 利用线粒体 D N A 非编码区的Pc R 扩增结果分析评价提取 D N A 的质
贵
结果表明8 种 D N A 提取方法所提取的 D N A 都可以获得线杜体 D N A 非编码区的 PC R 扩增产物,时照紫外波长扫描结果
显示,以改进的 C T AB 方法制备的模板 D N A 纯度最高,可达到进口试剂盒同等制备精度 , O D 26O/280 德定在 1.7 一1.9之间
因
此改进的 C T AB 方法适用于徽1 植物样本的 D N A 提取 , 可应用于法庭科学实践

关挂词: 植物物证 D N A 提取 PC R 分析 法庭科学
R esea rch o n M eth o d s o f D N A ext raeti o n fr o m T ra ce Pl a n t E vi d en ce
Z h an g y o u舀叮g
r刀呵四堵乃功lic 勘 cu rity B b, au , 万朗乎ho
31 0 53)
A bs t
a ot : In o rde r to es ta blis h an efe etive me th od of D N A extra cti on 如 m tra ee Plan r evi denee. C o m Pare th e quali ty of pC R
Pro du ets of 而tochondrial D N A w hi eh ex恤eted 如m 御 口.teri山 of di fe re nt Plan r sP ecies am ong 8 m eth o山. R esult T w o m etho击
in eludi ng mo 翻 ed C T AB me th od an d Q i岑 n D N easy Pbot 涌 ni 儿t, w ere beter than th e oth e
如m th e an 习
15 of PC R Pro due匕
an d th e Pu 曲 e如 o n o f temP la te D N A .T h eir P uri fieati ons we re betw een 1 .7 an d 1.9 by seanm ng un der Ul tll vlolet w aves. C onclusion
T he mo di 6ed C T A B me th od 15 use 佃 to fo rens ie seien ees aPPli eati on .
K ey wo fd s : Pla nt evi dence D N A extra ction P C R ar 目
15 Fo re ns ie scien ees
植物物证在各类案件中的作用已引起法庭科
学工作者的重视 , 随着分子生物学技术的发展 ,
D N A 分析技术成为植物物证种属
个体识别的重
要手段 ,案件中的植物物证形态千差万别 ,往往为
一些微量
分解
陈旧甚至腐败的检材 ,因此 ,从植
物检材 中提取到高质量
适合 PC R 分析的模板
D N A 成为植物物证检验成败的基础
已有一些特
殊植物检材 D N A 提取的相关报道
一3] ,本研究通过
对不同方法提取的 D N A 质与量的比较 , 寻求一种
适于法庭科学实践的植物 DN A 提取的优化方法

1 材料和方法
1.1 样本
取烟草
雪松
水稻
玉米的干枯植物叶片用 Mi li Q
水冲洗干净 , 并晾干后于研钵中液氮充分研磨 ,同
时加人 1110 质量的 PV P[4l 或维生素 C ,分别称取 50
m g 加人 8 个 1.5 d 离心管中 , 以供 8 种不同方法
提取植物基因组 D NA

1.2 试 剂
提 取缓 冲液 :10 m m ollL Tri s
CI(pH S.0), 20
m m ol/L E D T A , 5加 m m ol/L N aC I , 1.5 % S D S

CTA B 提 取缓 冲液 :2% CTA B , 2(X) m M Tri s-
H CI (PH S.0), 50m M E DTA , 1.4 M N aC I, 2.5% PV P-
40 , 0. 4% 2一琉基乙醇(使用前加人)

几 缓冲液 :10 m m olL Tris
CI (pH S.0), 1 m m oll
L E DTA (PH S.0)

收稿 日期 :2以为一以一04
基金项 目:浙江省科技厅科技计划资助重点项目(0 1103237)
作者简介:张幼芳 (l 96 9一),女 ,浙江绍兴人 ,教授 ,主要从事法医学教学和法庭生物学研究;E 一Inaj l:Zhan 群f6 9@ 12 6. co m
148 性物杖术通稚习勿招
几彻城盯 2以为 年 增 刊
PC R 反应试剂 (上海 Pro m eg a 公司 ):10 xPC R
反应缓冲液 ;25 m m ol/L M 邪12 ;4 种 dN TP 混合物;
Ta qD NA 聚合酶

PC R 引物 :线粒体非编码区引物序列 P hi ni 一1:
5
一 C G A A A T C G G T A G A C G C T A C G 一3
;P lant一2 :
5
一 G G G G AT A GA GG G ACT TG A A C 一3
由上海
生工生物工程公司合成

其 它 试 剂 :10% SD S
3 m ol/L N aA e
3 mo l/L
KA c
10 m ol /L 乙酸按
酚
抓仿
异戊醉
聚乙烯毗
咯烷酮(PV P )
维生素 C
异丙醇
无水乙醇
70 % 乙
醇
R Nas eA o
1.3 D N A 提 取方法
1.3.1 WJ C 法 (l) 在样品中加人 50 闪 提取缓冲
液 ,振荡混匀 ,冰上放置 30 而n
(2 )室温下 12 仪x

rl而n 离心 s m in
(3) 取上清液至新离心管中 ,加人
等体积酚 ,颠倒混匀 ,室温下静置 5一 10 m in , 然后 5
仪X
rlm in 离心 5 m in
(4)取上清液至新离心管中 ,
用等体积酚 :抓仿 :异戊醇(25 :24 :l) 抽提 ,待分层
后 , 5 以x) :/mi n 离心 5 而n
(5) 仔细移取上清液至
另一新离心管 中 , 加人 l/10 体积 3 m ol/L N aA e
(pH S.2) 和 2 倍体积的冷无水乙醇 ,混匀后一20
放
置 l 小时左右 , 12
XX) rlm in 离心 10 m in
(6)弃上
清 , 用 70% 的乙醇洗沉淀两次 , 12 侧X) rl m in 离心
ro 而n ,弃掉上清 ,真空干燥 Z h 以上
(7) 沉淀溶于
50 闪 TE 溶液中 ,一20
保存备用

1.3.2 oard and D o noval 法 在样品中加人 仅力林l
提取缓冲液 ,沸水浴 7 m in
室温 12 仪X)rl m in 离心
ro m in
移取上清液到一新的离心管中 , 加人 45
闪 10 m ol L 乙酸铁和 I nil 乙醉 , 颠倒混匀沉淀
D N A
一70
放置 l 小时左右 ,沉淀 D NA ,然后 12
仪旧:/m in 离心 巧 m in
弃上清 ,沉淀于印
真空干
燥 5一 10 m in
将 D NA 溶解于 50 卜I TE 中 ,一20C 保
存备用

1.3.3 (eibe
plant D N ^ 20 1 R egent) 参照 e ibc o
植物 DN A 提取试剂盒说明

1.3. 4 Edw ard s ls 在样品中加入日
) 闪 提取缓冲
液 ,振荡混匀 ,室温下 12 仪X) r/m in 离心 5 m in
取
上清液 ,加人等体积的异丙醇 ,颠倒混匀 ,冰上放置
s m in
室温下 12
XX) r/ m in 离心 10 m in
弃上清 ,
沉淀于 60
真空干燥 5一ro m in
将 D N A 溶解于
50 闪 TE 中 ,一20
保存备用

1.3.5 (Q i卿 n D Neas y plant m ini kit) 参照 Q ia-
罗 n D N e哪 Plan t而ni kit手册

1.3.6 改 进的 CTA B 法 加人 70 卜 1 0.75xCTA B
提取缓冲液 ,充分混匀后在 65
中水浴 90 m in ,期
间不时轻缓颠倒混匀
加人 70 闪氛仿 : 异戊醇
(24 :l) ,混匀后室温下 12
众) rl m in 离心 ro m in 至
分相
取上清液 , 加人 1 10 体积的 CTA B 提取缓
冲液 ,再加人等体积的氛仿 :异戊醇(24 :l) ,混匀后
室温下 12
XX) r/而n 离心 ro m in
重复步骤 3
取
上清液 ,加等体积的 CTA B 沉淀缓冲液 ,混匀后室
温下 12
XX) r/ m in 离心 10 m in
倾掉上清 ,将沉淀
溶于 10 闪 高盐 TE 缓冲液 中 , 同时加人 5 卜L
RN A ase 储液 ,用枪轻打沉淀 ,使之充分溶解 , 37

下保温 30 m in
然后加人等体积抓仿 , 12 OtX ) rl而n
离心 ro 而n , 将上清液转移到干净的离心管中 ,加
人 2 倍体积的冷无水乙醇 ,于一70
冷置 30 m in
室
温解冻后 , 12 (X X) rlm in 离心 10 m in , 弃掉上清 ,用
70 % 冰乙醇洗沉淀两次 , 12
X ) :/m in 离心 10 m in ,
弃掉上清 ,用吸水纸吸干净残留的乙醇
将沉淀溶
于50 闪 TE 缓冲液中 ,一20
保存备用

1.3. 7 sD S 法 向离心管中加人 45 0 闪 提取缓冲
液和 10 闪 10 % SD S , 用力振荡混匀 ,印
水浴 10
m in
加入 160 林 1 3 m ollL KA e (PH S.2) ,冰上静 !
20 m in
室温下 12 (X X) r/m in 离心 10 而n
吸取上清
液至另一离心管中 ,加人等体积的异丙醇 ,冰上静
置 30 m in ,沉淀 D N A
重复步骤 3
弃上清液 ,沉淀
重悬于 l 林1 10 m gl园 的 R N A 酶 37
水浴 Z h
加
人等体积酚 :氛仿 (1:1) ,颠倒混匀 ,室温静置 10
m in , 待分层后 , 12 (X X) r/m in 离心 10 m in
取上清
液 ,加人等体积抓仿 ,颠倒混匀 ,室温静 ! 10 m in ,
待分层后 , 12 仪X
rp m 离心 10 m in
取上清液 ,加 l/
一
体积的 3 mo lzL N a^ e (pH S.2)和 2 倍体积冷的无
水乙醇 ,一70
放置 30 m in
室温解冻后 , 12
X 旧rl
m in ,离心 ro m in ,弃掉上清 ,用 70 % 冰乙醉洗沉淀
两次 , 12
XX) r/m in 离心 10 而n ,弃掉上清 ,用吸水
纸吸干净残留的乙醇
将沉淀溶于 50 闪 TE 缓冲
液中 ,一20
保存备用

1.3. 8 改进的酚/抓仿抽提法 将 6
X) 闪 经 50
预
热的抽提混合液 (12 闪 的琉基乙醇加入到 6X
闪
2心X为 年 增 刊 张幼芳 :微量植物样本的 D NA 提取方法研究 14 9
Zx提取缓冲液 ,加样混合)加到样品中 , 50
水浴裂
解 20 m in
在裂解液中加人 50 闪 的酚/氯仿(1 :
l) ,用力振荡混匀 , 37~45
水浴振荡 60 m in
室温
下 14 OD( ) :/m in 离心 20 m in ,取 4(X) 林l上清液至新
的离心管中
加 40 闪 lx 提取缓冲液和 50 闪 的
酚/抓仿 (1 :l) , 37
水浴振荡 30 m in
室温下 14
(X刃 :/m in 离心 30 m in , 取 6(X) 闪 上清液至新的离
心管中
加 50 闪氯仿 ,室温下振荡 10 m in
室温
下 14 以叉
:/m in 离心 30 m in ,取 450 林l上清液至新
的离心管中
加 150 林 1 10 m ol/L 乙酸钱和 3(X) 闪
异丙醇颠倒混匀 , 室温下 14 侧X) rl而n 离心 30
m in ,小心弃上清液
用 70% 冰 乙醇洗沉淀两次 , 12
以X) :/m in 离心 ro m in ,弃掉上清 ,用吸水纸吸干净
残 留的乙醇
将沉淀溶于 50 闪 几 缓 冲液中 , -
20
保存备用

1.4 基 因组 D N A 的质童和产童检测
将 D NA 溶 液稀释 20 倍后 , 测定 O D , /O D ,
比值 ,估算出 D NA 的含量和质量

取 5 闪 在 0. 7% 琼脂糖凝胶上 电泳 , 检测
D N A 的分子大小

1.5 P C R 扩增
在 50 闪 反应体系中 , 各种试剂浓度分别为
M gC I: 2 .5 m M , d N TP s 0 .2 m M ,引物 0.5 林M , Ta q 酶
0.025 u z林l, DN ^ 模板 5 ngz林l, IX peR 缓 冲液 ,其
余用水补足

反应条件I6] 为 95
预变性 5 m in ;再进行 36 次
扩增反应循环 (95
变性 30 5
55
退火 45 ,
72

延伸 9() s);然后 72
延伸 7 m in

1.6 扩增 产物检 测
配制 2% 琼脂糖凝胶 ,电压为 SV /c m , 电泳 20
m in ,在紫外灯下观察结果

2 结果
2 .1 不 同方法提取 的 D N A 质 童比较
本 研究 中用改进 的 CTA B 提 取 方法 (方法
1.3.6 )所获得 D N A 的 OD , :O D二值 (10 次平均值)
均在 1.7一1.9 之间 ,表明其样品纯度较高 ,可以达
到用试剂盒提取 D N A 的纯度 (方法 1.3.5)
而用其
它方法获得 DN A 的 O D , :O D二值 (10 次平均值 )
都低于 1.7 ,表明杂质含量较高 (表 1)

衰 1 不同方法提取的 O N A 0 0 , :0 0 . 比值
提取方法
方法 1 .3.1
方法 1.3.2
方 法 1.3 .3
方 法 1.3 .4
方法 1.3 .5
方法 1.3 .6
方法 1.3 .7
方法 1.3 .8
烟草 雪松 水稻
42396206748
4978653 460175392
406峥月Q矛,
气
飞OJ,
06内j咤
41,挑内一声6j
2. 2 不 同方法提取的 D N A 扩增 结果分析
对水稻
烟草
雪松 D NA 的 PCR 扩增结果显
示 :尽管不同 D NA 提取方法所获得的 DN A 在纯度
上差异较大 , 但线粒体非编码区的 PCR 扩增结果
却差别不大 ,如图 1所示 ,不同方法获得的 DN A 在
同一品种间 PCR 扩增条带清楚 ,大小一致
且在各
品种间用同一方法获得的 D N A 扩增条带也差别不
大

13 14 15 16 1 , 1目 19 加 2 1 22 23 24
1一8 泳道 为烟草 D N A 的 PC R 产物 ;9 ~ 16 泳道为雪 松 D N A 的
PC R 产物 ;17 一24 泳道为水稻 D N A 的 PC R 产物
圈 1 不同方法提取的 O N A 线粒体非编码序列 P C R
扩增结果
3 讨 论
就模板 D N A 而言 , 影响 PCR 的主要因素是模
板的数量和纯度
一个灵敏的 PCR 可以从一个细
胞中提取的 D N A 用于目的序列的分析
但法庭科
学的检材形式多样 ,往往存在一些干枯
分解
腐烂
样本 ,这些样品的 DN A 严重降解 ,基因组 D N A 含
量差别较大.有的含量可能极少 ,为了确保检材检
测的成功率和准确性 ,就必须保证模板的质和量

8 种不同提取方法提取的 DN A 其 OD 值及其
150 生物杖术透银习勿
动朋城盯 2 (X 为 年 增 刊
线粒体非编码区 代 R 扩增结果表明 : 以改进 的
CTA B 提取方法获得的墓因组 D NA 纯度最高 ,可达
到进 口试剂盒同等制备精度 , O D~ 稳定在 1.7 -
1.9 之间 ,适用于微量的植物样品的 D N A 提取
其
次 ,用于检测 DN A 质t 的线粒体非编码区 PC R 扩
增片段长度为 5 0 帅 ,从扩增片段长度上看 ,用来
评价 PC R 模板是适宜的17
再者 ,各种提取方法获
得的 DN A 扩增结果差异不大 , 都能得到比较清晰
的扩增条带 ,主要由于线粒体非编码区在植物细胞
中具有较高的拷贝数l8]
综合分析 ,改进的 CTA B 方
法能够获得高质
高量的适于 PC R 分析的 D N A 模
板 ,并且经济实用 ,适于法庭科学的实际应用

, 考文献
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月卜 . 月卜心闷卜
闷卜币月卜巾月卜心月卜 . 月卜二月卜巾月卜必闷卜办月卜司.月卜中阅卜妙闷卜
月卜 二阅卜 二月卜闷
月卜月
月卜阅卜月卜司.月卜 .
(上接第 138 页)
等情况不能获得更多的信息
本研究中 ,有三个后
代扩出两条供体
后代具有而受体没有的特异带 ,
但不表示有两个外源 D NA 片段进人到受体中 ,它
们也可能是一条外源 D NA 片段两个扩增产物
对
于外源 DN A 导人情况的进一步了解 , 则需要使用
基因组原位杂交方法 ,这方面有待于进一步研究

. 考文欲
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