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生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 8期
基于 CO I序列快速鉴定花蓟马的 DNA条形码芯片初探
冯毅　王莉　白云峰　王洁　冯纪年
(西北农林科技大学植保资源与病虫害防治教育部重点实验室 ,杨凌 712100)
　　摘 　要 : 　利用 DNA条形码信息研制 DNA芯片 ,建立快速高效的花蓟马鉴定方法。以 3种花蓟马属 ,共 9个样本的 CO
Ⅰ基因片段序列为研究材料 ,应用软件 Primer Prem ier5搜索出 9个样本的 12种 motif基因序列 ,应用这 12种 motif序列制作虚
拟 DNA条形码芯片。虚拟电子杂交 20个样本的 COⅠ基因片段序列。结果显示 ,设计的虚拟 DNA芯片能够鉴定本研究中的
3种花蓟马 ,利用 DNACOⅠ基因片段 ,设计 DNA芯片在理论上可行。
关键词 : 　COⅠ基因 　DNA条形码 　DNA芯片 　花蓟马
M olecular Identif ication of F ranklin iella Based on
COⅠSequences by DNA Barcoding Chip
Feng Yi　W ang L i　Bai Yunfeng　W ang J ie　Feng J inian
( Key Laboratory of Plant P rotection and Pest M anagem ent , M inistry of Education
& Entom ology M useum , N orthw est A & F University , Yangling 712100 )
　　Abs trac t: 　A quick method of Franklin iella identification by DNA chip that based on the DNA barcoding information was estab2
lished. N ine COⅠgene partial sequences of three species of Franklin iella were obtained. Twelve Motif sequences of the nine samp les
were searched by the software Primer Prem ier5. Simulated DNAchip were made acorrding to the twelve Motif sequences. COⅠgene
partial sequences of twenty samp les were hybridized with the Simulated DNA chip. It was showed that DNA barcode chip can identify
the there sp icies of Franklin iella. Integrating the DNA barcode and DNA chip is feasible in theory.
Key wo rds: 　Gene COⅠ　DNA barcode　DNA chip　Franklin iella
收稿日期 : 2009204213
基金项目 :国家自然科学基金 (30570205) ,国家大学生创新性实验计划资助项目 (01082501)
作者简介 :冯毅 (19832) ,男 ,河南人 ,硕士研究生 ,研究方向 :昆虫系统学与生物多样性
通讯作者 :冯纪年 , Tel: 029287092090, E2mail: jinianf@nwsuaf. edu. cn　　花蓟马属 ( F ranklin iella Karny)隶属于缨翅目( Thysanop tera)蓟马科 ( Thrip idae) [ 1 ]。世界上已知200余种 ,我国记录有 8种。蓟马不仅对农作物造成直接危害 ,而且可以传播植物病毒 [ 2 ]。蓟马体形小 ,活动较隐蔽 ,种类鉴别须先将虫体制成玻片标本 ,然后在显微镜下观察其特征并加以鉴别 ,因此有一定的难度。国内外许多研究者利用不同的分子标记进行物种鉴定。如 W ard等 [ 3 ]完成了对澳大利亚 207种鱼类的分子编码 ,同年 , Ball和 Hebert[ 4 ]尝试用分子条码鉴别 70多种水生昆虫蜉 ( Ephemerop tera)。近几年已开展了蓟马的分子鉴定 , Moritz等 [ 5 ] 以 ITS2RFLP法鉴别多种蓟马 , B runner等 [ 6, 7 ]基于 COⅠ基 因部分片段讨论直接测序法及 PCR2RFLP法鉴别10种重要蓟马的可能性 ,后来又应用该标记探讨了与寄主相关的两个烟蓟马 ( Thrips tabaci)类型 B run2ner等 [ 11 ]。林峻贤等 [ 8 ]则用基于 28S rDNA和 16SrDNA的 Multip lex2PCR及 PCR2RFLP技术来鉴定西花蓟马 ( F ranklin iella occiden ta lis)和烟蓟马。A sokan等 [ 9 ]利用 COⅠ基因设计出烟蓟马和棕榈蓟马的特异性引物。游中华等 [ 10 ]用 PCR产物直接测序法对入侵害虫西花蓟马和其他 8种蓟马的线粒体 COⅠ基因 433 bp片段测序 ,表明基于 PCR及直接测序技术的分子鉴定可以达到准确鉴定蓟马物种之目的。鉴于线粒体 CO Ⅰ基因在物种鉴别方面的独特优点 [ 11, 12 ] ,物种鉴定多选择该基因作分子标记 [ 13 ] 。
生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 8期
相对于传统形态鉴定 ,利用分子标记鉴定物种有
许多优点 : ( 1 )分子鉴定不受待测物种的生物型 ,
性别和发育阶段的限制 ; ( 2 )方法简便 ,成本低廉 ;
(3)非专业人员也可以利用合适的分子标记进行
物种鉴定。
由于常规的 DNA条形码技术需要测定基因序
列 ,所需时间长 ,不适合检验检疫部门快速检验通关
的要求。如果建立一套能够快速简便地鉴定有害蓟
马的 DNA条形码芯片 ,将大大促进有害物种的检验
鉴定进程 [ 14 ] ,因此 ,本研究探讨利用 DNA条形码信
息设计 DNA芯片 ,借助生物芯片快速、高通量的优
点 [ 15 ] ,探索建立快速 ,准确 ,及时的有害花蓟马鉴定
方法。
表 1　样本信息
编号 物种 GenBank序列号 来源 用途
1 F. in tonsa YL1 本实验室 设计芯片
2 F. in tonsa EF213747 GenBank 设计芯片
3 F. in tonsa EF213748 GenBank 设计芯片
4 F. in tonsa EF213749 GenBank 设计芯片
5 F. occidenta lis YL2 本实验室 设计芯片
6 F. occidenta lis EF469245 GenBank 设计芯片
7 F. occidenta lis EF469246 GenBank 设计芯片
8 F. occidenta lis EF469247 GenBank 设计芯片
9 F. tenuicorn is YL3 本实验室 设计芯片
10 F. in tonsa EF4692450 GenBank 检验
11 F. in tonsa EF213751 GenBank 检验
12 F. occidenta lis EF469248 GenBank 检验
13 F. occidenta lis EF469249 GenBank 检验
14 F. tenuicorn is EF213761 GenBank 检验
15 Thrips tabaci YL4 本实验室 检验
16 Thrips tabaci EF213754 GenBank 检验
17 Thrips palm i AF378692 GenBank 检验
18 Thrips colora tus YL5 本实验室 检验
19 M egalurothrips usita tus EF213759 GenBank 检验
20 M egalurothrips usita tus EF213760 GenBank 检验
1　材料与方法
111　标本的采集与鉴定
研究所用蓟马均为雌成虫 ,标本信息见表 1。
选取花包括花蓟马属 3种蓟马在内的 7种共 20个
样本的 COⅠ基因片段序列 ,其中 15个基因片段序
列来自 GenBank, 5个由本实验室扩增测序得到 ,将
野外采集到的蓟马浸泡于 100%酒精中保存在
- 20℃冰箱中备用。物种的形态鉴定工作由蓟马分
类专家完成。
112　DNA提取
总 DNA用酚氯仿抽提法 [ 16, 17 ]从单头蓟马中提
取。随机挑取蓟马雌虫 ,将单头标本浸入蒸馏水中
除去酒精后移入 1. 5 m l EP管加 TE缓冲液 ( 10
mmol /L Tris2HCl, 1 mmol/L EDTA , pH8. 0) 100μl中
浸泡 1 h,然后将虫体转移至 200 μl提取液 ( 10
mmol/L Tris2HCl, 1 mmol/L EDTA, 1 % SDS,
pH 8. 0)中用研磨棒充分研磨 ;加入 2. 5μl蛋白酶
K (20 mg/m l)于研磨后的匀浆液中 ,混匀后于 56 ℃
消化 5 h;第一次抽提加等体积苯酚 /氯仿 /异戊醇
(25 ∶24 ∶1 )于反应混合液中 ,混匀 ,离心 10 m in
(4℃, 10 000 r/m in)。吸取上清后再用等体积冷氯
仿 /异戊醇 (24∶1)抽提一次。吸取上清 ,用 1 /10体
积 3 mol/L NaAc (pH5. 2)和 2倍体积 100 %乙醇 -
20℃沉淀 1～3 h,离心 30 m in (4℃, 12 000 r/m in) ,
弃上清 ,晾干后用 30 μl TE缓冲液溶解 DNA,该
DNA溶液即可用于 PCR扩增。
113　PCR扩增与测序
PCR反应采用 25μl标准反应体系 ,其中含有 2
μl DNA模板溶液 ,引物 (10μmol/L )各 0. 5μl, 2. 5
μl 10 ×Taq Plus buffer (Mg2 + ) , 2. 0 μl dNTP ( 2. 5
mmol/ l)混合液 , Taq DNA聚合酶 (5. 0 U /μl) (宝生
物工程 (大连 )有限公司 ) 0. 2μl。反应条件 : 94 ℃
变性 5 m in; 94℃40 s, 47℃40 s, 72℃1 m in, 35个循
环后 72℃保温 10 m in。取 2. 5μl扩增产物于含有溴
化乙锭的 1 %琼脂糖凝胶中电泳 ,电泳结束后在紫外
光下检测结果并拍照。PCR反应所用引物为 m tD2
712F: 5′2ATTAGGAGCHCCHGAYATAGCATT23′, m tD2
9. 2R: 5′2CAGGCAAGATTAAAATATAAACTTGG23′[ 4 ]。
由上海生工生物工程技术服务有限公司和西安
沃尔森是生物技术有限公司合成。所得目的片段送
上海生工生物工程有限公司测序 ,采用 PCR产物直
接双向测序 ,由 AB I PR ISM 3730 全自动测序仪
完成。
114　DNA条形码芯片的设计与研制
选取 9个样本 (花蓟马属 3种蓟马 )的 COⅠ基
因片段序列 (1～9号 ) ,通过 ClustalX软件直接比对
序列 (图 1) ,然后应用 Primer Prem ier 5. 0软件寻找
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2009年第 8期 冯毅等 :基于 CO I序列快速鉴定花蓟马的 DNA条形码芯片初探
各蓟马 COⅠ序列的 motif片段 ,由于不同种蓟马 CO
Ⅰ序列的 motif片段种类和数量不同 ,拟将这些片段
作为探针固定在芯片上 ,用以区分种属间差异 ,制作
为 DNA条形码芯片。
图 1　花蓟马属 3种蓟马 ( 1～9号样本 ) COⅠ序列比对结果
115　虚拟电子杂交
利用 DNA碱基互补配对原理 ,将被标记的 CO
Ⅰ基因片段与 DNA条形码芯片进行杂交。COⅠ基
因片段与芯片上位点序列完全一样 ,该位点就有标
记 ,若 COⅠ基因片段与芯片上序列存在至少 1个碱
基的不配对 ,就会被洗脱 ,即该位点没有标记。不同
种蓟马有不同种类和数量的 motif片段 ,因此芯片杂
交后 ,形成一串有或无的代码 ,每个样本 COⅠ基因
片段与芯片杂交后 ,都产生这样一系列代码 ,这个代
码可作为该样本的物种身份识别代码。
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2　结果
211　DNA条形码模拟芯片的研制与杂交
应用 Primer Prem ier 5. 0软件采用基因块 motif
搜索 ,分析 3种蓟马的 COⅠ基因序列 (样本编号 1
～9) ,应用 Primer Prem ier 5. 0软件寻找得到各蓟马
COⅠ序列的 motif片段 14种 (表 2) ,由于同种蓟马蓟
马 COⅠ序列的 motif片段种类和数量基本相同 ,而不
同种间有很大差异 ,将这些片段按一定顺序作为探针
固定在芯片上 ,用以区分种属间差异。用样品 1～20
号序列与该芯片虚拟电子杂交 ,结果见表 3。
表 2　用于建立芯片的花蓟马近缘种的 m otif片段
Motif名称 Motif序列 Motif名称 Motif序列
CK WCAGKTM IRF2IBP1 AARTGR
LF2A1 TGACCC MolV CAGGAT
NFE1 YTATCW archA TW TAWATA
RBS AGGAGG CAC CACCC
polyA AATAAA GAGA GAGAG
archB ATGK bra TNYTNAY
glyco AAYNNNAC TATA TATA
注 :表中 Motif序列字母代表的碱基 : R. A or G; Y. C or T; M. A or
C; K. G or T; S. C or G; W. A or T; H. A or C or T; B. C or G or T;
V. A or C or G; D. A or G or T; N. A or C or G or T
表 3　模拟芯片杂交结果
motif片段
蓟马编号
CK LF2A1 NFE1 RBS polyA archB glyco IRF2IBP1 TATA Mol2V archA CAC GAGA bra
1# ● ● ● ● — ● ● — — — — — — —
2# ● ● ● ● — ● ● — — — — — — —
3# ● ● ● ● — ● ● — — — — — — —
4# ● ● ● ● ● ● ● — — — — — — —
5# ● — ● ● — ● — — — ● — ● ● ●
6# ● — ● ● — ● — — — ● — ● ● ●
7# ● — ● ● — ● — — — ● — ● ● ●
8# ● — ● ● — ● — — — ● — ● ● ●
9# ● ● ● ● — ● — ● — ● ● — — —
10# ● ● ● ● — ● — — — — — — — —
11# ● ● ● ● — ● — — — — — — — —
12# ● — ● ● — ● — — — ● — ● ● ●
13# ● — ● ● — ● — — — ● — ● ● ●
14# ● ● ● ● — ● — ● — ● ● — — —
15# ● ● ● — — — ● — ● — — — — —
16# ● ● ● — — — ● — ● — — — — —
17# — — ● — — — — — ● ● ● ● — —
18# — ● ● ● — — — — ● ● ● — — ●
19# — ● ● — — — — — — ● — — — ●
20# — ● ● — — — — — — ● — — — ●
　●表示芯片杂交有结果 , —表示无结果
212　DNA条形码模拟芯片的验证
由表 3可知 ,不同属的蓟马物种各有其特异的
motif片段 ,而属内各个种间拥有一定相同的 motif
片段 ,同种间基本无差异。表明 DNA条形码芯片分
类结果准确可靠 ,能够鉴定此 3种花蓟马近缘种。
3　结果与讨论
在 DNA芯片的研制过程中 ,对 9个样本采用序
列比对以及基因块 motif搜索 ,在实践应用中 ,若未
知样本在数据库中没有条形码代码 ,可根据 DNA条
形码芯片的杂交结果 ,进行分析 ,推断出该未知样本
的种属关系。在 20个样本中选取 9个样本 ,剩下的
12个样本作为验证测试 ,即用 DNA条形码芯片与
其杂交 ,然后对杂交结果进行分析 ,测试 DNA条形
码芯片能否正确鉴定这些样本的种属关系。结果显
示花蓟马共有 6个共有的 motif序列 ,其中样本 10,
11号缺少一个 motif序列 ,西花蓟马共有 8个 motif
序列 ,其中有 4个 motif序列和花蓟马相同 ,禾蓟马
与花蓟马及西花蓟马各有 5个共有的 motif序列 ,并
有 2个特有的 motif序列。其它几种蓟马的 motif序
列种类与花蓟马属蓟马 motif序列差异较大 ,杂交结
果显示可以明显与花蓟马区分 ,且同种蓟马杂交结
果基本相同。
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2009年第 8期 冯毅等 :基于 CO I序列快速鉴定花蓟马的 DNA条形码芯片初探
杂交结果显示蓟马种内基本无差异 ,而种间差
异明显 (表 3) ,证明该 DNA条形码芯片技术具备物
种鉴定的功能。通常的 DNA条形码技术 ,需要测定
COⅠ基因序列。在实际检验检疫过程中 ,每当发现
一种从形态上不能鉴定的蓟马时 ,通常 PCR扩增后
测定 DNA序列 ,一般委托专业的生物工程公司进行
序列测定 ,大约需要 1周时间 ,且成本较高 ,从而限
制了 DNA条形码技术在检疫检验部门的应用。而
采用 DNA芯片技术 ,仅需半天时间进行 PCR扩增
与杂交就可以完成多个样品的检验鉴定 ,可大大提
高检验效率。
伴随着数据库的不断完善 , DNA条形码技术已
逐步应用于物种鉴定 ,而且显示了良好的应用前景。
目前国内外关于 DNA条形码技术的研究热点仍然
是积累 ,充实数据库。将 DNA芯片与 DNA条形码
技术结合起来 ,是一种物种快速鉴定的发展趋势 ,该
方法能够克服传统方法繁琐费时的缺点 ,在理论和
实际应用方面具有一定的意义 ,且 DNA芯片具有良
好的重复性与操作性 ,如果根据实际需要设计芯片
探针种类与数量 ,可以用于鉴定更多的蓟马种类 ,如
果采用价格低廉的材料进行研制 ,相信研究结果有
望应用于害虫防治和检验检疫部门。本研究以花蓟
马属等 20个样本为研究对象 ,采用 DNA条形码芯
片和 DNA序列杂交分析的试验 ,结果表明 DNA条
形码芯片具有很好的物种鉴定精度 ,在理论上验证
了该方法的可行性 ,并为下一步 DNA条形码芯片的
制作打下基础。
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