全 文 ：综述与专论
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 9期
纳他霉素及其生产菌育种研究进展
亓芳 1, 2 王振东 1 刘霆 2 卢彩鸽2 刘伟成 2
( 1沈阳农业大学生物科学技术学院,沈阳 110161; 2北京市农林科学院植物保护环境保护研究所,北京 100097)
摘 要: 纳他霉素是一种高效、广谱、安全的抗真菌天然产物, 广泛用做食品防腐添加剂和医用抗菌剂, 对植物病原真
菌也有强烈抑制作用。由于其主要通过褐黄孢链霉菌等发酵生产,因此高产菌种的选育是纳他霉素研究的热点之一。介绍
了纳他霉素的主要理化性质、抑菌特性及其在不同领域的应用, 综述了其生产菌育种研究进展, 并对不同的育种方法进行了
简要的比较分析, 探讨了纳他霉素高产菌种选育的发展前景。
关键词: 纳他霉素 菌种选育 诱变 原生质体 基因工程
Research Advances in Natamycin and Its Producing Strain Breeding
Q iFang
1, 2 W ang Zhendong1 L iu T ing2 Lu Ca ige2 L iuW eicheng2
(
1
College of B io log ical Sciences and T echnology, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110161;
2
Institute of P lant and EnvironmentP ro tection, Beij ing A cademy of Agriculture and Forestry Sciences, Beijing 100097)
Abstrac:t Natam ycin, as a k ind o f na tura l antifunga l drug w ith h igh e fficiency, broadspectrum and safety, w as w idely used as a
b io log ical food additive agent and med ica l antifungal agen t. It also has a stable and strong inh ib itory activ ity aga inst m any p lant patho
genic fung .i The m a in w ay to produce natam yc in w as ferm en tation by S trep tomyces g ilvo sp oreus, S. natalensis and S. chattanoog ensis. So
the breed ing of high productiv ity stra ins has been pa id grow ing a ttention by researchers in the wo rld. Th is paper gave an overv iew o f the
prog resses in the producing stra in breed ing, the ma jor physical and chem ical prope rties, the antim icrobia l activ ity and the application of
Na tm yc in. D iffe rent breedingm e thods w ere compared b riefly, and the breeding prospects o f h ighproducing stra in for natamyc in were a l
so discussed.
Key words: Na tam ycin P roduc ing stra in breed ing M uta tion P rotop last Genetic eng ineering
收稿日期: 20100302
基金项目:国家自然科学基金 ( 30671346 ) ,北京市自然科学基金 ( 6101001) ,北京市科技计划项目 ( D0706005040231)
作者简介:亓芳,女,硕士研究生,研究方向:微生物育种; Em ai:l fangq i840115@ yahoo. com. cn
通讯作者:王振东,教授, Em ai:l zh endongw ang1212@ yahoo. com. cn;刘伟成,研究员, Em ai:l l iuw c@ 126. com
纳他霉素 ( natamycin )为天然广谱抗真菌剂,
最早由 S truyk等 [ 1]于 1955年从南非 Natal州 Pieter
maritzburg镇附近土壤中筛选的纳塔尔链霉菌
(S trep tomyces natalensis)中分离得到, 称为匹马菌素
( P imaricin) ; 1959年, Burns等在美国田纳西州的土
壤中分离到了一株恰塔努加链霉菌 ( S. chatta
noogensis) ,并从其培养物中分离到了田纳西菌素
(T ennecetin )。此后的研究证明匹马菌素和田纳西
菌素为同一物质, 并被世界卫生组织 (WHO )统一
命名为纳他霉素 [ 2]。纳他霉素主要通过菌株发酵生
产,前人报道的纳他霉素生产菌有恰塔努加链霉菌、
纳塔尔链霉菌和褐黄孢链霉菌 ( S. gilvosporeus) [ 3] ;
近年研究表明,利迪链霉菌 ( S. lyd icus )也能产生纳
他霉素 [ 4- 6]。早在 1960年, Cyanam id就报道了发酵
生产纳他霉素的传统方法 [ 7] , 此后许多学者进行了
其发酵生产的研究 [ 8- 11]。由于纳他霉素生产菌均
为链霉菌,而在链霉菌中普遍存在野生型菌种抗生
素产量低和遗传不稳定的现象,因此,纳他霉素生产
菌种的选育成为研究的热点, 通过经典的诱变育
种、原生质体融合以及近年兴起的基因组重排和
基因工程等手段, 使得纳他霉素生产菌的生产能
力得到显著提高, 大大降低了工业生产成本,促进
了纳他霉素在食品工业、饲料和医药等许多领域
的广泛应用。
2010年第 9期 亓芳等 :纳他霉素及其生产菌育种研究进展
1 纳他霉素的特性
11 理化性质
纳他霉素是四烯大环内酯类抗生素,分子式 C33
H47NO13,分子量为 66573。其结晶粉末为无色、无
味、无臭、稳定的化合物, 几乎不溶于水和大部分有
机溶剂, 而在强极性有机溶剂中有较好的溶解性,
例如,吡咯烷酮 [ 12]。室温下水中的溶解度为 30-
100 mg /L,在 pH值低于 3或高于 9时, 其溶解度
都会有所提高, 在大多数食品 pH 值范围内较稳
定 [ 13]。纳他霉素是两性物质, 分子中有一个碱性
基团和一个酸性基团, 其电离常数 pK a值分别为
835和 46, 相应的等电点为 65, 熔点为 280 。
纳他霉素热稳定性很好, 可贮存在室温条件下,
50 放置几天或 100 短时间处理,其活性几乎无
损失。
12 纳他霉素的抑菌活性
作为真菌抑制剂,纳他霉素具有广谱性、专一性
和高效性。 1959年, K lis比较了纳他霉素、山梨酸、
放线菌酮、制霉菌素、龟裂霉素等的抑制效果, 发现
纳他霉素对 15种在肉汤和琼脂中培养的霉菌是最
有效的抑制剂。霉菌绝大多数在 05- 60mg /kg,
极个别菌种在 10- 25 mg /kg的纳他霉素浓度下被
抑制; 酵母多数在 10- 50mg /kg的纳他霉素浓度
下被抑制 [ 14] ; 1956年 T resner[ 15]经测试证明 1 -
10 g /mL剂量的纳他霉素对 500种供试的霉菌都
具有抑制作用,但对细菌和病毒则无效。白鹤 [ 16]研
究了纳他霉素对 7种主要果蔬贮藏中致病菌的抑菌
效果和最小抑菌浓度,其中对番茄灰霉病菌的最小
抑菌浓度最低, 为 0- 2 mg /L, 对曲霉的最小抑菌
浓度最高, 为 6- 8 mg /L, 对真菌、霉菌和酵母菌的
抑制作用明显高于山梨酸和山梨酸钾。
13 纳他霉素的抑菌机理
纳他霉素分子结构中的疏水部分即大环内酯
的双键部分经范德华力与真菌细胞质膜上的甾醇
分子结合, 结合的程度与膜的甾醇含量成正比, 形
成抗生素 ! ! ! 甾醇复合物, 引起细胞膜结构的改
变, 进而破坏细胞质膜的渗透性,造成细胞内物质
的泄漏 [ 17, 18] , 从而起到抗菌作用。细菌细胞壁没
有这些类似固醇的化合物, 故纳他霉素对细菌没
有抑制作用。
2 纳他霉素的应用
21 在植物病害防治中的应用
纳他霉素具有低剂量、高效率、抗菌作用时间长
等特点,是一种高效、安全的天然生物性抗真菌剂。
卢彩鸽等 [ 5]报道生防链霉菌 A01产生的以纳他霉
素为主要有效成分的活性产物对多种供试植物病原
真菌有很强的抑菌活性, 对番茄灰霉病的温室和田
间小区防治效果明显高于嘧霉胺和多抗霉素; 刘宇
等 [ 19]利用生防链霉菌 A02产生的纳他霉素处理番
茄幼苗,诱导番茄体内 2种防御酶活性的提高和酚
类物质的积累,增强了番茄植株对灰霉病的防御能
力; 纳他霉素在冬枣 [ 20]、苹果 [ 21]、草莓 [ 22]、蘑菇 [ 23]
的病害防治中均有较好的防治效果。
22 在食品中的应用
随着食品工业的发展, 安全高效的生物防腐剂
逐渐替代化学防腐剂已成为一种趋势。微生物种类
繁多、分布广泛、代谢产物多样性、生产周期短、产量
高,在天然防腐剂的开发制造中极具潜力。纳他霉
素难溶于水和油质,大部分摄入的纳他霉素会随粪
便排出,不会造成体内残留, 作为食品防腐剂具有极
高的安全性。纳他霉素作为一种抗真菌剂, 是国际
上被美国 FDA正式批准的仅有的两种生物防腐剂
之一 [ 24]。1996年, 中国食品添加剂委员会正式批
准纳他霉素可用作食品防腐剂在国内应用。纳他霉
素无特殊感官性状,抑制有害真菌而不作用于有益
菌群,作为一种天然生物性食品防腐剂和抗菌添加
剂, 目前已在 30多个国家广泛应用 [ 25] , 在乳制
品 [ 26]、果蔬冷藏 [ 27]、肉类 [ 28]、果汁 [ 29]、以及焙烤食
品 [ 30]中发挥了重要作用。
23 在饲料中的应用
Brothers等 [ 31] 2000年将 191株造成饲料污染的
曲霉接入含有纳他霉素浓度为 0- 200mg /L的梯度
固体培养基中, 均受到抑制, 其中浓度在 508 -
401 mg /L范围时对烟曲霉和寄生曲霉有较好抑制
作用;亓珊等 [ 32]对纳他霉素在家禽养殖中的应用进
行了报道,在家禽饲料、饮水及环境中加入有效剂量
的纳他霉素,能有效控制曲霉菌、酵母菌引起的家禽
疾病。
24 在医药中的应用
纳他霉素在治疗真菌引起的疾病方面有很好的
43
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 9期
应用前景。袁东兵等 [ 33]报道了纳他霉素在真菌性
角膜炎中有良好的治疗效果;郑大凤等 [ 34]报道采用
氟康唑联合纳他霉素滴眼液治疗真菌性角膜溃疡,
取得了满意的效果。
25 在文物保护中的应用
吴昊等 [ 35]研究纳他霉素在 05 mg /g浓度时对
丝织品上黑曲霉、青霉、毛霉抑制效果明显, 且对白
色丝织品的色泽和机械强度无破坏性影响, 在丝织
品文物防霉上有应用前景。
3 纳他霉素生产菌的菌种选育
31 诱变育种
311 紫外诱变 紫外线是一种使用最早、沿用最
久、应用广泛、效果明显的物理诱变剂, 在抗生素产
生菌的育种中发挥了重要作用 [ 36, 37] , 也是纳他霉素
生产菌育种常用手段之一。但某一菌株长期使用一
种诱变剂, 易产生诱变剂 ∀疲劳效应 #现象, 还会引
起菌种生长周期延长、孢子量减少、代谢减慢等,对
发酵工艺的控制不利; 在实际生产中采用紫外照射
结合其它诱变剂复合处理的方法进行菌株诱变,可
提高诱变效率。
邬建国等 [ 38]以褐黄孢链霉菌为出发菌株, 经紫
外诱变、硫酸链霉素抗性筛选获得了 10%的正突变
率,育出了高产突变株 SG2002, 产量达 265 g /L,
为出发菌株的 161% ; 杨东靖 [ 39]使用硫酸二乙酯
( DES)和紫外线对褐黄饱链霉菌 ATCC 13326进行
诱变处理,利用链霉素抗性筛选法进行初筛,摇瓶复
筛,获得纳他霉素产量达到 241 g /L的高产菌株
SG56。骆健美 [ 40]以褐黄孢链霉菌 SG14为出发菌
株,经上述同样的诱变处理, 并选用 2脱氧D葡萄
糖、乙酸钠、丙酸钠、硫酸链霉素作为抗性筛选剂,最
终选育出高产纳他霉素的突变株 SG916, 其摇瓶发
酵产量提高了 280%。
总结前人的经验可知,纳他霉素生产菌紫外诱
变时, 适宜的紫外照射剂量在 30- 60 s之间, 一般
普遍选用硫酸链霉素进行抗性筛选, 诱变后的突变
株阳性效率为 10% 左右, 产量较出发菌株提高
20% - 50%。此方法操作步骤简单, 对仪器设备要
求不高,有的试验者利用超净工作台中的紫外灯也
能得到很好的试验结果;而经复合诱变后,产量平均
提高幅度可达到 90%以上,较单纯的紫外诱变更为
行之有效。
312 电脉冲强光诱变 应用一定剂量的脉冲强
光照射对孢子悬浮液进行诱变, 然后应用抗性筛选
法筛选突变株,即电脉冲强光育种。孟宪军等 [ 41 ]采
用电脉冲强光对纳塔尔链霉菌进行诱变处理, 硫酸
链霉素平板进行筛选,选育出一株正突变株 SN114,
在同等发酵条件下, 纳他霉素产量达到 1098 g /L,
比出发菌株提高了 16倍,传代 5次遗传性状稳定。
电脉冲强光育种手段能有效提高纳他霉素产
量, 得到遗传性状稳定的高产菌株, 且操作简单, 适
用于大多数实验室。
313 航天诱变 近年来, 人们利用科学返回卫
星、空间站及航天飞机等空间飞行器搭载微生物材
料, 进行空间诱变育种, 通过外层空间特殊的物理化
学环境,引起菌种 DNA分子的变异和重组, 从而得
到生物效价更高的高产菌种。
1987年以来, 中国科学院微生物研究所等单位
先后利用卫星搭载了真菌、酵母、放线菌、细菌等 30
多种微生物菌种, 从中选择培育出了一些能提高抗
生素和酶产量的新菌种。此方法也已应用于纳他霉
素生产菌的育种, L iang等 [ 42]以褐黄孢链霉菌为出
发菌株,利用太空育种手段, 获得纳他霉素产量为
1412 g /L的高产菌株 LK45。
32 原生质体育种
由于常规杂交受亲和力的影响, 杂交受到一定
的局限,为此人们探索了多种更为有效的基因重组
方法,原生质体融合是迅速发展起来的杂交育种技
术之一。 20世纪 70年代以来,各种原生质体操作
技术已成为工业微生物育种的重要手段,并取得较
大成就。原生质体即细胞壁被酶水解剥离, 剩下由
原生质膜包围着的原生质部分, 其特点为失去细胞
壁后,原生质体对外界环境变化更为敏感,诱变效应
更为强烈。以微生物原生质体为材料的常见育种方
法有原生质体再生育种,原生质体诱变育种,原生质
体转化育种,原生质体融合育种以及其它原生质体
育种等 [ 36]。纳他霉素生产菌育种中应用的主要手
段有原生质体诱变育种,原生质体融合育种。
321 原生质体诱变育种 原生质体诱变育种是
以原生质体为材料,采用物理和化学诱变进行处理,
然后分离到再生培养基中再生, 并从中筛选高产菌
44
2010年第 9期 亓芳等 :纳他霉素及其生产菌育种研究进展
株。此项技术的关键是原生质体的制备与再生,在
纳他霉素生产菌育种中得到很好应用。
王艳婷等 [ 43]以纳他霉素生产菌褐黄孢链霉菌
SG2002为出发菌株, 对原生质体制备和再生条件
进行优化,在得出的最佳条件下,原生质体形成量达
到 40 ∃ 106个 /mL, 再生率为 90% ,比优化前提高
了 110%; 李荷迪等 [ 44 ]研究了褐黄孢链霉菌原生质
体的最佳制备和再生条件,原生质体再生后, 733%的
菌种产量得到了提高, 其中 5 - 12菌株增产 747
% ,达到 212 g /L; 在此基础上进行原生质体紫外
诱变, 得到的 5个突变株产量均有提高, 其中菌株
UV22增产 10709%, 达到 252 g /L。
在纳他霉素生产菌育种上, 原生质体紫外诱变
育种产量提高幅度大于常规紫外诱变的, 这可能与
原生质体对诱变剂的高敏感性有关, 但很大程度上
说明原生质体再生本身就是链霉菌的一种育种方
法 [ 45]。
322 原生质体融合育种 原生质体融合育种是
近几十年发展起来的基因重组技术手段, 通过两个
遗传性状不同的亲株原生质体融合而达到杂交
目的 [ 36]。
郑凤娥 [ 46]利用电脉冲强光和硫酸二乙酯分别
诱变纳塔尔链霉菌和恰塔努加链霉菌, 筛选得到高
产菌 SN1142 ( S. na talensis )和 SC2164 ( S. cha tta
noogensis) ,产量分别为原始菌株的 16倍和 131
倍,以这两株高产菌株作为亲本,进行原生质体融合
育种, 采用单亲紫外灭活结合抗药性筛选,得到产量
为 245 g /L的纳他霉素高产菌 Sr1菌株,条件优化
可达 317 g /L,产量为原始菌株的 36倍。
原生质体融合技术不仅提高抗生素产量, 且大
大提高基因间重组频率, 易于得到两个或多个亲本
性状的重组体杂种。由于解除了遗传物质交流的最
大屏障细胞壁, 可实现种间或更远缘基因交流。有
报道认为,利用原生质体融合可获得新的抗生素物
质 [ 47] ,这将为纳他霉素生产菌育种提供新的思路。
33 基因组重排育种
基因组重排 ( genome shuffling )是 21世纪崛起
的新的杂交育种技术 [ 48 ] ,亦称为基因组改组,其核
心是多亲本杂交, 具有以下优势 [ 49] : ( 1)重排的对
象是细胞内整套基因组,有利于微生物表型的改进;
( 2)采用的具体方法是循环原生质体融合 ( recursive
protoplast fusion),产生同源重组的几率要比常规原
生质体融合高得多,能产生各种各样的突变组合,从
而达到快速进化微生物表型的目的; ( 3)无需了解
微生物的代谢途径、编码生物合成酶的基因以及基
因表达调控的背景,因此尤其适用于微生物次级代
谢产物生产菌的遗传改造。
朱惠等 [ 49]以褐黄孢链霉菌 SG1的原生质体为
材料经紫外诱变并筛选链霉素抗性菌株, 选择 4株
高产突变株为亲本进行基因组重排, 得到了高产重
排菌株 S. gilvosporeus GS74,纳他霉素产量为 3574
g /L,比原始出发菌株 SG1提高 117倍。可以预
见, 基因组重排技术对于生物合成的遗传背景尚未
完全明确的纳他霉素产生菌的改造将产生极大影
响, 促进其菌种选育研究的飞速发展。
34 基因工程育种
基因工程育种包括所有利用 DNA重组技术将
外源基因导入到微生物细胞, 使后者获得前者的某
些优良性状或者利用后者作为表达场所来生产目的
产物的方法 [ 36]。由于抗生素为次级代谢产物,其合
成的基因和机制较复杂, 因此基因工程在抗生素生
产菌研究方面起步较晚, 但成绩可喜。 20世纪 80
年代,链霉菌遗传转化系统的建立和运用实现了链
霉菌基因的克隆 [ 50]。 1983年 Hopw ood等首次利用
链霉菌宿主 载体系统克隆到抗生素的生物合成基
因。随着分子克隆技术的发展, 已形成大量有用的
载体系列。多种抗生素的生物合成基因获得成功克
隆和表达,其生物合成机理的研究也较深入和全面。
1999年, A paricio等 [ 51 ]研究了纳塔尔链霉菌的 26
元环生物合成基因簇, 发现其染色体组包含 110 kb
碱基对, 报道了两个主要的基因 p imS0和 pimS1, 前
者编码一个相对较小 (约 193 kD)的乙酸激活聚酮
合酶 ( PKS)基因,它被看成一个转载蛋白, 后者编码
一个大约 710 kD的多酶基因, 导致形成多稀发色
团。 2000年, M endes等 [ 52]研究报道了纳塔尔链霉
菌中的一个隐藏质粒 pSNA1的基因图谱和全部核
苷酸序列, DNA分子大小为 9 367 bp, G + C的含量
占 713%。 pSNA 1包含 7个开放阅读框, ORF 1 -
ORF 7,其中 ORF 3负责编码 1个含有 476个氨基
酸的蛋白,与链霉菌质粒中复制滚环机制相关蛋白
45
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 9期
有较高的序列相似度。 2001年, M endes等 [ 53 ]报道
了从纳塔尔链霉菌中获得的一个目的基因片段
pimD,它编码的细胞色素 P450氧化酶负责将 4, 5
去环氧匹马霉素 ( 4, 5deepoxypimaric in)转变成匹
马霉素。Du等 [ 54 ]从恰塔努加链霉菌菌株 L10中获
得了 ScnR%基因的部分序列和 ScnR&的全部序
列,这两个基因与纳他霉素生物合成调控基因是同
源基因,将 ScnR&基因转入到恰塔努加链霉菌菌株
中,使得 ScnR&基因在其染色体中过量表达,得到
工程菌 D1。
基因工程育种弥补了传统育种的盲目性和随机
型,定向筛选菌株势必成为菌株选育的主要手段
之一。
4 小结与展望
目前纳他霉素生产菌菌株选育的手段有诱变育
种、原生质体育种、基因组重排育种和基因工程育
种,这些育种手段各有千秋。诱变育种是实验室常
规育种手段,其操作简单、成本低, 不需要了解菌株
的遗传背景; 但诱变育种正突变率低, 筛选工作量
大,故构建一种快速有效的筛选模式是试验成功的
关键。原生质体育种是基于基因工程技术的育种方
法,在纳他霉素生产菌育种中发挥重要作用。原生
质体的制备与再生是试验的核心, 得到较高活性的
原生质体是试验顺利进行的基础。基因组重排采用
多亲本循环原生质体融合技术对微生物整套基因组
进行重排,使得同源重组的几率大大提高,且其无需
了解微生物的代谢途径及其遗传背景,可操作性强,
为大多数次级代谢产物生产菌的基因重组提供了可
能。鉴于目前对纳他霉素的遗传背景和生物合成途
径尚未完全清楚,基因组重排技术在纳他霉素生产
菌的遗传改造中将占据重要地位。随着分子生物学
的快速发展,越来越多的研究开始转向纳他霉素生
物合成的机理,在对菌株遗传背景和代谢途径充分
了解后,基因工程技术可有目的地提高目标产物的
产量, 实现真正的定向选育,将是纳他霉素生产菌育
种最具前景的手段。
参 考 文 献
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