全 文 ：
综述与专论

生物技术通报
BIOTECHNOLOGY
BULLETIN 2011年第 5期
呼吸道合胞病毒非结构蛋白 NS1、NS2的研究进展
卜选运
(昆明理工大学生命科学与技术学院,昆明 650224 )


摘
要:
呼吸道合胞病毒 ( resp ira tory syncytia l v irus, RSV )是引起婴幼儿和老年人下呼吸道感染的重要病原体之一。由
于该病毒的致病机理还不太清楚导致目前尚无有效治疗 RSV的方法。研究表明, 呼吸道合胞病毒的非结构蛋白 NS1、NS2具
有抗细胞凋亡的作用 ,同时可以逃避宿主免疫系统 ( IFN )对病毒的干扰,有利于病毒复制。敲除这两种基因的减毒活疫苗和
表达沉默 NS1的小干扰 RNA ( siRNA )的质粒研究已经取得了一定的进展。对非结构蛋白功能的深入研究有助于了解 RSV的
致病机理, 同时为预防和治疗 RSV感染奠定理论基础。
关键词:
呼吸道合胞病毒 NS1 NS2 IFN 减毒活疫苗 siRSV-NS1
Research Development of RSV Nonstructural ProteinsNS1 and NS2
Bu Xuanyun
(College of Life Sciences, Kunm ing University of Science and T echnology, K unm ing 650224)


Abstrac:t
Human respiratory syncy tia l v irus ( RSV ) is one o f the most important pathogen of ser ious resp ira to ry tract illness in
infants and ch ildren as we ll as o ld people. The w ay of how to lead to d isease is still no t v ery c lear now, so that w e still don
t know how
to therapy the RSV infection. The research proved that RSV nonstructural pro teins NS1 and NS2 suppress prem ature apoptos is and es-
cape from the IFN to pro tect to benefit for the replica tion o f v irus. The RSV vaccine of wh ich is attenua ted by deleted NS gene and the
p lasm ids encod ing sm a ll interfer ing RNAs fo rNS1 is deep ly researched. The resea rch o f nonstructural pro teins w ill he lp us to do deeper
research of the w ay how does RSV lead to d isease, w ill g ive us basis o f the prophy lax is and therapy aga inst RSV infection o f hum ans.
Key words:
Resp ira to ry syncytial v irus NS1 NS2 IFN L ive-a ttenuated vacc ine siRSV-NS1
收稿日期: 2011-01-24
作者简介:卜选运,女,硕士研究生,研究方向:微生物学; E-m ai:l buxuanyun@ 126. com
呼吸道合胞病毒 ( resp iratory syncy tial v irus,
RSV )是儿科病毒性呼吸道感染最主要的病原体,也
是免疫低下者或老年人发病致死的主要原因。RSV
属副黏病毒科,肺病毒属,单股负链 RNA病毒, 病毒
直径为 120- 300 nm,基因组大小为 15 222 bp,含有
10个基因, 编码 11种蛋白, 分别为 3种囊膜蛋白
( F、G和 SH )、2种基质蛋白 (M、M2)、3种核衣壳蛋
白 ( N、P和 L)和 2种非结构蛋白 ( nonstructural pro-
teins, NS) ( NS1、NS2)。
非结构蛋白 NS包括 NS1 ( 139个氨基酸 )和
NS2( 124个氨基酸 )。它们是 RSV感染过程中最先
转录的两个基因单位,在感染细胞初期大量表达,有
利于病毒的复制,但是并不参与病毒包装,不具备抗
原表位,在疫苗研究中很少作为亚单位疫苗。现在
NS的作用机理不太清楚,还没有有效的 RSV疫苗
上市的情况下,随着对 RSV的研究越来越深入, NS
的分子作用机制已成为研究热点之一,它为如何防
治呼吸道合胞病毒的感染提供了思路。
1
NS的功能
NS1和 NS2在病毒感染早期大量表达, 被感染
细胞的凋亡时间相对较晚。在被感染细胞中用 siR-
NA沉默 NS基因表达, RSV抗凋亡功能消失, 细胞
出现早凋亡, 用敲除 NS基因的重组 RSV (
NS
RSV)感染细胞也有同样的结果, 说明 NS蛋白具有
抗凋亡的作用 [ 1]。用携带 NS基因的狂犬病毒 ( ra-
b ies v iruses, RV )分别和共感染牛肾细胞 (M adin-
darby bov ine kidney, MDBK ), 共感染携带 NS1和
NS2基因的 RV在添加 150 IU IFN-
时病毒滴度仍
生物技术通报 B iotechnology
Bulletin 2011年第 5期
未降低, 说明 NS1和 NS2有协同保护病毒复制的
功能 [ 2]。
2
NS抗凋亡和逃避 IFN的分子作用机制
2
1
NS的抗凋亡分子作用机制
RSV通过 NS1、NS2延迟细胞凋亡以利于病毒
复制。很多抗凋亡因子在 RSV感染细胞早期被 NS
蛋白激活, 其中包括核因子
B ( NF-
B )、磷酸化的
蛋白激酶 AKT、磷酸肌醇依赖性蛋白激酶和糖原合
酶激酶,这些被激活的抗凋亡因子可以抑制细胞凋
亡。用含 NS1、NS2基因的质粒转染细胞发现, 两者
可以通过联合作用抑制 TNF
介导的细胞凋亡,两
者协同作用比单个蛋白可以更好地抗凋亡。NS蛋
白通过一种独立于 IFN和早期激活表皮生长因子受
体 ( early activat ion of epiderm al grow th factor recep-
to r, EGFR)通路的新通路 AKT通路、NF-
B通路延
迟细胞凋亡提高 RSV复制 [ 1]。
2
2
NS逃避 IFN的分子作用机制
2
2
1
NS下调 I型 IFN的机理
病毒 DNA或
RNA可以诱发机体产生 I型 IFN, 这些都是通过调
节酪氨酸激酶 -信号转导子和转录激活子 ( janus
kinase-signa l transducer and act ivator o f transcription,
JAK-STAT )信号通路实现的。转录激活因子 ( signal
transducer and activator of transcription, STAT)可与靶
基因调控区 DNA结合、偶联酪氨酸磷酸化信号进行
信号转导及激活基因转录,从而发挥转录调控作用。
转录激活因子 1( STAT1)是 STAT家族发现的
第一个成员, 可以被 INF-
、INF-
、EGF、PDGF和
IL6激活, 它介导表达的基因对机体抵抗刺激物和
病原体具有重要作用。用人肺腺癌细胞株 A549转
染野生型 RSV ( wRSV ) , 并对细胞核和细胞质提取
物进行分析表明, NS1与 STAT1都转移到了细胞
核, NS1利用输入蛋白 a5( importin-a5)转移到细胞
核,并竞争性的与 importin-a5结合使后者不能与
STAT1相互作用, 从而使 STAT1介导的基因表达减
少 [ 3] ,降低了 I型 IFN的产生。
RSV 通过特异性的下调转录激活因子 2
( STAT2)的蛋白表达来降低信号转导逃避宿主 I型
IFN应答。下调 STAT2需要蛋白酶体活性,同时依
赖 RSV NS1和 NS2蛋白的表达, 泛素连接酶 E3
( ubiquitin ligase ( E3) enzymes)可以将 STAT2泛素
化, 泛素化的 STAT2可以被蛋白酶体识别, 从而被
降解, E 3连接酶活性是 RSV降低 STAT2能力的关
键。E3连接酶家族含有能与延伸蛋白 ( elong in C )
相互作用的 VxxLxxxCxxx( A / I/L /V )简并序列和能
与滞蛋白 ( cullin 2)结合的指环结构。NS1含有能
与 elong in C相互作用只在第 12个残基上不一样的
类似简并序列,同时与能和 cu llin 2结合的蛋白存在
序列同源性, NS1在体外可以和 elong in C和 cu llin 2
相互作用,说明 NS1可能是一种 E3连接酶 [ 4 ]。NS2
可以导致 STAT2水平降低或 I型 IFN依赖信号的消
失 [ 5] , 还没有相关试验证明 NS2是一种 E3连接酶。
2
2
2
NS下调 I型 IFN的受体通路 抵抗病毒性
感染的先天免疫反应以快速产生特异性细胞因子为
特征,最显著的是 I型 IFN。 I型 IFN又称为抗病毒
干扰素,通过两条不同受体通路诱导产生,分别为维
甲酸诱导 I型基因 ( retino ic ac id induced gene-I, R IG-
I)样受体和 To ll样受体 ( To l-l like receptor, TLR )
通路。
2
2
2
1
RIG-I样受体通路 RIG-I样受体 ( R IG-I-
like receptor, RLR )能够识别细胞质中的病毒 RNA,通
过 R IG-I样受体级联信号诱导 I型 IFN和促炎症细胞
因子的产生,对抗病毒天然免疫的建立起着非常重要
的作用, RLR信号通路能够作为病毒逃避宿主 I型
IFN的靶点。NS1通过封闭 RIG-I与线粒体抗病毒信
号蛋白 ( m itochondrial antiv iral signaling prote in, MA-
VS)相互作用阻碍 I型 IFN反应。用 rRSV或
NS1
RSV感染人肺腺癌细胞株 A549细胞做对比试验,
NS1竞争性的与 MAVS结合导致 MAVS与 R IG-I无
法相互作用,最终导致 IFN-
的生成减少 [ 6]。
NS2与 RIG-I相互作用抑制 IFN-
转录, 整个
相互作用要经历一系列过程。病毒复制产物被胞质
R IG样解旋酶家族 ( RIG-like helicase fam ily )识别,
其中包括 RIG-I和黑色素瘤分化抗原 5( me lanoma
d ifferent iat ion ant igen 5, MDA-5)。R IG-I、MDA-5与
MAVS通过半胱天冬酶招募结构域 ( caspase recrui-t
ment doma ins, CARD )相互作用, 导致 IRF-3的磷酸
化并多聚化,之后转移进细胞核,与激活蛋白-1( ac-
tivating pro te in-1, AP-1)、NF-
B相互作用激活 IFN-

的转录。NS2可以和 R IG-I的 CARD结构域结合
导致 R IG-I无法与下游的 MAVS相互结合, 从而抑
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2011年第 5期 卜选运等:呼吸道合胞病毒非结构蛋白 NS1、NS2的研究进展
制了 R IG-I介导的 IFN-
启动子活化 [ 7]。
2
2
2
2
Toll样受体通路 Toll样受体是参与天
然免疫的一类重要蛋白质分子, 在 I型 IFN的诱导
中起重要作用。NS2可以抑制 To ll样受体 3( To l-l
like receptor3, TIR3 )介导的 IFN表达。 TLR3通过
用诱导 IFN-
To ll样受体相关区域连结蛋白 ( T IR
doma in-conta in ing adapter induc ing in terferon IFN-
,
TR IF)激活 IRF3的激酶 IKK
、TBK-1来诱导 IFN-

的表达。用沉默 TLR3的 siRNA可以在侵染晚期关
闭 IFN的诱导, 说明 TLR3是晚期诱导 IFN-
的主
要因子。虽然 NS2并不与 TRIF特异性结合, 却可
以抑制由 TRIF介导的 IFN-
诱导, 说明 NS2可能
与下游分子相互作用,最终达到抑制 IFN-
表达的
作用 [ 7]。
3
NS在预防与治疗 RSV中的应用
3
1
NS在 RSV减毒活疫苗中的应用
在早期 IFN-
和 IFN-
反应过程中两个主要的
转录因子是 IRF-3和 NF-
B。感染早期 HRSV和

NS1 /NS2 RSV激活 IRF-3的能力十分相似,但是
当 NS1和 NS2大量表达时, 它们会共同抑制 IRF3
表达, NS2的大量表达也会抑制 NF-
B的活性。已
有资料报道, 激活宿主转录因子或增加 IFN
/
生
成会促使表皮细胞生成促炎因子 [ 8]。
NS1 /NS2
RSV或
NS1NS2RSV产生的促炎因子包括调节活
化正常 T细胞表达和分泌的趋化因子 ( regulated on
activat ion norma l T-cell expressed and secreted, RAN-
TES)、TNF
、IL-8比 wRSV 有所减少 [ 9] , 所以

NS1 /NS2 RSV或
NS1NS2 RSV可以作为候选减
毒活疫苗。
研究发现,将
NS1 RSV通过呼吸道对黑猩猩
进行给药产生中和抗体的水平和 w RSV差别不大。
cpts248 /404是一种对 1- 2个月婴儿上呼吸道有轻
微反应原性的 RSV减毒活疫苗,
NS1 RSV在上呼
吸道中限制病毒复制的能力比 cpts248 /404强 10倍
以上,同时产生的中和抗体水平是后者的 3倍, 说明

NS1 RSV是对 1- 2个月婴儿来说比较合适的候
选减毒活疫苗 [ 10]。
S tephen等 [ 11]用
NS2 RSV对黑猩猩给药, 结
果发现
NS2 RSV在上呼吸道中的复制能力没有变
化,在下呼吸道却急剧降低,给药后攻毒试验证明其
具有免疫保护性。相对 wRSV来说, 用
NS2 RSV
给药时黑猩猩的鼻腔分泌物明显减少。该试验证
明, 用
NS2 RSV可以作为预防婴幼儿感染 RSV候
选减毒活疫苗。
3
2
以 NS为靶点的 siRNA在预防和治疗 RSV中的
应用
表达沉默 NS1基因的 siRNA的质粒 ( siRNA s o f
silencing the NS1 gene, siRNA-NS1)可以显著降低
RSV在人体上皮细胞中的复制, 为以后 siRSV-NS1
作为预防和治疗 RSV的感染提供了基础 [ 12]。用
siRSV-NS1对小鼠鼻内给药后进行攻毒试验, 发现
siRSV-NS1可以保护小鼠不被感染。同时, 可以有
效地预防由于 RSV感染所导致的炎症反应和哮喘
相关的呼吸道反应。因此, s iRSV-NS1可以作为预
防 RSV感染引发哮喘的工具 [ 13]。
siRNA-NS1与壳多糖纳米微粒混合后, 对小鼠
鼻内给药并攻毒, 结果小鼠肺中的病毒滴度明显降
低, 炎症反应和呼吸道反应也明显减少, 脾脏中
CD4
+和 CD8+ T细胞产生 IFN-
的水平上升, 一个
月后肺部的记忆 CD8+ T细胞增加,小鼠再次被感染
的几率显著降低。以上充分证明, s iRSV-NS1可以
有效预防或治疗 RSV感染 [ 14]。
4
结语
对 RSV NS1和 NS2的功能、作用机理方面的深
入研究,为有效预防和治疗 RSV感染奠定了理论基
础。以 NS1和 NS2为靶点研制出的减毒活疫苗已
经进入临床阶段, 相关的 siRNA研究也进入临床前
期, 为有效防治 RSV感染引起的呼吸道疾病带来了
新的希望。
参 考 文 献
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