全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 1期
猪 干扰素的克隆表达及单抗的潜在应用
娄忠子 兰喜 李建强 李学瑞 李志勇 殷相平 柳纪省
(中国农业科学院兰州兽医研究所传染病室 家畜疫病病原生物学国家重点实验室
农业部草食动物疫病重点开放实验室 农业部兽医公共卫生重点开放实验室,兰州 730046)
摘 要: 以刀豆素 A( ConA )刺激长白猪外周血单个核细胞 ( PBMC), 提取的总 RNA为模板, 采用一步法 RTPCR扩增
出包含猪 干扰素 ( PoIFN)完整基因的片段。将完整的 PoIFN基因亚克隆到 pET32a( + )上, 构建 pETIFN融合表达
载体, 转化入 Rose tta( DE3)后 IPTG诱导表达, 得到大小约为 368 kD的目的蛋白。将目的蛋白检测及纯化后免疫后 BALB / c
小鼠, 取脾细胞与 SP2 /0细胞融合,最终筛选出 3株能稳定分泌抗猪 IFN单克隆抗体的杂交瘤细胞。 ELISA叠加试验显示,
3株单抗针对相同或邻近的 Po IFN抗原表位, 制备的腹水中单抗间接 ELISA 效价为 1 104。选取单抗 IF2株进行单抗的
潜在应用研究, W estern blotting分析结果显示单抗 IF2株能与融合表达蛋白产生特异性反应,与 pET32a( + )标签蛋白无反
应; 间接免疫荧光检测 ( IFA )发现, 在采用腺病毒表达系统表达 Po IFN的 HEK293细胞中散在大量特异性荧光。
关键词: 猪 干扰素 融合表达 单克隆抗体 潜在应用
Preparation and Potential Application ofMonoclonalAntibody Against
Porcine IFNCloned and Expressed inE. coli
Lou Zhongz i Lan X i L i Jianqiang L iXueru i L i Zhiyong Y in X iangping L iu Jixing
(A nimal InfectiousD iseasesResearch Laboratory, Lanzhou Veterinary Research Institute, Chinese A cademy of A gricultural Sciences,
S tateK ey Laboratory of Veterinary EtiologicalB iology, K ey Laboratory of Grazing AnimalD iseases of M inistry of Agriculture,
K ey Laboratory of Veterinary PublicH ealth of M inistry of Agriculture, Lanzhou 730046)
Abstrac:t The total RNA w as ex tracted as tem plate from per iphera l blood m ononuclear ce lls( PBM C) wh ich we re iso lated from
Landrace p ig s and stimu lated w ith concanava line A ( ConA ) to amp lify porcine interferon gamm a gene( PoIFN). The am plicon wh ich
conta ined the com plete PoIFN gene w as am plified by one step RTPCR. The comp lete Po IFN gene w as subc loned into pET32a
( + ) to construct pETIFN recom binant fusion express ion vec tor. The recomb inant vector w as transform ed into Rose tta( DE3) E. co li
and expressed by induction of IPTG. Them o lecularw e ight of recomb inan t pro te in w ere 36 8 kD detected by SDSPAGE. A fter de tection
and pur ifica tion, the fusion prote in w as utilized to imm un ize BALB /c m ice, and spleen ce lls were collec ted to fuse w ith SP2 /0 m ye lom a
ce lls. Three m onoc lonal hybr idom a cell lines tha t stab ly secreted monoclona l antibodies w ere genera ted a fter a series o f sc reening.
EL ISA additiv ity test ind ica ted that the three stra ins of m onoc lonal antibod ies recognized a same o r nearby epitope. The three ascitic
mAbs have a sam e antibody titre o f 1 104 detected by ind irect EL ISA. IF2 strain was se lected to develop po tential applica tion by w est
e rn b lo tting and IFA. Positiv e signal could be detec ted be tw een expressed Po IFN and IF2, but negative signa l be tw een H istag pro
te in and IF2 in w estern b lo tting; spec ific fluo rescence cou ld be detected in HEK293 ce lls ino culated w ith recomb inant adenov ir
us w hich w ere constructed for express ing Po IFN in IFA.
Key words: Po rc ine interfe ron gamm a Fus ion expression M onoc lonal antibody Potentia l application
收稿日期: 20090911
基金项目:科研院所社会公益研究专项 ( 2005DIB4 J041)
作者简介:娄忠子,男,在读博士研究生,研究方向:分子病毒学; Em ai:l zhongzilou@ hotm ai.l com
通讯作者:柳纪省,男,农学博士,博士生导师,研究员; Em a i:l liu jix ing@ hotm ai.l com
干扰素 ( Interferon, IFN )可分为 !型与 ∀型两
大类, !型包括 IFN、IFN 以及新近发现的 IFN
!、IFN∀、IFN#、IFN∃、IFN%等类型; ∀型目前只包
含 IFN一种类型。 IFN主要由单核细胞产生;
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 1期
IFN 主要由纤维母细胞产生, 血管内皮细胞也可
产生; IFN 由抗原,刀豆素 A ( ConA)及植物凝集素
( PHA )等有丝分裂原刺激 T细胞、NK细胞或巨噬
细胞后产生。单核巨噬细胞分泌的 TNF以及 IL
18也能够刺激 NK细胞产生 IFN。细菌脂多糖
( LPS)可诱导巨噬细胞和噬中性粒细胞产生白细胞
介素12( IL12) ,继而诱导 IFN基因在 CD4+ T细
胞中的表达和分泌。 IFN是一类具有广泛生物学活
性的蛋白质,具有调节机体的免疫功能、抗病毒和抗
肿瘤等多种作用,是机体防御系统的重要组成部分,
具有严格的种属特异性及选择性, 并且不在正常情
况下的组织或血清中存在, 只能在某些特定因素的
作用下才能诱使细胞产生。自 Isaacs和 Linden
mann
[ 1]于 1957年首次发现干扰素的存在以来,各种
动物和类型的干扰素相继被发现并克隆。D ijikmans
等 [ 2]首先克隆了含内含子的猪 干扰素 ( Po IFN)
基因;谢海燕等 [ 3]采用 PCR技术从长白猪的肝组织
基因中克隆得到了 Po IFN基因;夏春等 [ 4]首次克隆
得到了猪 IFN 基因;郭瀛军等 [ 5]于 2001年报道国
内首次克隆出了猪 IFN基因序。曹瑞兵等 [ 6]从经
ConA诱导培养的猪外周血白细胞中扩增出猪 IFN
基因,经改造后插入原核表达载体 pRLG,并实现
了在大肠杆菌中的高效表达。针对不同种干扰素所
制备的单克隆抗体及其应用也多有报道, 早在 1984
年戚中田就报道国外已进行了人的 、 和 干扰
素单克隆抗体的制备和应用研究 [ 7]。而国内针对
畜禽干扰素单抗制备的研究报道也逐渐增多, 李瑞
芳等 [ 8]制备了抗 Bo IFN的单抗, 并对其特异性和
应用进行了研究;戴华等 [ 9 ]制备抗鸡 干扰素单克
隆抗体;余斌等 [ 10]则制备了抗猪 IFN单克隆抗体
并对其应用进行了分析。本研究通过 ConA体外刺
激猪外周血单个核细胞, 提取细胞的总 RNA为模
板,扩增出 PoIFN基因, 并进行了原核表达。融合
表达蛋白免疫 BALB / c小鼠制备单克隆抗体,并对
单克隆抗体在对 Po IFN 蛋白进行检测时的应用效
果进行了研究。
1 材料与方法
11 材料
111 菌株与质粒 大肠杆菌 JM 109菌株, Rosetta
( DE3)菌株和 pET32a( + )由家畜疫病病原生物学
国家重点实验室保存; pMD18T Simp le载体购自宝
生物工程 (大连 )有限公司。
112 酶类和试剂 PR IM 1640, 胎牛血清为
G IBCO公司产品; ConA和淋巴细胞分离液为上海
生物工程公司产品; One Step RNA PCR K it( AMV ),
限制性内切酶 BamH!和H ind #, DNA M arkers &
EcoT14! d iges,t DL 2 000均购自宝生物工程 (大连 )
有限公司; T4 DNA连接酶购自美国 NEB公司;质粒
提取试剂盒和 DNA片段回收试剂盒购自天根生物
公司; 蛋白分子 Marker购自 Fermentas(MB I)公司;
NC膜购自上海闪晶生物;羊抗鼠 IgG酶标二抗购自
So larbio公司, 6 H is标签抗体购自北京中杉金桥
公司; DAB显色试剂购于武汉博士德公司; 快速
ELISA鼠单抗分型试剂盒购自 Thermo公司。
12 方法
121 引物设计与合成 根据 GenBank上已登录的
PoIFN序列 (登录号: AY188090), 采用 O ligo 60软
件,设计合成扩增包含完整 PoIFN开放阅读框序
列的引物 Po IFN 1和用于表达完整的 Po IFN开放
阅读框的表达用引物 PoIFN2, 两对引物序列见表
1,划线斜体表示引入的酶切位点, 上游引物中为
BamH !,下游引物中为 H ind #。引物合成由宝生
物工程 (大连 )有限公司完成。
表 1 用于克隆和表达 PoIFN序列的引物
引物名称 序列
PoIFN1 F5∃AGAAGCTAACTCTCTCC 3∃
R5∃TATGTTAATAGATACCC 3∃
PoIFN2 F5∃CGGGATCCATGAGTTATACAACTT 3∃
R5∃GCGTCGACTTATTTTGATGCTCTC 3∃
122 猪外周血单个核细胞的分离及诱导培养
无菌采取健康长白猪外周血 20 mL, 置于含有抗凝
素的离心管中, 用淋巴分离液分离白细胞。用含
10% 胎牛血清和 2%双抗 ( 100 ∋g /∋L的青霉素和
100 ∋g /∋L的链霉素 )的 PRIM 1640稀释至 1 106
个 /mL,加入 6孔板中,每孔 2 mL, 37 % 下含 5%的
CO 2培养箱中培养 12 h, 细胞换液并加入终浓度为
15 ∋g /mL的 ConA,继续在培养箱中培养 6- 24 h。
123 ConA诱导后外周血淋巴细胞总 RNA的提取
采用 TrizolReagen t提取 ConA诱导后 8- 24 h长白
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2010年第 1期 娄忠子等:猪 干扰素的克隆表达及单抗的潜在应用
猪外周血单个核细胞总 RNA。离心沉淀细胞, 每 5-
10 106个细胞加 1mL Trizo l后,剧烈振荡以裂解细
胞,裂解液转入新 EP管中室温下放置 5 m in; 按照
每 1mL Trizol加 02mL氯仿的量加入氯仿,用力震
荡 15 s并室温下放置 2- 3m in后, 4% 下 12 000g离
心 15m in,取上层水相置于新 EP管中,按照每 1mL
Trizo l加 05mL异丙醇的量加入异丙醇, 在室温放
置 10m in, 4% 12 000 g离心 10 m in, 弃上清,按照每
1 mL Trizol加 1 m l 75% 乙醇进行洗涤,涡旋混合,
4% 7 500 g离心 5 m in,弃上清, 让沉淀的 RNA在
室温下自然干燥, 用 Rnasefree w ater 溶解 RNA
沉淀。
124 PoIFN cDNA的克隆及测序 以 T rizo l法
提取的总 RNA 作为 RTPCR的模板, 根据 TaKaR a
One Step RNA PCR K it( AMV )使用说明进行 RT
PCR。反应体系如下: 10 One Step RNA PCR Buffer
5 ∋L, 25 mM M gC l2 10 ∋L, 10 mM dNTP 5 ∋L,
RN ase Inh ib ito r( 40 U /∋L) 1 ∋L, AMV Optim ized Taq
1 ∋L, AMVRT ase XL ( 5 U /∋L ) 1 ∋L, Po IFN1的上、
下游引物各 1 ∋L( 50 pmo l/∋L), 模板 RNA ( & 1 ∋g
To talRNA) 1 ∋L,补充 RN ase Free dH 2O至体系总体
积 50 ∋L。反应条件: 50% 30 m in, 94% 酶失活 2
m in, 94% 变性 40 s, 52% 退火 40 s, 72% 延伸 50 s, 30
个循环, 72% 最终延伸 10 m in。将获得的 PCR产物
胶回收后与 pMD18TSimp le进行 TA连接。重组质
粒送宝生物工程 (大连 )有限公司测序。
125 表达质粒的构建及鉴定 以测序正确的质
粒为模板, 用 PoIFN2引物扩增完整的 Po IFN阅
读框序列,反应体系为 50 ∋L, 反应条件: 95% 预变
性 5 m in, 94% 变性 40 s, 56% 退火 40 s, 72% 延伸 50
s, 35个循环, 72% 最终延伸 10m in。所得片段亚克
隆到 pET32a(+ )表达载体上, 并进行酶切和 PCR
鉴定, 鉴定正确的质粒转化到 Rosetta( DE3)表达菌
中准备诱导表达。
126 重组表达载体的诱导表达、纯化及检测
挑取含有重组表达质粒的 Rosetta( DE3)单菌落,接
种于 5mL LB中, 37% 振摇培养过夜。取 50 ∋L过
夜培养物转入 20 mL LB中, 37% 振摇培养至 OD600
值达到 06, 于 30% 加入终浓度为 05 mmo l/ L
IPTG进行诱导表达, 分别于诱导后的 3、4、5和 6 h
各取 2 mL菌液进行 SDSPAGE蛋白电泳。表达产
物切胶纯化并以牛血清白蛋白为标准定量 [ 11 ] ,表达
产物的切胶纯化方法参见文献 [ 12]。纯化的重组
蛋白进行 SDSPAGE电泳后转移至 NC膜上进行
W estern blo tt ing分析, 所用一抗为抗 6 H is标签
单克隆抗体 ( 1∋200稀释 ) ,二抗为 HRP标记的羊
抗鼠 IgG ( 1∋1 000稀释 ) ,用 DAB作为底物进行显
色反应。
127 PoIFN单克隆抗体的制备及表位分析
选取 6- 8周龄 BALB /c小鼠,背部皮下多点注射佐
剂处理过的纯化蛋白。首免采用与福氏完全佐剂乳
化处理的纯化 PoIFN,按每只 25 ∋g的剂量与等体
积的弗氏完全佐剂乳化, 两周后再用弗氏不完全佐
剂乳化的 50 ∋g Po IFN免疫, 4周后按同样方法和
剂量加强免疫一次, 并采血检测抗体滴度。细胞融
合前第 3 d,采用腹腔和尾静脉注射加强免疫一次。
分离的脾细胞和杂交瘤细胞 Sp2 /0用以 3∋1的比
例进行融合。以纯化的 PoIFN和 H istag标签蛋
白为检测抗原包被 ELISA板, 对融合细胞上清进
行 EL ISA检测, 以筛选阳性细胞克隆株并确定稳
定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。获得的单抗
亚型通过快速 EL ISA 鼠单抗分型试剂盒来确定,
具体操作参见试剂盒操作说明。选取 8- 10周龄
雌性 BALB /c小鼠, 腹腔注入无菌石蜡油 ( 05 mL /
只 )。稳定分泌单抗的细胞在无血清的培养基中重
新悬浮, 腹腔注射 1 106个细胞 /鼠制备腹水, 714
d收集腹水并离心纯化, 间接 ELISA方法测定单抗
的效价。
采用 ELISA叠加试验对单抗的抗原结合表位
进行分析。将纯化的重组蛋白进行包被,加入梯度
稀释的单抗与之孵育 30 m in, 再加入 1∋1 000倍稀
释的 HRP标记的羊抗鼠二抗, 孵育 30 m in后 TMB
显色。通过对腹水浓度的优化,在如上的 ELISA反
应体系中等量加入 100 ∋L不同单抗细胞株产生的
腹水,并测定 OD450值。叠加效应由叠加指数 ( A I)
来衡量,其计算公式:
A I= [ 2A 1+ 2 / ( A1 + A 2 ) - 1] 100
A1, A 2, A 1+ 2分别指用 1号单抗, 2号单抗和 1, 2
混合是的 OD值 [ 13]。如果两株单抗结合在相同的
表位上, 则 A I值趋向于 0; 反之, 则 A I值趋向
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 1期
于 100。
128 抗 PoIFN 单克隆抗体的潜在应用研究
将 pET32a( + )空载体诱导的菌体蛋白和纯化
的重组蛋白进行 SDSPAGE电泳,而后将蛋白转移
至 NC膜上进行 W estern blo tt ing分析, 所用一抗为
制备的单抗 ( 1∋500稀释 ) , 二抗为 HRP标记的羊
抗鼠 IgG( 1∋1 000稀释 ), 用 DAB作为底物进行显
色反应。用表达 Po IFN基因的重组腺病毒 pAd
PCV IRESIFN接种 HEK293细胞, 孵育 24 h后
4% 的多聚甲醛固定细胞, 制备的单抗 IF2作为
一抗 ( 1∋200稀释 )孵育 30 m in, FITC 标记的羊抗
鼠二抗 ( 1∋1 000)孵育 30 m in, PBST洗涤后荧光显
微镜下观察结果。
2 结果与分析
21 含完整 PoIFN基因片段的 RTPCR扩增
以 ConA诱导 10 h的 PBMC中提取的总 RNA
为模板,用一步法 RTPCR扩增 PoIFN基因, 得到
一条 677 bp左右的片段 (图 1), 与预期片段的大小
一致。通过 TA克隆连接到克隆载体后的测序结果
显示, 扩增产物与已发表 PoIFN序列 ( AY188090)
有 4个碱基的突变, 但在 PoIFN开放阅读框内的
序列完全一致。
M. DNA分子量标准 DL 2000; 1.包含 PoIFN基因序列的 RT
PCR扩增; 2.阴性对照
图 1 RTPCR扩增包含 PoIFN基因的序列
22 Po IFN 基因片段的 PCR扩增
以连有 Po IFN基因片段的克隆载体为模板,
扩增用于 PoIFN原核表达的序列,得到 520 bp左
右的片段 (图 2)。将片段连接 pMD18T S imple载
体后, 进行的 PCR和酶切鉴定结果均与预期相一
致;测序结果显示,扩增序列与已发表的序列完全
一致。
M. DNA分子量标准 DL 2000; 1. PoIFN基因的 PCR扩增
图 2 PCR扩增 PoIFN基因
23 重组克隆载体的 PCR及酶切鉴定
以重组克隆载体为模板,扩增 PoIFN片段, 得
到了与预期相一致的条带 (图 3) , 酶切鉴定结果显
示,用 BamH!和H ind III双酶切后切出大小为 27
kb左右的质粒载体条带和大小与预期相符的 520
bp左右的插入片段条带 (图 4) ,表明目的片段已克
隆至 pMD18T S imp le载体中。序列测定结果显示,
插入片段与参照序列 ( AY188090 )序列一致性
为 100%。
M. DNA分子量标准 DL 2000; 1.重组克隆载体 pMDPoIFN;
2. PoIFN基因的 PCR扩增
图 3 重组克隆载体的 PCR鉴定
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2010年第 1期 娄忠子等:猪 干扰素的克隆表达及单抗的潜在应用
M. DNA 分子量标准 &EcoT14! d igest; 1.重组克隆载体 pMD
PoIFN; 2. pMDPoIFN 的酶切鉴定
图 4 重组克隆载体的酶切鉴定
24 重组表达质粒的 PCR及酶切鉴定
对重组表达质粒的 PCR和酶切鉴定结果显示,
以 pETPo IFN 为模板可以扩增出一条 520 bp左
右的特异性片段 (图 5) ,用 BamH!和H ind III双酶
切后出现 59 kb的表达载体片段和插入的 520 bp
左右的片段条带 (图 6) , 表明目的片段以正确方向
插入到原核表达载体 pET32a( + )中。
M. DNA分子量标准 DL 2000; 1.重组表达载体 pETPoIFN ; 2.
重组表达载体的 PCR鉴定
图 5 重组表达载体的 PCR鉴定
25 目的片段的表达及 SDSPAGE检测
重组表达菌经 IPTG诱导 4 h, 其菌体裂解物经
SDSPAGE电泳检测, 结果显示插入 pET32a ( + )
载体的片段构建的重组表达质粒在 Rosetta ( DE3)
中获得了完整表达, pETPoIFN重组载体表达的
融合蛋白大小约为 368 kD, 与预测大小相符 (图
7)。在诱导后 3 h,融合蛋白表达量已近最大值,随
着诱导时间的增加,表达量变化不明显。
26 表达产物的纯化效果和W estern blotting分析
表达产物的纯化效果见图 7(泳道 7)。W estern
blotting检测结果 (图 8)显示, pETPoIFN表达产物
与抗 6 H is标签单克隆抗体反应出现阳性条带。
27 单克隆抗体的制备及分析
纯化的表达蛋白免疫 5只 BALB /c小鼠并收获
脾细胞。在进行细胞融合后, 得到了 8株阳性杂交
瘤细胞 ( IF18)。经过筛选,有 5株细胞分泌的单抗
与 pET32a( + )的载体标签蛋白 (H istag protein)有
强阳性反应, 3株细胞分泌的单抗被认为是针对目
的蛋白 PoIFN,分别是 IF2, IF6和 IF7。由快速
ELISA鼠单抗分型试剂盒确定 3株单抗均为 IgG2b。
ELISA叠加试验显示, 3株单抗两两反应的 A I值均
小于 50 ( A I< 50) , 被认为是针对相同或邻近的
177
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 1期
Po IFN 抗原表位。将采集的腹水进行 10倍系列
稀释测定腹水中单抗的效价, 3株单抗的效价均为 1
104。
M.蛋白质分子量标准; 1. pETPoIFN诱导后的融合表达蛋白
图 8 pETPoIFN表达蛋白的 W estern b lotting分析
28 单抗 IF2在表达的 PoIFN蛋白检测中的应用
W estern blotting检测结果显示,制备的单抗 IF
2可以与融合表达的 PoIFN强的阳性反应, 而空
载体诱导的表达蛋白及菌体蛋白与单抗没有反应
(图 9)。在 IFA检测中, 接种重组腺病毒 pAdPCV
IRESIFN的 HEK293细胞中散在有特异性的荧光
(图 10), 而没有接种病毒的细胞中没有荧光存在
(图 11)。
M.蛋白质分子量标准; 1. pETPoIFN诱导后的表达蛋白;
2. pET32a( + )诱导后表达蛋白
图 9 pETPoIFN和 pET32a( + )表达标签
蛋白的 W estern blotting分析
3 讨论
大量的试验研究表明, IFN抗病毒活性较 !
型干扰素低, 但它的免疫调节和抗细胞增殖的作
用较强, 具有作为免疫增强佐剂的潜力 [ 14- 16] , 所
以又称免疫干扰素。 IFN可以作为巨噬细胞、自
然杀伤细胞 ( NK )和血管内皮细胞的活化剂, 能够
激活巨噬细胞并促进其吞噬活性, 促进 T和 B淋
巴细胞分化,还能增强 MHC!类分子和 MHC∀类
分子的表达。鉴于 IFN强大的生物学功能, 其相
关基础和应用研究日渐增多, 一些干扰素制品也
逐渐出现和进入临床应用。由于体外细胞刺激时
干扰素的表达量很低且难以纯化, 难以获得足够
量的蛋白用于试验研究和临床应用, 因而采用基
因工程手段制备干扰素显得尤为重要。本研究采
用体外培养 PBMC并以丝裂原刺激的方式, 诱导
PoIFN 的表达。试验合成的两对特异性引物, 分
别用于 PoIFN 基因的扩增和表达。为了完整扩
增 Po IFN开放阅读框,设计了针对 mRNA 5∃端非
编码区和 3∃端非编码区的特异性引物用于进行扩
增反应, 并反复优化扩增条件, 最终得到包含完整
178
2010年第 1期 娄忠子等:猪 干扰素的克隆表达及单抗的潜在应用
Po IFN开放阅读框的目的片段。以连有扩增产
物的克隆载体为模板, 用 Po IFN基因表达用引物
扩增出了用于原核表达的 Po IFN基因,并亚克隆
到融合表达载体 pET32a( + )上。在原核表达系
统中,选取补充大肠杆菌缺乏的 6种稀有密码子
( AUA, AGG, AGA, CUA, CCC, GGA )对应的 tRNA
的 Rosetta( DE3)菌株作为表达菌, 成功对 PoIFN
进行了融合表达,并采用 SDSPAGE电泳和表达蛋
白与抗 6 H is标签抗体反应的间接方法证明了其
表达。PoIFN蛋白表达量较高, 可以达到菌体蛋
白总量的 40%以上, 但主要以包涵体的形式存在。
对于机体内 IFN水平的定量检测可直接反映
抗原特异性的记忆 T 淋巴细胞或效应 T淋巴细胞
的分化水平,也是评价 IL12、IL18作用效力的有效
手段 [ 17]。目前,检测 IFN的方法主要有定量双抗
体夹心 ELISA方法、免疫细胞染色 ( ICC) ,流式细胞
术 ( FCM ), 实时 RTPCR和酶联免疫斑点法 ( EL IS
POT) ,其中双夹心 ELISA和 ELISPOT 试验均需要
高特异性和高亲和力的单克隆抗体。同时, 定量双
抗体夹心 ELISA方法不仅用于机体内 IFN的检
测,也可以用于基因工程手段表达的 IFN的检测
和定量。本研究中获得了 3株可以稳定分泌且针对
Po IFN 的单克隆抗体, 经过 EL ISA叠加试验检测
显示, 3株单抗针对相同或邻近的 Po IFN抗原表
位。将制备的单抗 IF2与融合表达的 Po IFN 蛋
白进行免疫反应性分析, 结果显示 IF2与表达蛋
白有较强的阳性反应, 与菌体蛋白及标签蛋白均
无反应。通过 IFA检测显示, 制备的单抗 IF2与
已建立的腺病毒表达系统表达的 Po IFN蛋白也
有良好的反应, 在宿主细胞中可以看到大量特异
性荧光存在。通过 W estern blott ing和 IFA检测分
析发现,制备的单抗与 Po IFN蛋白有较好的亲和
力, 这为定量检测机体内产生的干扰素进而了解
机体的针对病原的免疫状态和定量检测不同蛋白
表达系统所产生的 PoIFN蛋白提供了较为可靠
的技术手段。
参 考 文 献
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