全 文 ：健物杖术通报
· 研究报告 ·


’





口






  年增刊



·





一 特异性

·
释放反应诊断
活动性肺结核的研究
陈颖枉‘,
詹枝华, 郭爱珍 , ,
项杰 , 邓栓涛, ,

曾庆志‘ 杜义祥
周金海, 魏武, 童庆伟
陈焕春, ,


’华中农业大学农业微生物学国家重点实验室 , 武汉



’华中农业大学动物医学院
预防兽医学省重点实验室 , 武汉
 !

武汉市结核病医院 , 武汉





武汉市结核病防治所 ,武汉




华中农业大学校医院 , 武汉




摘 要
前期研究已经建立 了基于结核分枝杆菌特异性抗原

一



 石 融合蛋白刺激外周血单核细
胞

一 , 释放反应 ,本研究旨在证实该方法在活动性肺结核及结核菌潜伏感染诊断中的意义 。 实验对象包括


例 当地医院收治的活动性肺结核病人
病例组
及

 例某大学入学新生
健康对照者
。 采集肝素抗凝血 , 分别加
入含结核菌杭原

一





石 、植物血凝素及无刺激物



的细胞培养孔中 ,培养过夜 , 次 日收集血清 ,进行


一丫检测 。 同时 , 对其中
 位病人志愿者及
 位健康对照志愿者进行 了结核菌素



 皮内变态反应 。 病例
组与健康对照组的

 皮内变态反应阳性率分别为





 乃
 和







 , 无显著差异
尸




,表
明

 皮内变态反应不能用于活动性肺结核的检测 。 病例组

一 , 体外释放反应的 阳性率为










,
而健康对照组阳性率为





 !

, 两组间均存在极显著差异 , 表明

一, 体外释放反应诊断活动性肺结核
具有很高的灵敏度





与良好的特异性 。 在健康组中,

一 , 体外释放反应与

 皮内变态反应的总符合率
为




, 且
 一
体外释放反应阳性者中,


 为 即
皮内变态反应阳性
在病例组中 , 二者的总符合率为




,

一
体外释放反应阳性者中 ,



为 即
皮内变态反应 阳性 。

 一



石 特异性

一 , 体外释放反
应诊断活动性肺结核具有很高的灵敏度与特异性 ,即
皮内变态反应由于受卡介苗免疫等因素影响在我国不能用
于诊断活动性肺结核病与结核菌感染。
关键词
结核 , 干扰素 分枝杆菌

 一



石 结核菌素皮内变态反应














 一


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一










































































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!∋() ∀∋&∗初th C F P 一1 0 / E S A T 石 an tigen , p h y t o h e m a g g l u t i n i n ( P H A ) a n d s al i n e o v e rn i g h t . T h e re l e as e o f I F N 一丫
in th e e u ltu re su p e rn at a n t w a s tes te d w ith a s an d w ie h E L IS A . M e a n w h ile , 5 8 p a t i e n t an d 4 6 h e al t h y e o n t ro l v o l u n t e e r s w e r e
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ro l 脚upswere re spee-tively79.3% (46/58) and 76.1% (35/46). Th ere was no statistiealdife re nee betw een them (p >0.05)indieating that
PPD skin testwas notab le to dia即ose ac tive tuberc ulosis. In eontrast, r h e p o s i t i v e ra t e o f I F N 一 , r e le a s e a s s即 fo r patie nrs
re aehe d 95 .5 % ( 106 /川 ) , w h i l e t h a t o f h e al t h y e o n t ro l s w a s 1 6 . 3 % ( 4 6 /2 8 3 ) . 5 1邵ifieanr d宜fe re n e e e x is te d b e tw e e n
基金项目:国家973 项目 (项目编号 2。拓C BS 叫礴o ) ;国家“ 十一五” 科技攻关奶业专项 (项目编号:2州⋯巧B A I洲城A 05 Z o 6 B A IX 以A1 2 ) ;武汉
市科技攻关课题(项 目编号 :20 6 0 20 56)
作者简介:陈颖钮( 1983一 ) , 女 , 湖北武汉人 ,博士研究生 , 主要从事动物传染病诊断与防治研究
通讯作者:郭爱珍 , a i z h e n @ m a i l . h z a u · e d u · c n
年增刊 陈颖任等:CFP 一 l。/ E SA T 石 特异性 IF N 一g 释放反应诊断活动性肺结核的研究 177
them dem onstrat ing that IFN 一 , r el e as e a ssa y e o u l d d e t ee t a e t iv e t ub e rc ul o s i s wi th a ve巧 high sensitivity (95 .5 % )and sPeei-
fi eity . Th e overall a罗ementbetw een pPD skin testand IFN 一 , re l e as e a ssa y in d e te e ti o n of la t e n t t u b e rc u l o u s M y e o b a e te ri al
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a 邵10 515 Of th e a e tive tu b e rc u lo sis wa s
7 2 . 4 % . A m o n g th e p a tie n ts 即sitive dia邵osed by IFN 一9 r e l e a s e a s s a y , 7 7 . 8 % w a s p o s i t i v e fo r P P D s k i n t e s t . C o n e l u s i o n
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1 0/ E S A T 一 speeifi e IF N 一 , re l eas e a ss盯 15 ve理 sensitive and speeifi e in d i卿0515ofactive tubereulosis, w h i l e p p D
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Pu rifi ed pro tein d eri vatives( P pD )
结核病是严重危害人类健康的全球性人兽共患
传染病 , 主要由结核分枝杆菌引起 。 全球每年因结
核病死亡的人数达 150 一 2 0 万人 , 同时产生 80 余
万的新发病例(W H O /H TM /TB/2006.362 )。 我国
是世界上 2 个结核病高负担国家之一 , 仅次于印
度 。 根据20 0 年我国结核病流行病学抽样调查结
果估计 , 全国约有45 1万活动性肺结核病人 , 每年死
于结核病的人数达 13 万人川 。 早期准确诊断结核
病是有效防治结核病的重要措施之一 , 尤其是对临
床上难以确诊的结核病例如痰涂阴性病例、结核性
脑膜炎和胸腔积液病例等肺外结核病例[z, , 〕。 为
此 , 基于多种抗原如 P D 、 E S A T 石 、 C FP 一 1 0 、 A 沙8 的
新型免疫性诊断方法被用于结核病的诊断 , 如抗体
检测法〔‘, , 】、 IF N 一, 体外释放法〔6 , 7 〕等 , 其诊断特异
性均高于经典的 P D 皮内变态反应 。 多项研究表
明 , 基于两种以上抗原的检测方法其灵敏度高于单
个抗原〔4 一9 〕, 以致病性结核菌特异性抗原 (Es A T石
与 CFP 一 1 0) 为基础建立的 IF N 一丫体外释放法因其灵
敏度与特异性均高 , 并能鉴别卡介苗(BCG )免疫与
结核菌感染而备受重视 , 美国食品药品局 (FD A )已
批准将该方法用于结核病的辅助诊断【’“」。 国际上
已有 IF N 一, 体外释放检测商 品试剂盒 供应 , 如
Q uanti一 F E R O N 一T B 一G O L D ( C e l l e s t i s L t d . , C
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n 洲on , U K ) 、 D u o s e t H u m a n I F N 一, ( R & D
S ys te m ) 等 。 其主要原理是通过测定 ESA T石/ C F P -
10 刺激外周血单核细胞的 IF N 一丫释放水平诊断结
核病 。 虽然我国也有学者比较不同抗原的 IF N 一 , 刺
激反应对结核病诊断的意义 , 并对上述试剂盒进行
初步应用[v, ” 一 ”〕, 但整体说来 , 相关研究较少 。 此
外 , 由于这些试剂盒价格昂贵 , 难以在临床上广泛推
广与应用 。 为此 , 本实验室克隆表达 了 ESA T石/
C F P 一ro 融合蛋白和人 IF N 一 , , 制备了 IF N 一, 单克隆
抗体 , 建立了基于 ESAT石/ C FP 一 10 的 IF N 一丫体外释
放检测法 。 本研究进一步将该方法应用于临床活动
性肺结核的检测 , 证实该方法灵敏度与特异性均很
高 , 具有重要的推广价值。
1 对象与方法
1.1 研究对象
结核病阳性患者 11 例 , 为武汉市结核病医 院
与武汉市结核病防治所于 20 6 年 n 月 一 2 0 07 年
H 月间确诊的活动性肺结核住院患者 。 初治 106
例 , 复治5例 。 平均3 .3 士 16 . 09 岁 。 病例确诊依
据临床症状 、典型的肺部影像学特征 、痰集菌涂片阳
性 、细菌培养阳性 、及手术病理组织学诊断阳性等 。
人选病例均经 HI V 筛查阴性 , 排除有严重合并症
者 。 全部病例均抽血进行 IF N 一g 体外释放检测 , 其
中 58 位志愿者进行了结核菌素皮内变态反应检测 。
2 83 例健康对照 , 来自某校 2007 年 9 月的人学
新生 , 平均 18 .72 士 0 . 78 岁 。 胸部透视正常 , 无 HI V
感染 。 全部对照者均进行 IF N 一 g 体外释放检测 , 其
中46 位志愿者进行了 PPD 皮内变态反应 。
1
.
2 方法
1.2. 1 IF N 一丫体外释放与检测 抽取全血于肝素
抗凝管中 。 将全血与 RP M ll640 完全培养基 1 :1 混
合后按每孔 Zml 分别加人含有植物血凝素 20 此
(phyt ohem agglutinin , P H A ) ( 阳性对 照 ) 、 或 20林g
CF P1 0/ ES A T6 融合蛋白(测试孔 ) , 或 10闪 生理盐
水(空 白对照)的培养孔中 , 混匀 , 于含 5% CO : 的细
胞培养箱中37 ℃培养过夜 。 次 日收集培养上清液 ,
用本实验室建立的夹心 ELIs A 检测 IF N 一 , 浓度 。
C F P1 0 / E S A T6 融合蛋白、小鼠抗人 IF N 一丫 单克隆抗
生物杖 术通推 B io te ch n o人哪 2008 年增刊
体及多克隆抗体为实验室 自行制备【s] , 辣根过氧化
物酶(H RP) 标记的羊抗兔二抗 (购 自Pie rc e公司 ) ,
辣根过氧化物酶(H R P )酶底物(TM B/H 20:)液由武
汉科前生物制品有限公司提供 。 IF N 一, 检测夹心
El sA 参照李川等的报道[’‘〕, 检测所用捕获抗体为
小鼠抗人 IF N 一, 单克隆抗体 , 检测抗体为兔抗人
IF N 一丫多克隆抗体 。 商业化 IF N 一, 检测试剂盒 Duo -
se t El sA 购自R & D 公司用作参考方法 , 结果判断
参照试剂盒标准 , 描述如下 :当 o D 阳性姗 一 O D 空白姗) 0. 5 , O D ( E sA 、cF PI 。)抗原髓 一 o D 空 白溯 ) 0.35 时 , 判
为结 核 阳 性 ; 当 oD 阳性姗 一 O D 空白溯 ) 0. 5,
OD 〔E sA o cF PI 。)抗原撇 一 O D 空 ,树照 < 0 . 35 时 , 判为结核
阴性 。
1
.
2
.
2 结核菌素皮内变态反应 人型结核菌素
(pu找fi e d p ro te in d eri va tive s , p p D ) 购自成都生物制品
研究所 。 左前臂掌侧皮内注射 0.lm lP PD (2 个结素
单位) , 注射72 h 后观察结果 。 以硬结平均直径 < 5
m m 为阴性(0 级阳性反应) , 5 一 10 m m 为 I 级阳性
反应 , ro 一 巧 m m 为 1 级阳性反应 , ) 巧 m m 或硬
结出现水泡或坏死为l 级强 阳性反应 。 结核菌素皮
内变态反应 (PPD tuberc ulin skin test , TS T ) 检测由
武汉市结核病防治所的专业医生操作 。
1
.
3
.
3 统计处理 病例组与对照组连续数据采用
t‘检验 ,计数资料做犷检验 , 均以 p < 0 .05 为差异显
著的标准 。
2 结果
2.1 PPD 皮内变态反应
如果以 PP D 皮内变态反应 35 m m 为阳性标准 ,
病例组与健康对照组的阳性率分别为 79 .3% (46/
58)和 76.1% (35/4 6 ) ;如果以 pp D 皮内变态反应
310 m m 为阳性标准 , 病例组与健康对照组的阳性率
分别为 51.7% (30/58 )和 60.9% (2 8/4 6 ) ;如果以
PPD 皮内变态反应 315m m 为阳性标准 , 则病例组与
健康对照组的阳性率分别为 29 .3% (17/58 )和 28 .
3% (13 /4 6 ) (表 1 ) 。 根据上述三种阳性判断标准
获得的两组结核阳性率值经卡方检验均无显著差
异 , P 值分别为 0.06 , 0 . 7 1 与 0.27 。 比较两组 1 级
以上阳性反应率 ,病例组为 51 .7% (30 /58 ) , 而健康
对照组为 60 .9% (28 /4 6 ) , 健康对照组 n 级以上阳
性反应率显著高于病例组 (尸 = 0 .02 ) 。 因此 , 利用
P D 皮内变态反应不能区分结核菌感染与发病。
表 1 结核病例组与健康对照组 P D 皮内应态反应比较
P D 反应 PPD
反应分级
病例组%
(病例数)
对照组%
(病例数) 合计数
<5 0 20.7% (12) 23.9% (11) 23
5 一 9 1 2 7 . 6 % ( 1 6 ) 1 5 . 2 % ( 7 ) 2 3
1 0 一 1 4 fl 2 2
.
4 % ( 1 3 ) 3 2
. 6 % ( 1 5 ) 2 8
3 1 5 1 2 9
.
3 % ( 1 7 ) 2 8
.
3 % ( 1 3 ) 3 0
合计 58 46 104
2 .2 IF N 一丫体外释放检测
用实验室自主建立的 IF N 一丫检测方法与商业化
试剂盒 Duo se t EH SA 对所有样本进行检测 , 结果两
者的检出结果完全符合。 以 O D 值代表 IF N 一, 浓
度 , 病例组 IF N 一丫值为 1.37 土 0 . 64 , 而对照组为 0.
27 士 0 . 09 。 t 检验表明两组 IF N 一丫值间具有极显著
差异(p = 5.93198E 一3 5 ) 。 病例组 IFN 一丫检测阳性
率为 95 .5% (10 6/111) , 说明该方法检测活动性肺
结核的灵敏度很高(95 .5% ) ;健康对照组 283 个样
本中有阳性样本数 46 个 , 阳性率为 16 . 3% (46/
28 3 ) 。 表明该方法用于活动性肺结核的检测具有
很高的特异性 。
2. 3 IF N
一丫体外释放检测 法与 PP D 皮 内变态反应
(皮试 )的比较
比较健康对照组 46 位志愿者的 PPD 皮内变态
反应与 IF N 一丫特异性体外释放反应 , 二者的总符合
率为 50 .0% (23 /4 6 ) 。 IF N 一 , 释放反应检出的阳性
样本中 , 8 3 . 3 % ( 1 5 / 1 8 ) 为 ppD 皮内变态反应阳性 ,
且其中86 .7% (13 /巧 )为 H 级以上皮试阳性反应
(n 级阳性 6 个 , 1 级阳性 7 个) 。 但 IF N 一丫释放反
应在健康对照中检出的阳性率显著低于 PPD 皮内
变态反应 (76 .1% ) 。 在 46 位 PPD 皮内变态反检测
者中 , IF N 一, 检出阳性数 18 位 , 阳性检出率为 39 .
1% , 该值高于健康组全部样本的平均值 16.3% , 阳
性率的差异可能与皮试检测的样本较小有关 (表
2) 。
在病例组 58 位PPD 皮内变态反应测试中 , IF N -
, 释放反应与 PPD 皮内变态反应的总体符合率为
72 .4% (42乃8 )(表3 ) ,高于健康对照组二者的总符
合率 50 % (23 /4 6 ) 。 IF N 一丫释放反应的阳性检出率
年增刊 陈颖钮等:cFP一 1 0/ E s A T 石特异性 IF N 一g 释放反应诊断活动性肺结核的研究 17 9
为93 .1% (54 /58 ) , 略低于病例组全部样本的平均
值95 .5% , 但显著高于 PPD 的阳性检出率 79 .3%
(46 乃8 ) 。 在 IF N 一丫 检测阳性反应者中 , 7 . 8 %
(
4 2 / 5 4
) 为 PPD 皮试检测阳性 , 低于健康对照组的
83.3% (巧/ 18 ) ;n 级以上阳性反应数占 53 .7%
(29/54 ) ,也低于健康对照组的 86.7% (13/15 ) 。
表 2 健康组皮内变态反应与 IF N 一 , 特异性
体外释放反应的检测结果比较
IF N 一, 释放反应检测
阳性数 阴性数 总数
2 5
PPD 皮内变态
反应检测.
阳性 I级数
阳性 n 级数
阳性l 级数
阴性数
13
ll
总数 18 28 46
a 以 PP D 皮内变态反应 35 mm 为阳性标准
表 3 病例组皮内变态反应与 IF N 一 , 特异性
体外释放反应的检测结果比较
IF N 一丫释放反应检测
阳性数 阴性数 总数
阳性 I级 13 3 16
PPD 皮内变态
反应检测“
阳性n 级
阳性m 级
阴性
总计
l2
l7
13
17
a 以 PP D 皮内变态反应 35 m m 为阳性标准
3 讨论
快速准确地诊断结核病患者及从健康人群中早
期准确地检测结核菌感染者是控制结核病的重要策
略 。 P D 皮内变态反应百余年来被认为是诊断结核
感染的标准方法 , 但由于结核分枝杆菌 PPD 与卡介
苗及非结核分枝杆菌间存在交叉反应〔‘, ” 一 ”] , 该方
法不能区分卡介苗免疫与结核菌感染 , 及非结核分
枝杆菌感染 , 存在特异性差的缺点 。 本研究中活动
性肺结核组与健康对照组的 PPD 皮内变态反应阳
性率结果也证实了该观点 。 活动性肺结核组 PPD
皮内变态反应阳性率为 79 .3% (46/58 ) , 而健康对
照组为 76.1% (35 /4 6 ) , 组间没有显著差异 , P P D 皮
内变态反应不随感染与疾病发生状况而改变 , 证实
其不能用作我国结核菌感染与结核病的检测与流行
病学调查 。 该结果与国内外相关研究一致[7, ‘, , ‘“〕。
谢莉等也报道 PPD 皮内变态反应与卡介苗接种及
排菌结核患者密切接触程度有关 , 而不能区别健康
与感染者 仁’] 。
P P D 皮内变态反应不能区分健康免疫、潜伏感
染与感染发病可能有如下原因 。 第一 , 我国在新生
儿中普遍接种卡介苗 , 对采用 PPD 皮内变态反应实
施的流行病学研究存在严重干扰〔’, ‘5 一’6 ] 。 本研究
的正常对照者为 17 一 21 岁间的青年学生 , 卡介苗接
种率70 % 以上 , 因此 PPD 检测阳性率 76 .1% 合乎
实际情况 , 同时也与类似报道相近“, 一 ‘6 了。 在病例组
58 位皮内变态反应受试者中 , 73 % 的患者年龄在 巧
一 4 0 岁间 , 其中 15 一 19 岁者占 19 % , 20 一 30 岁者
占34% , 3 1 ~ 4 0 岁占20% 。 由于我国医疗卫生条
件在不断完善 , 小年龄群体的卡介苗接种率可能高
于大年龄群体 。 因此 ,从年龄分布推测 ,病例组的卡
介苗接种率可能低于健康对照组 , 但同样也是一个
卡介苗接种率较高的群体。 本研究中活动性肺结核
患者组的 P D 皮内变态反应阳性率并不高于健康
对照组 , 甚至 n 级以上阳性率低于健康对照组 , 支
持了以上观点。 而相反 IF N 一g 释放反应由结核菌特
异性抗原 ESAT 一7 与 CFPro 诱导产生 。 E S AT 一 与CFPl o 基因存在于所有结核分枝杆菌与致病型牛分
枝杆菌的基因组 R D I 区 , 而卡介苗缺少 R D I 区 。
绝大部分环境分枝杆菌也无 R m 区 , 只有堪萨斯分
枝杆菌 、耻垢分枝杆菌等少数几种环境分枝杆菌存
在不 完 整 的 R D I 区 [‘, , , , , ‘s ] 。 因此 , E s A T 刀 与
CFP1 0 诱导的 IF N 一g 释放反应特异性很高 , 能有效
区分健康免疫者与感染者〔6 ,9 ‘8 〕。 第二 , IF N 一 g 释放
反应与 PPD 皮内变态反应所诱导的免疫反应机制
不同。 据报道 , 介导 PPD 皮内变态反应的主要是记
忆性 T 细胞 , 而介导 IF N 一 g 释放反应的主要是效应
性 T 细胞 。 效应性 T 细胞寿命较短 , 当结核菌初次
侵人体内时 , 机体效应性 T 细胞被激活 , 通过杀死
细菌抵抗感染 。 随后效应性 T 细胞很快从循环中
清除 , 只有少量细胞转变为记忆性 T 细胞 。 记忆性
T 细胞寿命长 , 量少 , 在体内起巡视作用 。 当再次遭
遇抗原刺激时被重新激活 。 因此 , IF N 一g 释放反应
,‘R记11nU4,”4
”
1
11”
生物杖术通报 B勿te chn oto gy 200 8 年增刊
检测的是最近或正在发生的结核菌感染 , 而 PPD 皮
内变 态反 应 检测 的 是 过 去 较 长 时 间前 的感
染〔6 , ” , 2。〕。 因此 , 本研究中组间 即D 皮内变态反应
阳性率类似的事实反映了健康对照组与病例组的受
试成员具有类似的结核菌接触史 , 且主要来源于卡
介苗接种;而病例组 IF N 一g 释放反应阳性率为 95 .
5% , 表明 IF N 一g 释放反应诊断活动性肺结核具有很
高的灵敏度 。
尽管 IFN 一g 释放反应阳性者中70 % 以上为 PPD
皮试阳性 , 虽然病例组与对对照组中的 PPD 皮试阳
性率在相近水平 , 但病例组的 IF N 一 g 释放反应阳性
率显著高于对照组 。 这一结果提示 IFN 一g 释放反应
能有效地区分结核菌潜伏感染与健康免疫者 。 为
此 ,美国 FD A 将该方法批准为潜伏感染的检测方
法!’。〕。 基于以上原理 , 虽然健康组 IF N 一g 释放反应
阳性率显著低于 PPD 皮试反应阳性率 , IF N 一 g 释放
反应阳性者可能是真正的 、新近发生的结核菌潜伏
感染者 , 应该引起重视与关注 。
虽然如上所述 , P P D 皮内变态反应结果的解释
受多种因素(如卡介苗免疫 、结核菌感染或环境分
枝杆菌感染等)的制约 , IF N 一 g 体外释放反应与 PPD
皮内变态反应仍然具有一定的符合率。 在健康组
中 , 二者的总符合率为 50 .0% , IF N 一 g 体外释放反
应阳性者中 , 83 . 3 % 为 PPD 皮内变态反应阳性 ;在
病例组中 , 二者的总符合率为 72 .4% , IF N 一g 体外
释放反应阳性者中 , 7 . 8 % 为 PPD 皮内变态反应阳
性 。 这一结果与以上 “免疫机制理论 ”相符 , P P D 皮
内变态反应阳性反应者中 , 包括了新感染者与老感
染者;而 IF N 一g 体外释放反应阳性者只是最近感染
或发病者 。
总之 , 证实了自行建立的 C FP 一 ro / ES A T 石 刺激
外周血单核细胞释放 IF N 一g 反应能有效诊断活动性
肺结核 , 灵敏度达 95 .5% ;同时特异性 良好 , 能区分
结核菌感染与卡介苗免疫。 该方法利用外周全血过
夜培养 , 不需分离白细胞 , 程序相对简单 , 便于推广
应用 , 是一种具有广阔前景的结核病诊断辅助诊断
方法 。
参 考 文 献
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