全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 2期
猪血超氧化物歧化酶分离纯化工艺
改进及其抗氧化活性研究
王保全1, 2 庞晓斌 1 李昭华 2 平娟 1 王玲玲 1 董先智 2
( 1 河南大学药学院,开封 475001; 2中国科学院生物物理研究所,北京 100101 )
摘 要: 以新鲜猪血为原料, 首次利用改进的新工艺提取分离超氧化物歧化酶, 经过溶血, 热变, 丙酮沉淀, 超滤浓缩,
SephadexG75凝胶过滤层析和 DEAEsepha rosefast flow离子交换层析纯化, 冷冻干燥等步骤, 得到高纯度酶, 并对酶的相关性
能进行研究。试验结果显示产品粗酶活性在 3 000 U /mg左右 ,分别经 SephadexG75和 DEAEsepharo sefast flow层析纯化后,
酶活分别达到 5 585 U /m g和 6 148 U /m g产品得率分别为 134%和 1032% , SDSPAGE凝胶电泳显示为单一条带达到电泳
纯, 其分子量在 31 kD附近,其临苯三酚抗氧化活性明显。
关键词: 超氧化物岐化酶 新工艺 抗氧化
The Process Improvement on the Separation and Purification of
Superoxide Dismutase from P ig B lood and Its Oxidation Resistance
W ang Baoquan
12 Pang X iaobin 1 L i Zhaohua 2 P ing Juan1 W ang L ing ling1 Dong X ianzhi 2
(
1
Pharmaceutical College of H enan University, Kaifeng 475001;
2
Institute of Biophysics, ChineseA cademy of Sciences, Beijing 100101)
Abstrac:t The Superox ide dismutase( SOD ) w as ex tracted from fresh pig blood by improved process v ia the key step such as he
m olysis, heat denaturation, u ltrafiltra tion concentration, lyoph iliza tion, sephadexG75 gel perm eation chrom atography and DEAEsepha
rosefastflow ionexchange ch rom a tog raphyH igh pur ity enzym e w as obta ined and the related properties w ere stud ied. The resu lts
show ed that the activ ity o f the rude enzym e is abou t 3 000 U /m g, its activ ity reaches 5 585 U /mg, 6 148 U /mg and the y ield rate is
134% , 1032% a fter the sephadexG75gel perm eation chrom atography and DEAEsepha rosefastflow ionexchange chroma tog raphy,
respectivelyA so le prote inase be lt was observed and its mo lecu la rwe ight is about 31 kD w ith SDSPAGE electrophores is, and the py ro
ga llo l ox idation resistance per fo rm ed obv iously
Key words: Superox ide dismutase New process Ox ida tion res istance。
收稿日期: 20091028
作者简介:王保全,男,硕士,研究方向:生物制药; Ema i:l w angb aoquan1983@ 126 com
通讯作者:董先智, Em ai:l xzdong@ sun5 ibp ac cn
超氧化物歧化酶 ( superox ide dismutase, SOD ) ,
广泛存在于各种生物体内, 根据其金属辅助基的不
同,可分为 Cu ZnSOD、MnSOD、FeSOD等 3种类
型 [ 1]。自 1969年 M cco rd[ 2 ]发现此酶以来, 有关 SOD
在生物界的分布开始备受重视。
SOD是体内重要的一种自由基清除剂, 能够治
疗由自由基引发的多种疾病,如多种炎症,自身免疫
性疾病,放射病, 肿瘤等 [ 3] , 目前在临床上主要用于
延缓人体衰老 [ 4] , 防止色素沉着, 并治疗慢性多发
性关节炎,对躁郁症发病也起重要的作用 [ 5]。
当前,国内外对 SOD的粗分离和纯化工艺的研
究日益深入, 如张波等 [ 6]用沉淀, 热变, 再沉淀, 上
DEAESephadexA50柱等一系列步骤进行纯化, 牛
血 SOD比活由 1834 U /mg提高到 2 325 U /mg; Y ao
等 [ 7]以虾为原料,采用热变性,硫酸铵盐析, 层析纯
化来提纯 SOD; 张书文等 [ 8 ]采用二次热变性方法,
免除了使用氯仿等有机溶剂; 孙永君 [ 9]等以大蒜为
原料,采用磷酸盐缓冲液提取法和热变性方法,制备
2010年第 2期 王保全等:猪血超氧化物歧化酶分离纯化工艺改进及其抗氧化活性研究
SOD粗酶液; H addad[ 10]采用 50% - 75%硫酸铵沉
淀部分蛋白质, 依次用 DEAE52, Sephadex G200层
析,获得 SOD精品。但是这些工艺, 仍存在如生产
周期长,产品活性不高,用到大量有毒,贵重的试剂,
难于同时实现低成本, 无污染, 绿色环保等问题,难
以满足当前 SOD大规模生产的需要。本研究就
SOD从动物血液中提取工艺进行研究, 首次利用低
分子量聚丙烯酸钠和氯化铜作为高效分散剂和激活
剂来提纯 SOD,经过溶血, 热变,丙酮沉淀, 超滤浓缩
获得 SOD粗品,并使 SOD粗品酶活达到传统工艺提
取分离的效果, 该工艺大大简化了传统工艺,缩短了
生产周期。另外,层析是获得 SOD精品的重要一步,
对 SOD酶活力有很大提高, 在采用沉淀分级后常采
用层析方法纯化 SOD粗酶液, 目前国内外主要集中
于凝胶过滤和离子交换层析方面,或者两者的多步组
合联用。如 Yao等 [ 7]采用 DEAE32和羧甲基纤维素
阳离子交换层析法纯化 SOD粗酶液, Fattman等 [ 11 ]采
用琼脂糖层析来纯化鼠肺细胞外 SOD粗酶液的纯
化。本研究用改进工艺提取 SOD后, 分别利用 Seph
adexG75凝胶过滤层析和 DEAEsepharosefast flow
离子交换层析纯化超滤后酶液,两种纯化方法都很容
易达到电泳纯。该工艺大大简化了传统工艺,对工业
上放大生产有一定得参考价值。
1 材料与方法
11 材料与仪器
新鲜猪血 (北京第五肉联厂 )柠檬酸钠, 氯化铜,
丙酮 (北京化学试剂厂 )聚丙烯酸 ( PAA )聚丙烯酸钠
( PAAS) (北京希涛化学试剂厂 ), SOD试剂盒 (南京
建成生物 )低分子量标准蛋白, (华美生物技术公司 )
T ris(Ameresco),临苯三酚 (国药集团 ), SephadexG75
(瑞典 Pharmacia), DEAEsepharosefast flow4B (瑞典
Pharmacia), UV 2010紫外分光光度计 (日本岛津公
司 ) , 离心机 (日本岛津公司 ) , DYY6C型电泳仪
(北京六一仪器厂 ), 超滤杯, FDIC50冷冻干燥机
(北京博益康实验仪器有限公司 ) , HD5紫外监测
仪 (上海泸西分析仪器厂 )。
12 方法
121 SOD粗分离 新鲜血液以 08%柠檬酸三钠
抗凝, 4 000 r/m in离心 30m in收集血球,用生理盐水
洗涤后,用含 06%的 TritonX100的蒸馏水溶血 [ 12] ,
磁力搅拌 30m in,得到溶血液,在溶血液里加入溶血
液体积 20%的 PAAS液,热变到 65 时加入溶血液体
积的 10%的 10%的 CuC l2,热变时间为10m in,热变
过程中不断搅拌,然后迅速降温至室温,细纱布过滤
或离心收集浅绿色酶液,在上述浅绿色的酶液中加入
15倍体积的预冷 - 4 的丙酮,静止收集沉淀, 在上
述沉淀中加入 50倍沉淀体积的 50mmo l/L pH76的
磷酸盐缓冲液,选用分子量为 10 kD的超滤膜进行反
复超滤浓缩,收集膜上酶液,得到粗酶液,
122 SephadexG75纯化 预先装好 SepadexG75
柱 ( 1 ! 60 cm ) ,柱子事先用 005mo l/L pH76的 PBS
平衡过夜,然后把上述酶液上柱, 紫外监测仪检测,收
集蛋白活性峰,用恒流泵控制流速为 1 mL /m in, 每
5m in收集一管,收集上述各个蛋白峰,经超滤浓缩,
透析除盐后,冷冻干燥得到浅蓝色固体粉末。
123 DEAEsepharosefast flow4B 纯化 预先装
好的 DEAEsepharosefast flow柱 ( 2 !60 cm )用 005
mol /L pH为 78的 PBS平衡过夜,酶液上柱后, 用 0
- 2 mol /L氯化钠进行梯度洗脱, 并用紫外监测仪
检测,恒流泵控制流速 2- 3mL /m in, 收集蛋白活性
峰, 收集上述各个蛋白峰,经超滤浓缩, 透析除盐后,
冷冻干燥得到浅蓝色固体粉末。
124 蛋白含量测定 考马斯亮兰方法测定按照
文献 [ 13]的方法进行。
125 SOD活力的测定 按照 SOD试剂盒说明
进行 (南京建成生物 )。
126 酶紫外吸收光谱测定 取经 G75纯化的
酶, 溶于适量的蒸馏水, 用 UV 2010型紫外分光光
度计在 190- 550 nm范围内进行紫外扫描。
127 酶种类的鉴定 采取 H2O2和 KCN抑制
试验 [ 14, 15 ]。
128 SDSPAGE 聚丙烯酰胺凝胶电泳测定分子
量和纯度分离胶浓度 12% ,浓缩胶 5% 电极缓冲液
为 pH83 T risG ly缓冲液,电流条件: 12mA 50m in,
50m in后, 24mA, 2- 3 h。
129 临苯三酚 325 nm法检验 SOD提取样品活
性 取 2mg纯化酶,溶于 1mL的蒸馏水中,配制成
2mg /mL的酶液, 于 25 体系中,按文献 [ 16, 17]方
法在 325 nm处测定吸光值 根据吸光值计算 SOD对
超氧根离子的清除作用。
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 2期
2 结果
21 猪血 SOD纯化结果 (表 1)
表 1 猪血 SOD的纯化 ( 100 mL血球 )
纯化步骤 单位活性
(U /mg)
蛋白含量
( mg /mL)
比活
( U /m g)
活性回收
(% )
得率
(% )
丙酮沉淀 4 469 270 1 655 100 100
超滤浓缩 4 190 152 2 738 763 562
G75纯化 2 737 049 5 585 695 134
DEAE纯化 2 138 037 6 148 538 1032
22 SephedexG75和 DEAEsepharosefast flow纯
化层析谱图
图 1,图 2是 SOD粗酶液 (超滤浓缩后 )分别经
SephadexG75和 DEAEsepharosefast flow纯化后的
层析图, 经活性检测得知, 大峰中 SOD的蛋白活性
较高, 小峰没有明显的蛋白活性。
图 1 SephadexG75纯化层析谱图
图 2 DEAEsepha rosefast flow 4B纯化层析谱图
23 测定蛋白含量标准曲线图
蛋白 (牛血清白蛋白 )标准曲线其线性回归方
程为 y= 0102x- 00253(R 2 = 09915) (图 3)。
图 3 蛋白 (牛血清白蛋白 )标准曲线图
24 酶紫外吸收特性和酶种类鉴定
取纯化酶在 190- 550 nm范围内扫描产品,酶的
紫外吸收光谱表明最高吸收峰在 258 nm处, 次高峰
在 265 nm 处, 呈典型 Cu ZnSOD吸收光谱曲线
(图 4),其 265 nm与 280 nm的 OD比值为 13046。
另外, H2O2和 KCN抑制试验表明,该酶对这两种物质
敏感,而 FeSOD对氰化物不敏感, M nSOD对两种都
不敏感 (图 5,图 6),表明该酶为 Cu ZnSOD。
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2010年第 2期 王保全等:猪血超氧化物歧化酶分离纯化工艺改进及其抗氧化活性研究
图 6 10 mm olKCN对酶活力的抑制
25 纯化后的 SOD对超氧根离子的清除作用
由图 7可见,纯化后的 SOD对超氧根离子的清
除作用非常明显,图 7中灰色系列代表所加酶液量,
黑色系列 2代表 SOD对超氧根离子的清除作用。
23 猪血 SOD各步骤样品的凝胶电泳图及样品分
子量鉴定
图 8是标准分子量蛋白与经 SephadexG75纯
化各步电泳图,由图 8可见,经纯化后的酶和超滤前
后的酶相比,蛋白杂带明显减少, 达到电泳纯, 为单
一条带。参照低分子量标准蛋白, 可以计算出其亚
基分子量在 16 kD附近,相对分子量在 32 kD附近,
这和文献 [ 18]报道的一致。
图 7 SOD对超氧根离子的清除作用
3 讨论
目前,关于 PAA或 PAAS在蛋白质方面的应用
多集中于碱性蛋白方面, 曾用于分离提取溶菌
酶 [ 19, 20 ] , 尚未见报道用于提取分离酸性蛋白
( SOD) ,但有文献报道 [ 21]聚合高分子电解质可以通
过静电作用结合带相反离子的蛋白质, 形成聚合
物 ∀ 蛋白质复合物, 溶液中的聚合高分子电解质可
以和过度金属离子生成沉淀除去。这为研究 PAA
或 PAAS提纯 SOD机理提供了方向。另外,本工艺
中 SOD的提纯受 PAAS用量, pH, 分子量, 氯化铜用
量等多种因素的影响,试验研究发现,在氯化铜用量
一定时,低分子量的 PAAS提纯效果较好。所以本
试验建立的工艺可以大大简化传统的工艺, 所得粗
酶经 SephadexG75和 DEAEsepharosefast flow纯化
后都可以达到电泳纯, 所得产品纯度较高、活性好、
性能稳定,粗酶提取分离过程中不需贵重仪器设备、
操作简便,适合大规模工业化生产。
1. SOD 标准品; 2. M arker; 3. S eph adexG75大峰 ( 40 ) ;
4. S ephadexG75大峰 ( 20 L) ; 5, 6. SephadexG75小峰 ( 40
L) ; 7, 8.超滤前酶液 ( 40 L) ; 9, 10.超滤后酶液 ( 40 L)
图 8 SephadexG75纯化电泳图
致谢:感谢王孔江研究员为本研究提供了实验条件,中科院研
究平台为本实验提供了相关设备支持, 特别感谢辛亮博士, 任洁博
士,刘翠等给与本实验后续工作无私的帮助。
参 考 文 献
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