全 文 ：健物技术通报
· 研究报告 · 丑了口了百日口乙口 年增干
乃 菌株轻胺
氧化酶超声波法提取的研究
黄狂 何义亮 赵彬 张文英
上海交通大学环境科学与工程学院, 上海
摘 要 为 了更有效和便捷的提取菌株脱氮过程 中的关键酶 , 本文利用超声波破碎法对异养脱氮菌 尸。刃
! 进行破碎 , 通过单因素实验及正交试验 , 确 定 出最佳破碎条件 , 便于后续试验。 实验结果
表明 最佳超声破碎条件为菌液 。 为 , 工作次数为 次 , 工作 间歇为 乃 功率为 的组合为最佳工
作条件 。 在此工作条件下破碎后得到的酶粗提液对舟胺有降解 , 得到舟胺氧化酶。
关键词 超声波 法 细胞破碎 尸 彩诚二 、 。
尹 沁 勿 初 一
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凌nc ia re ttge ri stra in H N R v ia ultras on ieation we re : ee ll O D 创x) 1 . 9 % , wo r k t i m e s 7 0 , w o r k, / in te rv a l oi m e 55/5 5 a nd u l‘ra -
s o n ie o u tP u t p ow e r 4 (X) W
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s tra i n H N R
随着异养硝化菌的不断发现[’, , 1 , 其在脱氮方
面的一些特性引起了人们的关注 。 对异养硝化的研
究是对传统硝化一反硝化理论的丰富与突破〔’了。 本
实验室在研究异养硝化过程中分离纯化得到一株异
养脱氮菌株 , 经鉴定为革兰氏阴性菌 , 16 rR N A 鉴定
后为 乃。沉de nc ia re ttg eri 菌属 , 命名为 尸阳影i山nc ia
re ttge ri 、tra i。 H N R 。 在以葡萄糖和氯化钱为碳氮源 ,
在 30 ℃ , 巧o r/ m in 条件下摇床培养 , 经过 72 h 的好
氧培养后 , N
H4
士N 、 T N 和 TO C 的去除率分别达到
100% 、8 3 . 9 % 和 77 .4 % 。 尸功彩ide nc ia re t lge ri s tra i n
H N R 不同于传统的异养硝化细菌 , 其可经过一系列
生化反应 , 将氨氮转化为氮气 。 目前对于异养硝化
机制的探讨主要集中在异养硝化过程中的关键酶和
基因〔‘, , , ‘〕, 以及代谢途径这几个方面 。 根据 Ri ch -
ard so 。 等[’川 的文献以及我们对 尸r。刀ide nc ta re ttge ri
st ra in H N R 脱氮过程中中间产物的测试 , 推测有 2
条可能的脱氮途径 :¹ 细菌将氨氮氧化化成经胺后
先经历 1 个硝化阶段 , 转化为亚硝态氮和硝态氮 , 随
后反硝化脱氮;º 细菌将氨氮氧化化成经胺后 , 由经
胺直接氧化到氧化亚氮 , 然后再转化成为氮气 。 因
此对于异养脱氮机理研究的关键在于对经胺氧化酶
的研究 , 因此进行细胞破碎后提取经胺氧化酶成为
基金项 目:国家自然科学基金项 目(N o.2067 60 78 )
作者简介:黄压(19 84 一 ) , 女 , 硕士研究生 , 主要研究方向为水污染控制
通讯作者:何义亮 , E 一 m a i l : y 正e@ sj tu .e d u . cn
年增刊 黄压等二乃仇夕i山nc ia re “g eri 、t ra in H N R 菌株轻胺氧化酶超声波法提取的研究 385
4 ℃冰箱 , 盐析过夜 , 然后使用 高速 离心 机离心
(4℃ , 1 0 0 0 0 r/ m i n , 1 0 m i n ) , 离心后取沉淀 , 放人透
析袋透析使酶蛋白复性 , 得到酶粗提液 。 将酶粗提
液放人一定浓度的经胺溶液在 30 ℃ , 巧o r/ m in 反应
30m in 后测定经胺浓度的变化 。
1
.
2
.
3 细胞破碎率的确定 蛋白质在 280 nm 处有
最大紫外吸收 ,在一定浓度范围内 , 蛋白质与对应的
最大吸收波长下的吸光值成正 比。 随着菌体的破
碎 , 引起体内蛋白质的变化 。 因此 , 通过测定细胞破
碎前后 A 28。的变化 , 可间接反映菌体的破碎程度和
细胞内蛋 白的 释 出情 况[川 。 细胞 破碎后 , 以
9 o o r/ m in 离心 15 m in 取上清液 , 测定细胞破碎后
上清液在Zso nm 的吸光度值含量 A 28。 , 该值代表了
细胞破碎后蛋白质的含量 , A Zso 增长率为(破碎后菌
液 A28。值一破碎前菌液 A 28。值)/破碎前菌液 A28。值 *
100% 。
2 结果与讨论
2.1 单因素试验
超声波破碎是获取经胺氧化酶的关键工艺 , 由
预试验结果可知 , 影响超声波破碎的主要因素有:超
声波破碎功率 , 工作次数 , 工作/间歇时间 , 菌液浓
度 。
2
.
1
.
1 超声功率的确定 在其他条件相同的情况
下 , 即工作 5s , 间隙 55, 工作 60 次 , 菌液 O D 60 为
1.690 , 菌液体积为 25ryil , 分别 以 100 w 、 2 (X) W 、
30 0 W
、
4 0 w
、
s o w 五个水平进行超声波细胞破碎 ,
结果见图 1 。
05
, ,,‘.人
l
享讲事和飞zV
研究异养脱氮途径关键步骤之一 。
目前用于细胞破碎的方法有物理的和化学的两
种[’〕, 在物理破碎的方法中有高速组织捣碎机破
碎 、玻璃匀浆器破碎 、超声波破碎 、反复冻融破碎、高
压细胞破碎等 , 化学方式(热一酸法 、热一碱法 ) 。 为了
避免环境污染 , 同时保持产物的生物活性 , 本研究采
用物理方式中超声波法来进行细胞破碎 , 确定出一
种简单、快速 、高效的最佳破碎条件 , 获取经胺氧化
酶 , 便于后续研究脱氮机制。
1 材料和方法
1.1 试验材料与仪器
1. 1.1 试验菌株 由本实验室在前期研究异氧硝
化过程中分离纯化得到 , 经 165 rR N A 鉴定后为
乃口“de nc i。 厂已够已ri s tra in H N R 菌株 , 为革兰 氏阴性
菌。 试验菌株用甘油冷冻法〔‘“〕保存 。 使用前扩繁
培养 , 培养基组成为 IL 溶液中含蛋白脉 109 、牛肉
浸膏 ro g、氯化钠 59 , 磷酸盐缓冲液将 pH 调至 7 -
8 。
1
.
1
.
2 试验培养基 培养基组成:葡萄糖和氯化按
为碳氮源 , 以 N 计为 80 m扩L , 碳氮质量比为 10 , 氯
化钠为4 o om岁L , M g , 干 、 M n Z 十等微量元素 , 磷酸盐
缓冲液将 pH 调至 7 一 8 。 高压蒸气灭菌 , 灭菌条件
为 110℃ 、 1 0 m i n o
1
.
1
.
3 试验仪器 JY 92 一D 超声波细胞粉碎机 (宁
波新芝生物科技股份有限公司产品 ) , G L 一O B 菲恰
尔高速冷冻离心机 , 尤尼科 Uv 一 21 0 型紫外可见
分光光度计 , H Z Q 一F 1 60 型振荡培养摇床(江苏太仓
市实验设备厂) 。
1
.
2 试验方法
1.2.1 超声波破碎 在 250 m L 锥形瓶中 , 装人
1(X) Inl 培养基 , 3 0 ℃ 、 1 5 0 “m in 摇床培养 48h 。 培养
好的菌液以 so or/ m in 离心 巧m in , 弃上清液 , 收集
菌体 。 将适量菌体溶液置于离心管中 , 离心管置于
冰浴中 , 在细胞粉碎机中进行超声波破碎 , 工作条件
按单因素和正交试验表进行 , 制得细胞破壁后样品 。
1
.
2
.
2 经胺氧化酶活性测试 使用硫酸馁沉淀法
将超声破碎后得到的蛋白质溶液进行沉淀 , 向溶液
添加硫酸钱在冰浴中进行 , 将烘箱里烘过(约 60 ℃ )
的硫酸按以小量分多次慢慢加人溶液中 , 并不时搅
拌 , 以免造成局部浓度过高。 加完硫酸按之后 , 放人
功率(W )
图 1 A Zso 增长率与破碎功率之间的关系
从图 1 结果可以看出 , 随着超声波的输出功率
的增大 , 蛋白质增长率也不断提高 , 在 30 w 处达到
最大 , 随着功率的进一步增加 , 蛋白质增长率反而开
始降低 , 这可能是由于随着超声波的输出功率的增
健物杖术通报 B io te ch no le盯 2008 年增刊
大 ,有利于液体中空穴的形成 , 产生更多的空化泡 ,
使破碎作用增强 , 因此溶液中蛋白质的含量提高 , 但
是由于过强的输出功率 ,会使溶液产生泡沫 , 由此导
致蛋白质变性 , 使蛋白质含量反而下降。 因此选取
30 w 。
2
.
2
.
2 工作次数的确定 在工作 5s , 间隙 5s ,
3 0 o w
一 、菌液 oD、为 1.690 , 菌液体积为 25m l的条件
下 , 分别以 30 、4 0 、5 0 、 6 0 、7 0 和 80 次进行超声破碎 ,
测得破碎效率见图 2 。
破碎细胞的过程实际就是空化泡形成 、振动 、膨胀 、
压缩和崩溃闭合的过程 , 这一过程需要短暂的时间 ,
短时多次的工作方式能使超声波产生的空化泡有足
够的时间和更多的机会完成膨胀和爆炸的过程 , 因
此有利于细胞破碎呻〕。
2
.
2
.
4 菌液浓度 菌液浓度与菌液 O D 60 成线性关
系 , 因此菌液浓度以菌液 OD 60 值计 。 在工作 5s , 间
隙 5s , 30 0 w , 工作 70 次 , 菌液体积为 25 ml 的条件
下 , 菌液 o D。分别为 0.料5 、 0 . 6 04 、0 . 9 9 6 、 1 . 6 9 0 和
2.18 进行超声破碎 , 测得破碎率见图 4 。
3 0 0 尸
Ono气nUIO,‘气乙1享哥平臀。胃V
之等马臀黑V
30 40 50 60
工作次数
70 80 90
叶朴注吓砖20
图 2 A 28。增长率与破碎次数之间的关系 】 1 5
菌液OD、
2 25
从图 2 试验结果可以看出 , 随着工作次数的增
加 , 溶液中的蛋白质含量也不断提高。 这是由于随
着超声波作用时间的增长 , 更多数量细胞结构被破
坏 , 释放出更多蛋白质。 因此延长破碎时间有利于
蛋白质含量的增长 。
2
.
2
.
3 工作/间歇时间的确定 在工作功率 30 w ,
间隙5s , 总辐射时间 30 5、菌液 OD枷为 1.690 , 菌液
体积为 25 ml 的条件下 , 分别以每次辐射 2s 、 3 5 、4s 、
5 5
、
6s 进行超声破碎 , 测得破碎率见图3 。
图4 A珊增长率与菌液浓度之间的关系
2 3 4 5 6 7
nOC八口nn曰n亡、气U, ,乙,‘11
建哥华奢)戈叫V
每次辐射时l’ed (秒)
图 3 A28。增长率与每次辐射时间之间的关系
从图 3 试验结果发现 , 在超声波总辐射时间相
同的条件下 , 每次辐射 4 秒为最佳条件 。 此时溶液
中蛋白质含量增长率为最高。 超声波通过空化效应
从图4 中可以看出蛋白质含量增长率随着菌液
浓度的提高 , 先增加后又下降 ,菌液 O D。为 1.50 左
右时 , 溶液中的蛋白质含量增长率最高。 这是因为
菌液浓度较低时 , 液体总蛋白质的量较小 , 并且超声
波在水中传递的损失较大 , 破碎效果相应也就越差 ,
随着细胞浓度的提高 , 液体总蛋白质的量就增大 , 在
超声作用后释放出的蛋白质的量也就大 。 但是当菌
液浓度较高时 ,液体的粘稠度越大 , 可能不利于空化
泡的形成及其膨胀和爆炸 , 导致破碎效果较差 。
2
.
2 正交试验
根据以上单因素试验结果 , 以超声波破碎功率 ,
工作次数 , 每次辐射时间 , 菌液浓度为影响蛋白质增
长率的主要因素 , 同时考虑四因素间的交互作用 , 进
行 4 因素 3 水平正交试验 , 采用 L9 (34 ) 正交表 ,
以破碎率为考察指标 。 试验设计见表 1 , 菌液体积
为 25m l。
年增干IJ 黄压等:乃翻夕诚nc ia rettge ri stra i。 H N R 菌株经胺氧化酶超声波法提取的研究 387
表 1 正交实验因素与水平表
因素
水平 一一不不不丁一一万而面蔺丽万一万
1 2(X) 50 3/5 1.032
3 4(刃 7 0 5/ 5 1 .9 9 6
表 2 超声波破碎正交实验结果
实验号 功率(w) 工作次数 工作/间歇(岁s) 菌液 ODo A 280 增长率(% )
1 1 1 1 1 31.802
69 095
318.023
224.419
105.654
74.372
92.714
224 .709
209 .894
气‘内、JJ.1
1 3 9
.
6 3 3
1 3 4
.
7 (X)
1 1 6
.
1 6 7 1 1 7
.
9 6 7 1 1 5
,
8
0()
1 8 3
.
4 3 3
1 4 0
.
8 3 3
2
(X)
7 6 7
1 6 7
.
6 6 7
1 7 2
.
1 3 3
7 8
.
7 3 3
2 6 3
.
2 3 3
42356789
KI
KZ
3
R 4 8
.
7 3 3 8 4
.
6
(X)
5 4
.
1 6 6 1 8 4
.
5 以〕
2 5
2 0
、JO刁‘掌份渔墓
由表 2 方差分析可以看出 , D 因素是影响指标
值的最主要因素 , 各因素对蛋白质增长率的影响次
序依次是 D > B > C > A , 即菌液浓度 > 工作次数 >
工作/ 间歇时间 > 工作功率 , 超声波细胞破壁最佳
工艺条件水平组合为 D 3B: C3A : , 即菌液 OD。为 1.
9 6 , 工作次数为70 次 , 工作/间歇为 5/5 秒 , 功率为
40 w 的组合为最佳工作条件 。 由于各因素之间互
相影响作用 , 因此正交实验的到的最佳工作条件的
结果与单因素试验得到的结果存在一定出人 。
2
.
3 舟胺氧化酶活性测试
试验中 H A O 酶活性通过测定底物的变化量来
表征 , 即通过测定经胺的变化量来表征 H A O 的酶活
性 , 因此 , H A O 酶活性的检测等同于轻胺浓度变化
的检测 。 以水和水 + 细胞色素 C 为参照 , 反应前后
经胺浓度降解率见 图5 。
图 5 轻胺在酶作用后的降解率
从图 5 结果可以看出 , 通过超声破碎后得到的
酶粗提液对经胺有降解 , 确实存在经胺氧化酶 , 通过
超声破碎后得到了经胺氧化酶粗提液为下一步研究
异养脱氮途径打下基础 。
3 结论
(l) 单因素试验结果标明:超声波输出功率为
30 OW , 工作次数越多 , 工作/间歇4乃 秒 , 菌液 O D 60
生物杖术通推 B 勿te ch noto gy B “le 血 2008 年增刊
在 1.50 左右时 , A2 80 增长率在各自工作条件下最
高。
( 2) 正交试验结果表明最佳工作条件为:菌液
OD o 1.9 6 , 工作次数 70 次 , 工作/间歇 5/ 55 , 功率
40 W 。
( 3) 通过经胺氧化酶活性测试 , 证实了通过最
佳条件破碎菌株后 , 能够提取到经胺氧化酶 。
参 考 文 献
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