全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2009年第 1期
收稿日期：2008-07-08
基金项目：863 探索类项目（2006AA02Z153），上海市科学技术委员会生物医药重大科技攻关项目（06DZ19020）
作者简介：张立操，男，硕士研究生，研究方向：生化与分子生物学；E-mail：sanqianwei@gmail.com
通讯作者：金坚，博导，教授，研究方向：细胞与分子药理学；Tel：0510-85918219，Fax：0510-85918219，E-mail：jinjian31@126.com
β 干扰素（IFNβ）是干扰素家族中的一员，具有
抗病毒、抗增殖和免疫调节作用。 雷楗勇等 [1]构建
了人 β 干扰素与人血清白蛋白融合蛋白 （IFNβ-
HSA），将其在毕赤酵母系统中进行表达。 这种融合
的方法增大了蛋白药物的分子量，减少了异源蛋白
的免疫原性， 从而减少肾小球滤过率和体内清除
率，有效提高了 IFNβ 在体内的半衰期，具有广阔的
生产和临床应用前景。 在当前发酵优化、蛋白纯化
研究和后期临床应用中迫切需要一种能够定量检
测 IFNβ-HSA 融合蛋白原型药物的方法。 酶联免疫
双抗体夹心 ELISA定量检测 IFNβ-HSA融合蛋白方法的建立
张立操 张莲芬 雷楗勇 陈其亮 陈蕴 许泓瑜
许正宏 张雁云 金坚
（江南大学医药学院分子药理研究室，无锡 214122）
摘 要： 为了建立 β 干扰素与人血清白蛋白融合蛋白（IFNβ-HSA）的酶联免疫定量分析方法，以抗 IFNβ 单克
隆抗体为包被抗体，IFNβ-HSA融合蛋白为夹心抗原，辣根过氧化酶（HRP）标记抗 HSA单克隆抗体为检测抗体，建立了
一种定量测定 IFNβ-HSA融合蛋白的双抗体夹心 ELISA 方法。 并进行了检测限、精密度、准确度和稳定性等方法学考
核。 结果表明，包被抗体和检测抗体的最佳工作浓度均为 2μg/ml，抗原浓度在 51.88~3 320 ng/ml范围内呈良好线性关系，相
关系数 R2>0.99，检测限为 10 ng/ml。 经方法学考核，批内、批间变异系数分别为 4.86％和 8.08％，回收率为 91.9％~110.4％，与
IFN-β、IFN-α、HSA、IFNα2b-HSA基本无交叉反应， 健全性分析表明发酵液稀释倍数对该方法无影响，8 d 连续检测标
准曲线表明稳定性良好。 这种定量检测 IFNβ-HSA融合蛋白的双抗体夹心 ELISA方法，灵敏度高，重复性好，为当前融
合蛋白发酵优化、分离纯化研究提供了定量检测的方法，并为后期药代动力学、临床研究提供了思路和备选方法。
关键词： 双抗体夹心 酶联免疫分析 β干扰素 人血清白蛋白 融合蛋白 定量分析
Development and Application of Double Antibodies Sandwich
ELISA Method for Quantitative Detection of IFNβ-HSA
Zhang Licao Zhang Lianfen Lei Jianyong Chen Qiliang Chen Yun Xu Hongyu
Xu Zhenghong Zhang Yanyun Jin Jian
（Laboratory of Molecular Pharmacology，School of Medicine and Pharmaceutics，Jiangnan University，Wuxi 214122）
Abstract： To develop a double antibody sandwich ELISA for quantitative analysis of recombinant fusion protein
IFNβ-HSA. Using an anti-IFNβ monoclonal antibody for capture and a HRP-labeled conjugate of another anti-HSA
monoclonal antibody for detection antibody constructs a sandwich ELISA. From results，the optimal concentration of the
first coating antibody and detection antibody were both 2 μg/ml. The standard protein curve regression equation was
y=0.248x-0.861 and the its linear detection was 51.88 to 3 320 ng/ml （R2=0.991）. and Recoveries ranged from 91.9%
~110.4％ in typical matrixes，while the intra- and inter-assay precisions were 4.86％ and 8.08％ ，respectively. The
sensitivity of the IFNβ-HSA ELISA with a limit of detection was 10 ng/ml. Thus，a sensitive，repeatable double
antibody sandwich ELISA is established for quantitative analysis of recombinant fusion protein IFNβ-HSA. It can be
used in the research of fermention，purification and clinical diagnose.
Key words： Sandwich ELISA Quantitative analysis Fusion protein IFNβ-HSA
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2009年第 1期
吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）
技术是 1971 年由 Engvall 和 Perlman 建立的一种生
物活性物质微量测定技术，以其灵敏度高、特异性
好等优点，在生命科学各领域得到广泛应用。 选取
针对两端多肽的单克隆抗体，建立了一种双抗体夹
心 ELISA 方法，定量检测 IFNβ-HSA 融合蛋白原型
药物，并对方法学进行了考核。
1 材料
1.1 材料及试剂
1.1.1 材料 96孔酶标板，美国 Costar公司；抗 IFNβ
单克隆抗体 ，R&D 公司 ；HRP 标记抗 HSA 单克隆
抗体，Abcam 公司；抗原定量标准品参考，本实验室
纯化制备（166 mg/L）。
1.1.2 仪器 MK3 酶标仪；微量振荡器；微量移液
器；恒温箱；自制湿盒。
1.1.3 ELISA 试剂 四甲基联苯胺（TMB）、BSA，上
海晶美生物技术有限公司；包被缓冲液、洗涤缓冲
液、样品稀释液、抗体稀释液和终止反应液自制。
2 方法
2.1 双抗体夹心 ELISA 方法的建立
2.1.1 双抗体夹心 ELISA 基本程序 参考文献 [2~
5]。 ①包被：包被缓冲液稀释包被抗体，100μl/孔加
入 96 孔酶标板，4℃过夜。②封闭：次日甩去孔内液
体，洗涤液 PBST（含 0.5 ml/L Tween-20 的 0.02 mol/
L PBS，pH7.4） 洗板 3 次， 每孔加入 250 μl 封闭液
（含 10 g/L BSA 的 0.02 mol/L PBS，pH7.4），37℃温
育 2 h。 ③加样品：弃去孔内液体，同上洗板 3 次后
分别加入抗原和空白对照液，37℃温育 2 h。④加酶
标抗体：弃去孔内液体 ，同上洗板 3 次后分别加入
酶标抗体，37℃温育 2 h。⑤显色：弃去孔内液体，同
上洗板 4 次后加入底物反应液， 反应 5~20 min 后
用 2 mol/L H2SO4 终止反应 ， 于酶标仪上在 λ=450
nm 处测读 OD 值。
2.1.2 包被抗体和酶标抗体的配对试验 用碳酸
盐缓冲液 （0.05 M CBS，pH9.6）将包被抗体稀释到
5 μg/ml，按照 2.1.1ELISA 基本程序操作，比较阳性
孔（1 660 ng/ml IFNβ-HSA 融合蛋白）和空白对照孔
（含 10 g/L BSA 的 PBST）的 OD450 值。
2.1.3 包被抗体和酶标抗体工作浓度的选择 用
包被缓冲液 （0.05 M CBS，pH9.6）将包被抗体稀释
成 5 μg/ml、2 μg/ml、1 μg/ml 和 0.5 μg/ml 4 个浓度
包被酶标板 ，用抗体稀释液 （1％BSA/PBST）将酶标
抗体 （0.8 mg/ml） 稀释成 1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000
和 1：8 000 4 个梯度，设定棋盘滴定试验。以阳性孔
OD450 值在 1.0 左右， 空白孔的 OD450 小于 0.1 的条
件作为最佳抗体工作浓度。
2.1.4 最佳包被条件的选择 （1）分别用 0.05 M
CBS （pH9.6），0.05 M Tris-HCl （pH8.0），0.02 M PBS
（pH7.4），为包被缓冲液 ，将包被抗体稀释到 2 μg/
ml， 包被过夜 。 抗原设定 1 660 ng/ml、415 ng/ml、
103.75 ng/ml 3 个浓度 ， 酶标抗体 1 ∶4 000， 按照
1.2.1 操作，比较线性回归曲线。 （2）包被时间的优
化：根据确定的最佳包被缓冲液，依照 1.2.1 操作，
考察 4℃36 h、4℃ 24 h、4℃ 12 h、37℃ 3 h、37℃ 2
h、37℃ 1 h 不同包被时间对测定体系的影响。
2.1.5 标准曲线的制作 根据以上确定的最佳条
件 ， 即用 0.05 M CBS，pH9.6 将包被抗体稀释到 2
μg/ml，100 μl/孔加入 96 孔酶标板，37℃温育 1 h 后
转 4℃包被过夜。 次日甩去孔内液体，PBST 洗板 3
次，每孔加入 250 μl 封闭液，37℃温育 2 h。 弃去孔
内液体，同上洗板 3 次后分别加入 IFNβ-HSA 融合
蛋白标准参考品系列稀释液（从 6 640 ng/ml 起做 2
倍连续稀释至 1.62 ng/ml）和空白对照液，37℃温育
2 h。 弃去孔内液体，同上洗板 3 次后分别加入酶标
抗体，37℃温育 2 h。 弃去孔内液体，同上洗板 4 次
后加入底物反应液 ， 反应 5~20 min 后用 2 mol/L
H2SO4 终止反应，酶标仪上测读 OD450 值。 以浓度的
自然对数 LN（x）为横坐标，以 OD450 值为纵坐标，绘
制曲线图。根据曲线图，选择最佳线性范围，绘制标
准曲线。
2.2 双抗体夹心 ELISA 方法的考核
2.2.1 检测限 参考文献 [6~8]计算 10 个阴性孔
的平均值 （X）和标准差 （SD），以 X+2SD 从滴定曲
线中找到该相应值的最低浓度 ， 即为方法的检测
限。 根据标准曲线的线性范围确定定量限。
2.2.2 精密度 在线性范围内取 1 660 ng/ml、415
ng/mg、103.75 ng/ml 3 个浓度点， 采用与标准曲线
同时测定的方法 ， 在一次实验中每个浓度点测 8
孔，计算批内变异系数。连续测 8 批次，计算批间变
异系数。
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2009年第 1期
2.2.3 稳定性 按照优化的检测程序，连续 8 d 测
定并绘制标准曲线，比较曲线的漂移。
2.2.4 特异性 将 IFNβ-HSA 的结构类似物 IFNβ、
IFNα、HSA、IFNa2b-HSA，同标准品 IFNβ-HSA 融合
蛋白等摩尔稀释，通过建立的检测方法测定，考察
交叉反应性。
2.2.5 回收率 在空白检测基质中加入高 （1 660
ng/ml）、中 （415 ng/ml）、低 （103.75 ng/ml）不同剂量
的 IFNβ-HSA 融合蛋白 ，按检测程序测定 ，计算实
测值与理论值比值，求出平均回收率。
2.2.6 健全性分析 取未诱导前发酵液 ，8 000 r/
min 离心 5 min 得上清， 稀释 2 倍、10 倍、100 倍后
分别添加与 7 个标准点等浓度的抗原标准参考品，
依照检测程序测定，各稀释浓度测定值应落在标准
曲线上，或平行于标准曲线。
3 结果
3.1 双抗体夹心 ELISA 方法的建立
3.1.1 包被抗体和酶标抗体的配对实验 阳性孔
同空白对照空的 OD450 值分别是 1.782 和 0.086，差
异显著（P>0.05），表明可以形成双抗体夹心 ELISA
结构，两抗体配对良好。
3.1.2 包被抗体和酶标抗体工作浓度的选择 根
据实验结果，包被抗体的浓度确定为 2 μg/ml，酶标
抗体的稀释度为 1∶4 000，浓度为 2 μg/ml。
3.1.3 最佳包被条件的选择 （1） 通过比较线性
回归方程（表 1），CBS 包被液包被可使曲线得到较
高的斜率， 较好的相关系数， 故选择 0.05 M CBS、
（pH9.6）为方法的包被缓冲液。
（2）包被时间的优化 ：根据试验结果 （表 2），
4℃ 36 h 包被效果最好 ，37℃ 3 h 也能达到较好的
包被效果，但较高的温度和较长的时间都会对抗体
的活性产生不确定的影响，综合考虑后选择 37℃预
包被 1 h 后转 4℃过夜的包被方式。
3.1.4 标准曲线的制作 通过抗原浓度的自然对
数 LN （X）与 OD450 值得曲线图 （图 1）可知抗原在
51.88~3 320 ng/ml 浓度范围内具有良好的线性，并
且包括了 7 个标准点，确定此范围为该方法的检测
范围。 通过对选定范围内的 7 个标准点线性回归，
获得标准曲线 （图 2）， 回归方程 y=0.248x-0.861，
R2=0.991。
3.2 方法学的考核
3.2.1 检测限 通过试验得出此 ELISA 方法的检
测限为 10 ng/ml。 通过标准曲线，该方法的定量限
设为 51.88 ng/ml。
3.2.2 精密度 通过试验考察 （表 3、表 4），该检
测方法的批内变异系数为，4.86±1.05％， 批间变异
系数为 8.03±1.08％，满足批内精密度小于 10％，批
间精密度小于 15％的要求。
3.2.3 稳定性 通过连续 8 d 的测定 ， 发现各点
OD450 值无明显下降，通过线性拟合，相关系数（R2）
都能达到 0.99 以上， 说明该方法具有较好的稳定

  x=LN( )  R

CBS y =0.212 x1.251 0.992
Tris-HCL y =0.209 x1.211 0.987
PBS y =0.184 x1.064 0.985

表 1 包被缓冲液选择
表 2 不同温度、时间下包被效果的比较
图 1 浓度的自然对数 LN(x)与 OD450 值关系图
图 2 标准曲线

() 4 37

h) 48 36 24 12 3 2 1
OD 1.485 1.953 1.865 1.71

1.654 1.53 1.102

LN（X）
y=0.248x-0.861
R2=0.991
张立操等：双抗体夹心 ELISA定量检测 IFNβ-HSA融合蛋白方法的建立 123
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2009年第 1期
性（图 3）。
3.2.4 特异性 添加 IFNβ、IFNα、HSA、IFNα2b-HSA
孔的 OD450 值与标准曲线上空白孔 OD450 值相近，与
IFNβ-HSA 融合蛋白孔差异性显著 （P>0.05），故该
方法的特异性较好。
3.2.5 回收率 在 8 次试验中，3 个浓度点的回收
率分别为 101.2±9.2％ 、101.9±8.0％和 98.7±6.8％ ，
满足要求。
3.2.6 健全性分析 以 2 倍 、10 倍和 100 倍稀释
的发酵液为基质，测定结果呈线性关系，与标准曲
线基本重合，表明发酵液稀释倍数对测定方法基本
无干扰（图 4）。
4 讨论
随着生物技术的发展，蛋白和多肽类药物受到
越来越多的重视，尤其是基因重组生物因子产品的
医学应用。 如美国 FDA 已经批准的人胰岛素、人生
长激素、IFN、t-PA、EPO、G-CSF、IL-2 等， 在临床上
得到广泛应用。其中 IFNβ 是一类具有抗病毒、抗增
殖和免疫调节活性的细胞因子。 目前已有 57 个国
家批准生产、使用重组干扰素制剂，治疗 30 多种肿
瘤、病毒感染性疾病，并取得了很好的效果，已显示
出巨大的社会效益和经济效益。然而药代动力学研
究表明分子量较小的多肽/蛋白类药物在代谢过程
中易被蛋白酶降解或被肾小球滤过因而半衰期短。
针对这方面的不足 ， 本实验室重组构建了 IFNβ-
HSA 融合蛋白， 将其在毕赤酵母系统中进行表达，
增大了蛋白药物的分子量，减少了异源蛋白的免疫
原性，从而减少肾小球滤过率和体内清除率，有效
提高了 IFNβ 在体内的半衰期， 具有广阔的生产和
临床应用前景。
在长效重组多肽药物的研究中，需要关注多肽
药物的活性和融合蛋白的完整性。蛋白多肽类药物
的测定比化学药物困难，因为其生物活性不仅取决
表 3 批内精密度测定结果
表 4 批间精密度测定结果
图 3 稳定性考核
1~8 为连续 8 d 测定标准曲线

ng/ml ng/ml 
1 660 1 768.60+123.40 101.2+9.2
415 404.49+20.35 101.9+8.0
103.75 91.45+2.43 98.7+6.8

表 5 回收率测定结果（n=8）
图 4 健全性分析
S1、S2、S3、S4 分别为标准样品稀释液 、 发酵液 2 倍稀释液 、
10 倍稀释液、100 倍稀释液作为介质

ng/ml  ng/mln=8  (SD) 000(CV)(0) 000(0)
1 660 1 801.01 81.72 4.54
415 425.07 27.32 6.23
103.75 91.45 3.48 3.81
4.86


ng/ml  ng/mln=8  (SD) (CV)() 
1 660 1 768.60 123.40 9.11
415 404.49 20.35 8.04
103.75 91.45 2.43 6.94
8.03

LN （X ）
LN （X ）
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2009年第 1期
于一级结构，也同二级结构、三级结构有很大关系，
还会受到内源性结构类似物、自身代谢降解产物的
干扰 ，常用的方法是生物检定法、放射性同位素标
记示踪法和免疫分析法。生物检定法可以直接反映
蛋白药物在生物体内产生的生物学活性，但操作复
杂，费时费力，影响因素较多，变异较大。 同位素标
记法通常是用交换法和化学合成法将放射性同位
素如 125I 标记到蛋白的酪氨酸上，检测灵敏度高，但
对样品纯度要求也高 （放化纯>95％），而且放射性
同位素标记量过低会影响灵敏度，过高可能引起蛋
白质三级结构的改变，影响到蛋白质生物活性和体
内代谢过程 [9，10]。另外，被标记多肽药物在体内被降
解成片段或被机体再利用合成内源性物质，故测定
的总放射性不能代表被标记原型药物的浓度 ，而
且，这两种方法也不适用于从组分比较复杂的发酵
液、初步纯化样品中的检测目的抗原。 酶联免疫分
析法是利用抗原抗体高特异性亲和作用，可以从初
步处理的样品中准确检测出目的蛋白， 具有灵敏、
精确、稳定、经济快速和便于批量处理的优点，而且
不用放射性同位素，样品用量少。
本课题建立的双抗体夹心 ELISA 的方法定量
检测 IFNβ-HSA 融合蛋白完整原型药物。 通过包被
抗 IFNβ 单克隆抗体到酶标板，无关蛋白封闭后，加
入待检样品，则捕获抗体特异性结合 IFNβ-HSA 融
合蛋白的 IFNβ 端，形成固相复合物。其它蛋白通过
洗涤除去， 再加入的酶标检测抗体特异性结合到
IFNβ-HSA 融合蛋白的 HSA 端，温育洗涤后加酶反
应底物显色， 测定的 OD450 值高低对应于样品中完
整 IFNβ-HSA 融合蛋白的量，得到一条线性关系好
（R2>0.99），较稳定的标准曲线。 经过方法学考核，
检测限为 10 ng/ml，批内 、批间精密度变异系数分
别为 4.86％和 8.08％，回收率为 91.9％~110.4％，与
IFN-β、IFN-α、HSA、IFNα2b-HSA 基本无交叉反应 ，
健全性分析表明发酵液稀释倍数对该方法无影响，
8 d 连续检测标准曲线表明稳定性良好， 满足应用
上的要求。该方法的优点是通过两步抗原抗体的高
特异性亲和反应， 在初步处理样品中区别干扰物、
降解物而定量检测出完整 IFNβ-HSA 融合蛋白。 试
验也表明，两株单克隆抗体可以很好的配对同抗原
形成三明治夹心结构。创新点是通过分别针对融合
蛋白的两端不同多肽选择单抗形成夹心结构，保证
测出结果尽量反应完整原型药物的准确量，结构类
似物、降价物无交叉干扰。有研究显示，大多数药物
多肽，特别是重组药物的结合活性与生物活性间表
现出较好的一致性，免疫测定与生物检定有一定的
相关性及量效关系，可部分反映蛋白质药物的生物
活性，因此该方法在前期研究中具有一定的指导作
用。
本方法可以应用到发酵优化和分离纯化研究
中 ， 用以跟踪测定 IFNβ-HSA 融合蛋白的诱导表
达，纯化得率等，并且为后期药代动力学、临床研究
提供了思路和备选方法。
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