全 文 :·综述与专论·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 4 期
精氨酸激酶蛋白及分子生物学的研究进展
苏晓峰 陆国清 程红梅
(中国农业科学院生物技术研究所,北京 100081)
摘 要: 在无脊椎动物体内,精氨酸激酶(arginine kinase)在能量代谢过程中发挥着重要的作用。随着研究的深入,越
来越多的数据表明,精氨酸激酶的作用不仅限于提供和维持能量的平衡,而且对生命活动的调控起到重要作用。综述无脊椎
动物体内精氨酸激酶的进化历程、蛋白特性、特异表达及生物学功能等方面的研究进展,为深入研究无脊椎动物的抗性调控
机制提供必要的参考。此外,对无脊椎动物精氨酸激酶的重要性和研究中存在的问题进行讨论。
关键词: 精氨酸激酶 免疫力 抗性 进化 特异性表达
Progress in the Studies on Protein and Biology of Arginine Kinase
Su Xiaofeng Lu Guoqing Cheng Hongmei
(Biotechnology Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Science,Beijing 100081)
Abstract: In invertebrate,arginine kinase(AK)plays a critical role in energy metabolism. With the deeply study,increasing data
show that the functions of arginine kinase not only are confined to provide energy and maintain the balance of power,but also play an
important role in regulating the activities during invertebrate’s whole life. We reviewed the evolution of AK protein,the AK protein
characterization,the specific-tissue expressions that mediate unique biological functions and the application in production and life of ar-
ginine kinase in invertebrate. Meanwhile,the significance and existent problems of the related studies were also discussed.
Key words: Arginine kinase Immunity Resistance Evolution Specific-tissue expression
!收稿日期:2010-10-20
基金项目:“973”项目(2007CB109203)
作者简介:苏晓峰,男,硕士研究生,研究方向:植物分子生物学;E-mail:suxiaofeng807@ 163. com
通讯作者:程红梅,女,研究员,博士生导师,研究方向:植物分子生物学;E-mail:chenghm@ caas. net. cn
1971 年首次发现精氨酸激酶(arginine kinase,
ATP:精氨酸 N-磷酸转移酶,EC 2. 7. 3. 3)[1]后,已
从多种无脊椎动物体内克隆得到基因全长。精氨酸
激酶作为体内能量代谢最关键的酶之一,引起了人
们广泛的重视。越来越多的数据表明,精氨酸激酶
不仅与能量代谢有直接的关系,还参与体内离子交
换、对不良环境的抗性及免疫力等。随着研究的深
入,人们在分子水平和蛋白水平等层面上对精氨酸
激酶进行了详细的阐述。目前,在无脊椎动物中对
精氨酸激酶的研究主要包括以下几个方面。
1 精氨酸激酶的拷贝数及特异性表达
在大多数无脊椎动物体内,只发现一种有生物
学功能的精氨酸激酶基因,且以单拷贝状态存在。
但在某些低等生物,如大豆胞囊胞线虫[2]、猫栉首
蚤[3]和印度光缨虫[4]等体内,发现两种有生物学功
能的精氨酸激酶基因,其各自仍只有一个拷贝。依
据胍基底物的特异性和天然底物的动力学性质,对
猫栉首蚤体内的两个精氨酸激酶进行检测发现,成
年跳蚤在其体内含有少量或几乎没有精氨酸激酶
2。因此推测,此阶段精氨酸激酶 1 可能是主要的表
现形式。近来报道的大部分精氨酸激酶只识别 L-
精氨酸,但是印度光缨虫的精氨酸激酶却能识别 D
和 L-精氨酸两种底物,均表现出酶学活性[4,5]。
在无脊椎动物体内,大多数精氨酸激酶均为组
成型表达,各个组织中均有表达。由于精氨酸激酶
与能量代谢密切相关,所以表达量存在时空的特异
性,主要集中在大量需能的组织中。通过荧光定量
分析凡纳滨对虾体内,精氨酸激酶的分布很广,在肌
肉内表达量最高,而在表皮中表达量最低[5,6]。在
某些生物的生命史中,其表达量也有很大差异。在
2011 年第 4 期 苏晓峰等:精氨酸激酶蛋白及分子生物学的研究进展
家蚕的生命周期中,随着龄期精氨酸激酶的表达量
呈明显地增大趋势,到熟蚕期达到最大,在蛹期表达
量逐渐减少。通过基因上游转录因子结合位点及发
育表达模式分析表明,家蚕的精氨酸激酶基因的表
达可能受蜕皮激素调控[7]。
精氨酸激酶的表达不仅有时空的特异性,还有
阶级与性别的区别。在红蚂蚁体内,精氨酸激酶的
表达及蛋白活性顺序递减如下:工蚁 >有翅的雌成
虫 >有翅的雄成虫 >幼虫 >工蚁蛹≈有翅蛹,工蚁
体内的精氨酸激酶活性最高。在雌性有翅的红蚂蚁
与工蚁体内,精氨酸激酶的活性均是头部和胸部高
于腹部,但是在雄性有翅的红蚂蚁体内,其头部与腹
部的表达量比胸部高。由于精氨酸激酶与生物体内
的能量利用及再生有紧密联系,可以由此推断其体
内的需能关系[8]。
2 精氨酸激酶与免疫力及抗性的关系
在无脊椎动物体内,精氨酸激酶的变化可能与
外界的条件有关。报道称,在缺氧、叠氮化钠和五氯
苯酚等条件下,精氨酸激酶的表达量会上升[9]。
克氏锥虫的精氨酸激酶在其体内的能量平衡中
起着关键性的作用,并与 pH 和营养压力的抗性有
密切关系。此外,尽管异源的精氨酸激酶在缺少磷
酸肌酶的有机体中表达(例如,酵母和细菌体内) ,
它们也变得对 pH和营养压力更有抵抗力。克氏锥
虫体内的精氨酸激酶同源基因的过度表达,可以促
进转染细胞的生长、抵抗营养和 pH压力的能力。
在过氧化物的压力下,与对照组相比,处理过的
克氏锥虫精氨酸激酶的表达量有了明显地提高。这
些发现证明精氨酸激酶参加了抗氧化能力的反应。
同理,在硫化物的压力下,精氨酸激酶的活性显著升
高。解除压力以后,其与对照组无明显差别。通过
蛋白表达谱分析,日本囊对虾在缺氧状态下,精氨酸
激酶的表达量也有明显上升[10]。
通过二维电泳发现,用硫酸铜溶液处理过的虾,
其体内的精氨酸激酶的表达量明显下降。在中国卤
虫体内,精氨酸激表达量明显下降,证明了硫酸铜严
重的影响了精氨酸激酶的表达,其能量的代谢水平
可能低于对照组[11,12]。分析表明,精氨酸激酶不仅
对生物体适应不良环境有重大作用,还与免疫的能
力有比较重要的关系,可能直接或间接参与到免疫
反应过程中[13]。细角滨对虾(P. stylirostris)感染
WSSV 病毒后,精氨酸激酶的表达量比对照组高
2. 84 倍[14]。同样的情况也发生在中国明对虾体
内[10]。目前的数据表明,在注射昆布素后,精氨酸
激酶的表达量发生明显的变化,表明昆布素影响了
精氨酸激酶的表达。Johansson 等曾经暗示,昆布素
可以作为一种免疫促进剂和甲壳纲动物能量的
来源[14]。
3 精氨酸激酶与过敏源之间的关系
目前,有一些报道称,由于肌肉组织内大量表达
精氨酸激酶,使其成为甲壳类动物体内最重要的致
敏源之一。部分人食用虾蟹等甲壳类动物后,可能
会发生过敏反应。还有少数人对美洲大蠊发生过敏
反应,精氨酸激酶也是主要变应原之一[15]。
由于在哺乳动物中不含有精氨酸激酶,所以我
们可以制作抗体来进行血清学检测动物体内是否感
染无脊椎类疾病[16]。
4 精氨酸激酶蛋白性质
在无脊椎动物中,根据精氨酸激酶的分子量及
结构,可分为:(1)单亚基精氨酸激酶,如海湾对虾,
相对分子量约为 40 kD; (2)双亚基精氨酸激酶,如
海参,相对分子量约为 80 kD; (3)四亚基精氨酸激
酶,如环节动物,相对分子量约为 150 - 160 kD[17]。
一般认为,精氨酸激酶广泛分布于高等与低等
的无脊椎动物体内,以及较为低等的脊索动物体内,
但在脊椎动物体内是不存在的;肌酸激酶则主要存
在于脊椎动物体内。但是最近的研究表明,这种结
果并不是绝对的。在一些无脊椎动物体内,发现了
肌酸激酶,而精氨酸激酶则在一些脊椎动物体内发
现,甚至发现其有共存现象,如棘皮动物[18]。
最近的研究表明,在软体动物深海蛤蜊(deep-
sea clam Calyptogena kaikoi)体内,精氨酸激酶以双
亚基形式存在。它的两个亚基均具有催化活性,但
是其催化功能却差异很大[19]。
一般来说,精氨酸激酶的活性中心都具有(CPT-
NLGT)氨基酸残基序列[7]。半胱氨酸在所有的精氨
酸激酶中都是高度保守的,它可能位于精氨酸两个
结构域的铰链区,它的作用并非在与过渡态的类似
物结合上发挥重要作用,而是在过渡态类似物所引
起的构象变化过程中发挥作用,这一点与肌酸激酶
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中的作用较相似[9]。在太平洋牡蛎(Oyster cras-
sostrea)中,精氨酸激酶中有高度保守的一对氨基酸
残基(D62 和 R193) ,它们形成一个离子对,将其替
换掉会造成精氨酸激酶活性的大量丧失,其可能与
调节底物与精氨酸激酶的结合有关[20,21]。
在虾(Fenneropenaeus chinensis)的肌肉中,精氨
酸激酶底物的识别区(GS 区)是高度保守的,由
Ser63、Gly64 和 Val65 所组成,它们负责酶与底物的
结合,可能与底物形成氢键。在 GS 的保守区中,
Asp62 在所有的精氨酸激酶中均是高度保守的,但
在其他的磷酸原激酶中并非如此。它不是与底物的
结合有关,而是与底物的识别有特殊关系[22]。
在海参的研究中,N-末端序列的缺失,将显著
影响精氨酸激酶的结构稳定性和活性[9]。
在双亚基精氨酸激酶中,Trp-218 位于精氨酸
激酶的酶活性位点,将其突变为丙氨酸后,其酶活基
本丧失。同时发现,其对精氨酸激酶在构象的稳定
方面发挥重要的作用。Trp-208 没有位于精氨酸激
酶的酶活性位点,其可能有助于维持催化过程中二
聚体构象的稳定性。将其突变为丙氨酸后,其酶活
下降为原来的 70. 3%,使酶易于受到热变性的影
响。此外,Trp-208 可能也在蛋白正确折叠方面发
挥重要的作用[23]。
5 外界物质对精氨酸激酶的影响
渗透物(osmolytes)的存在有助于精氨酸激酶空
间结构的稳定,加强其对变性剂的抗性。通过试验
发现,相同浓度的 osmolytes对精氨酸激酶的稳定作
用由强到弱依次为脯氨酸、蔗糖、DMSO和甘油。过
量的二硫苏糖醇可以使 DNTB(5,5-二硫代双(2-硝
基苯甲酸) )修饰后的精氨酸激酶重新恢复活
性[24]。相关研究证明甘油、蔗糖和山梨醇可以促进
变性精氨酸激酶重新恢复活性[7]。
据报道,精氨酸的类似物(如刀豆氨酸、精胺、
硝酸精氨酸和高精氨酸等)对锥形虫中的精氨酸激
酶活性有抑制作用,其可能产生竞争性抑制[25]。
对于精氨酸激酶的催化反应而言,金属阳离子
是必需的。研究发现,对蝗虫的精氨酸激酶而言,
Mn2 +、Mg2 +对酶活产生促进作用,Zn2 +、Cu2 +对酶活
产生抑制作用[26]。而对于凡纳滨对虾的精氨酸激
酶而言,低浓度的 Na +、K +也表现出激活作用,这种
作用随着浓度的升高而消失;而 Cu2 +与 Mn2 +则表
现出完全的抑制。对于龙虾(H. vulgarus)精氨酸激
酶,Mn2 +、Mg2 +对催化反应有利,而 Cu2 +、Zn2 +均不
能参与此催化反应[12,27]。因此推断,由于不同种的
无脊椎动物所处的生存环境不同,因此精氨酸激酶
反应所需离子种类及浓度有所差异。
6 精氨酸激酶的进化与肌酸激酶的关系
最初人们认为,在磷酸原激酶家族中,精氨酸激
酶是最为原始的,其他(如肌酸激酶)是在此基础上
演化而来的。通过基因融合表达技术,人们将来自
海参的双亚基精氨酸激酶与兔子肌肉的肌酸激酶基
因相融合,表达后的蛋白有相似的二级结构、三级结
构、蛋白分子质量、结构及热力学稳定性,进一步证
明双亚基精氨酸激酶和肌酸激酶有更加密切的
关系[29,30]。
通过生物学软件对精氨酸激酶基因序列分析
表明,在进化方面,双亚基精氨酸激酶更接近于肌
酸激酶,但其催化位点仍与单亚基精氨酸激酶相
似,比较保守,说明来自不同生物的精氨酸激酶基
因具有同源性,是从共同的祖先基因进化而来[28]。
然而,在 N端的这些序列,看似不相关,但也明显地
暗示了精氨酸激酶的同源性是从一个共同的祖先进
化而来。与其他无脊椎动物的精氨酸激酶相比,尽
管海参的精氨酸激酶的氨基酸序列和基因的结构更
相似于肌酸激酶,但是此酶确实表现出精氨酸激酶
的活性[31]。
精氨酸激酶最少有 3 次独立的进化过程:第一
次是在磷酸原激酶进化的早期;第二次是从多细胞
动物的肌酸激酶的进一步进化;最后一次是在环节
动物的进化过程中,从线粒体肌酸激酶中进化。然
而,通过克隆其部分 cDNA 并制作系统发育树及动
力学分析,具有双亚基结构的精氨酸激酶在基因复
制和随后的融合事件中,可能还存在第四次进化
过程[28,32]。
7 利用精氨酸激酶对物种分类
辨别商业用虾及鱼的种类,这关系到正确的分
类、消费者的信誉以及渔民和生产者的利益等。目
前,对于鱼类的分类主要通过以 PCR为基础的对线
粒体进行分析。除此以外,细胞色素氧化酶 I 基因
和 16S rRNA基因也被用来分析。这也可以用到蛋
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白质组学的方法,例如 2-ED 和经典的蛋白电泳等。
可以利用 MALDI-TOF多肽指纹图谱及 PMF分析精
氨酸激酶的方法来对虾进行分类[33]。
8 展望
众所周知,精氨酸激酶广泛存在于无脊椎动物
体内,为其生命活动提供能量,并维持体内 ATP 的
平衡。目前,在精氨酸激酶蛋白性质、生理功能、蛋
白起源以及其与抗性方面的关系等研究中,不断取
得可喜进展。但精氨酸激酶的表达部位广泛,且在
无脊椎动物的整个生命周期内都有表达,在生物体
内的作用属于全局性调控,所以它与转录因子及相
关蛋白的互作方面的相关研究很少,还只是停留在
生物功能预测方面。此外,对精氨酸激酶的免疫力
及抗性关系量化,特异性表达等方面将会是今后研
究工作的重点。只有以现有工作为依托,将分子生
物学、蛋白质组学和基因工程手段有机结合,进一步
完善精氨酸激酶的相关信息,才能为今后的发展奠
定坚实的基础。
参 考 文 献
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