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研究报告

生物技术通报
BIOTECHNOLOGY
BULLETIN 2010年第 5期
葡萄病毒 B的 RT
PCR检测技术研究
杨相昆1, 2, 3 田海燕 2, 3 牛建新 1, 2 王林1, 2 代永欣 1, 2
( 1石河子大学农学院园艺系,石河子 832003; 2新疆兵团绿洲生态农业重点实验室,石河子 832003; 3新疆农垦科学院,石河子 832003 )


摘
要:
旨在建立适合葡萄的葡萄病毒 B的 RT
PCR检测技术。从感染葡萄病毒 B的葡萄皮层中提取总 RNA, 以其为
模板合成 cDNA第一链, 并利用两对引物分别进行 PCR扩增; 回收 PCR特异扩增产物,与 pUCm
T载体连接,并进行转化、重
组克隆的筛选、重组质粒的酶切鉴定和序列测定。结果显示, 两对引物均能获得与预期片段大小一致长约 460 bp和 470 bp的
扩增产物扩增片段序列与已报道 GVB序列 (序列号: X75448)的核苷酸同源性均为 81% , 经反复多次试验证实,利用总 RNA
为模板合成 cDNA并进行 PCR扩增检测 GVB是准确、可靠的。
关键词:
葡萄病毒 B 检测 重组质粒 序列 同源性
Study on the Detection ofGrapevine Virus B by RT
PCR
Yang X iangkun
1, 2, 3
T ianH a iyan
2, 3
N iu Jianx in
1, 2
W ang L in
1, 2
Da iYongx in1, 2
(
1
D epartm ent of H orticulture, Agronomy Co llege of Shihez i University, Shihezi 832003;
2
K ey Laboratory of OasisEcology Agriculture of X injiang B ingtuan, Shihezi 832003;
3
X injiang A cademy of Farm land Reclamation, Shihez i 832003)


Abstrac:t
The study w as to estab lish a RT
PCR system adaptive to the grapev ine v irus B( GVB) o f g rapev ine. The tota lRNA, ex

tracted from grapev ine v irus B ( GVB)
infected G rapev ine phloem tissue, was used as temp la te to synthesize the first stra in cDNAs. The
cDNAs w ere used fo r the amp lifica tion o f GVB by PCR. The PCR products we re exc ised from the gel and purified using the UNIQ
10
Ge l Pur ification k it. The pu rified RT
PCR products w ere then cloned into the pUCm
T Vec to r, and DNA sequencing w as carried out by
deoxynuc leo tide cha in term ination prim ed w ith T7 andM 13+ / - pr im ers from the vecto r. Result show ed tha t about 460 bp and 470 bp
fragm en ts o fGVB were obta ined based on optim ized sy stem. The nuc leo tide sequences w ere ana ly sed using the DNAMAN and BLAST
softw are. Com pared w ith GVB iso late reported on GenBank( Access ion No. X75448), it show ed that bo th of the isolates obta ined here
represen ted 81% identityw ith it a t the sequence leve l o f nuc leotide. The study proved that a ll o f these ind icated that the PCR m ethod is
re liable fo r detecting GVB.
Key words:
G rapev ine v irus B ( GVB) De tection
Recomb ined plasm id Sequence H om o logy
收稿日期: 2009
12
06
基金项目:国家自然科学基金资助项目 ( 30060053, 30360066) ,兵团科委项目 (NKB02SDXNK01SW )
作者简介:杨相昆,男,硕士,从事果树生物技术研究; E
m a i:l s tarryyang@ sina. com
通讯作者:牛建新,男,博士,教授,博士生导师,从事果树生物技术研究; E
m ai:l n jx105@ 163. com
葡萄栓皮病 ( grapevine corky bark, GCB)属于粗
皮综合症 ( rugose w ood complex, RW )的一种, 1997
年第 12届国际葡萄病毒类病毒研究大会 ( In terna

t iona l Council for the Study o f V irus and V irus
like
D isease of the G rapev ine, ICVG )将葡萄栓皮病的病
原确定为葡萄病毒 B ( grapev ine v irus B, GVB ) [ 1 ] ,
GVB于 1999年在澳大利亚第一次被检出,随后在澳
大利亚其它葡萄栽培种及砧木上被检出 [ 2]。Ryo ji
[ 3]等也相继利用 RT
PCR对 GVB进行了检测,但该
病毒在国内的研究尚属空白, 本试验成功的对葡萄
( Vitis vin if era L. )上的 GVB进行了 RT
PCR检测,
并对扩增出的目的片段进行回收、克隆、测序, 以期
为对此病毒进行进一步的分子生物学研究奠定
基础。
生物技术通报 B iotechnology
Bulletin 2010年第 5期
1
材料与方法
1
1
植株、试剂及仪器
供试材料葡萄枝条采自石河子大学校园内, 4

保存备用。TaqDNA聚合酶 ( 5 U /
L)购自北京华美
生物工程有限公司;核糖核酸酶抑制剂 (R ibonuclease
inh ib itor, 40 U /
L, MB I)、逆转录酶 ( ReverA idTM M

MuLV Reverse T ranscriptase, 200 U /
L, FB I)、dNTPs
( 10mmo l/L )、Puc19 DNA /M sp
(H ap
) M arker( 0
5

g /
L)、GeneRu lerTM DNA LaderM ix ( 0
5
g /
L )、
GeneRuler
TM
100 bpDNA Lader( 0
5
g /
L)、UN IQ
10
柱式 DNA胶回收试剂盒、PCR产物克隆试剂盒
( PCR Product C lon ing K it)均购于上海生工生物工
程技术服务有限公司;限制性内切酶 P st I购于大连
宝生物公司。大肠杆菌菌株 XL1
b lue感受态由石
河子大学农学院果树生物技术实验室自备; 其余常
规试剂均为国产分析纯。
PCR 仪 为 BIO
RAD MYCyc ler Thermal Cycler,
GPS8000DPC凝胶成像系统, E ppendorf 5417R台式
高速冷冻离心机。
1
2
总 RNA的提取
利用皮层为材料, 方法参照文献 [ 4] , 取 5
L
总 RNA在含溴化乙锭 ( EB)的 1
0%的琼脂糖凝胶
中进行电泳鉴定,电泳缓冲液为 1
TAE, 泳动速率
为 14V /cm,紫外灯下观察试验结果。
1
3
GVB的 RT
PCR扩增
根据 NCBI中已发表的 GVB序列 ( GenBank登
录号: X75448) ,并参照相关文献 [ 5, 6]设计而成,同
源引物 ( P1 ) : 6980
5
GTGCTAAGAACGTCTTCA

CAGC 3

7001; 互补引物 ( P2 ) : 7439
5
ATCAG

CAAACACGCTTGAACCG 3

7418。引物位置位于
ORF5内,预计扩增片段大小为 460 bp。同源引物
( P3 ) : 4397
5
ACACTGATCTTGACAAATGG 3


4420; 互补引物 ( P4 ) : 4867
5
TCGGATCCTTCA

CAATGCCATA 3

4847。引物位置位于 ORF1内,预
计扩增片段大小为 470 bp。以上引物均由上海生工
生物工程技术服务有限公司合成。
采用 FB I公司生产的 ReverA idTM M
MuLV Re

verse T ranscriptase,反应体系为 25
L, 其中总 RNA
2
L、引物 P2 1
L、DEPC处理水 12
5
L、M
MuLV
5
bu ffer 5
L、dNTPsM ix ture( 10mmol /L ) 2
5
L,
R ibonuc lease inhibitor 1
L, R everA idTMM
MuLV R e

verse Transcriptase 1
L。放入 PCR仪 ( PTC
100TM
Programmab le Therma l Contro ller )进行以下反应:
25
引物退火 10 m in, 42
反应 45 m in, 99
灭活 5
m in, 即获得 cDNA第一链, 可即用于 PCR反应或保
存于 - 20
备用。以互补引物 P4作为特异性引物
进行反转录时,体系同引物 P2,方法参考 ReverA idTM
M
MuLV Reverse T ranscriptase操作说明书。
参考 Taq聚合酶使用说明, PCR反应体系为 20

L, 其中 cDNA 2
0
L, 10
PCR Bu ffer (不含
Mg
2+
) 2
0
L, P1 ( 20
mo l/L )、P2 ( 20
mol/L )各
1
0
L, M gCL2 ( 20 mmo l/L ) 1
2
L, dNTPsM ixture
( 10 mmo l/L ) 0
6
L, TaqDNA聚合酶 ( 5 U /
L) 0
4

L, ddH2O补足至 20
L,上面覆盖一层石蜡油, 放
入 PCR仪进行扩增, 扩增程序: 94
预变性 5 m in;
94
30 s, 56
45 s, 72o 60 s, 共 35个循环; 最后
72
延伸 7 m in。引物 P3、P4组合 MgCL2 ( 20 mmo l/
L )用量为 1
3
L,退火温度降为 53
,其余同引物
P1、P2。
取 5
L上述 PCR产物在含溴化乙锭 ( EB )的
1
5%的琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定,电泳缓冲液为
1
TAE, 泳动速率为 7 V /cm, 紫外灯下观察试验
结果。
1
4
GVB特异性扩增片段的克隆与测序
将 PCR产物在含溴化乙锭 ( EB )的 1
0%的琼
脂糖凝胶中进行电泳, 参照 Puc19 DNA /M sp
(H ap

)M arker以及 GeneRulerTM 100 bpDNA Lader,分别
切取约 460 bp与 470 bp的目的条带,应用 UN IQ
10
柱式 DNA胶回收试剂盒 ( Sangon)回收目的片段, 操
作按照产品使用说明进行。按 PCR Product C loning
K it( Sangon)操作说明, 16
连接 pUCm
T V ector 16
h。转化大肠杆菌菌株 XL1
blue感受态细胞, 于含
有 X
Gal、IPTG、氨苄青霉素的 LB固体培养基上进
行蓝白斑筛选,碱裂解法提取质粒,并对此质粒进行
PCR鉴定与 P st I单酶切鉴定。质粒 PCR反应体系
同前, 第一步变性时间延长至 60 s。酶切体系包括
提纯质粒 5
L、P st I限制性内切酶 1
L; 适宜的反
应缓冲液 1
L、ddH2O 3
L。37
保温 60m in。
将鉴定出含阳性重组质粒的大肠杆菌菌液送上
海生工生物工程技术服务有限公司测序。测序结果
98
2010年第 5期 杨相昆等:葡萄病毒 B的 RT
PCR检测技术研究
提交 NCBI网站中 BLAST, 进行在线序列比较分析。
2
结果与分析
2
1
总 RNA检测和 RT
PCR扩增
试验表明,本试验所提取的总 RNA完整性较好
(图 1) ,可用于 cDNA第一链的合成以及 PCR扩增。
利用 PCR扩增, 分别获得了 460 bp与 470 bp左右
的特异性条带, 与预期设计的扩增片段大小相符
(图 2)。
2
2
GVB特异性扩增片段克隆及序列分析
提取质粒 DNA, 进行 P st I单酶切鉴定与 PCR
鉴定,都能得到与目标片段大小一致的目标条带
(图 3, 图 4), 说明目的片段已成功克隆到 pUCm
T
载体中。
图 1
总 RNA完整性凝胶电泳分析 A: M. Pu c19 DNA /M sp
(H ap
)M arker; 1. PCR产物
B: M. G eneRu lerTM 100bp DNA Lad er; 1. PCR产物
图 3
重组质粒的 PCR鉴定
A : M. Pu c19 DNA /M sp
(H ap
)M arker; 1. PCR产物
B: M . G eneRu lerTM 100 bp DNA Lader; 1: PCR产物
图 2
GVB RT
PCR产物凝胶电泳
图 4
重组质粒的酶切鉴定


将鉴定出含阳性重组质粒的大肠杆菌菌液送上
海生工生物工程技术服务有限公司测序。所测得序
列见图 5。将 GVB特异性扩增片段的测序结果提
交 NCB I网站中 BLAST,进行比对分析。结果表明,
GVB用特异性引物成功地扩增出特异性片段, 扩增
片段分别有 460 bp与 470 bp, 与 GenBank中的 GVB
序列 (登录号: X75448)进行比对, 同源性均达 81%
(序列中阴影部分为与 X75448不同的序列 )。从而
进一步验证了利用总 RNA为模板合成 cDNA并进
行 PCR扩增检测 GVB的准确性,可靠性。
3
讨论
以病毒核酸为基础的分子生物学检测方法,因其
具有灵敏度高、适用范围广,不受时间限制和操作简
便快速等优势而逐步成为最受欢迎的果树病毒检测
方法。其中 RT
PCR方法在果树病毒检测中应用最
为广泛,技术最为成熟。GVB于 1999年在澳大利亚
99
生物技术通报 B iotechnology
Bulletin 2010年第 5期
图 5 测序结果
第一次被检出后 [ 2]。N assuth[ 7]、N akaune[ 8 ]等相继
利用 RT
PCR对 GVB进行了检测, 但由于 RNA极
易降解, 而空气中 RNA酶普遍存在,因此在具体的
试验中快速操作,使用简化的试验步骤, 减少 RNA
暴露在空气中的时间, 成为试验成功与否的关键。
本试验所采用的反转录方法较传统的方法减少了水
浴、冰浴等繁琐的步骤,所有药品一次加完, 简化了
试验步骤,缩短了操作时间, 减少了污染的机会,大
大增加了试验成功的可能性。
植物病毒在长期的进化过程中, 经常与植物
RNA发生重组 ( RNA
RNA recomb ination) ,且在不同
的地理条件下存在株系分化,这就使得植物病毒的
变异非常广泛。 Shi[ 6] 等利用 GVB编码复制酶
( ORF1 )、外壳蛋白 ( ORF2 )、核苷酸结合蛋白
( ORF3)的基因序列设计引物, 对来自澳大利亚、意
大利、以色列的 20份葡萄样本进行了检测, 并将核
苷酸序列和氨基酸序列与 GenBank中 GVB序列
(登录号: X75448)的进行同源性比较,结果表明,基
因间隔区 ( intergenic reg ion)变异幅度最大 (同源性
为 73
2% - 97
6% ), 由 ORF4编码的外壳蛋白变
异幅度最小 (同源性为 81
3% - 99
6% )。ORF1变
异幅度从 80
3% - 99
8%, ORF5变异幅度从 76%
- 99
2% ,而且每个区域的变异幅度都是核苷酸序
列大于氨基酸序列。本试验所测序列位置分别位于
ORF1和 ORF5内,与 X75448相比较,核苷酸序列同
源性均为 81%,这与 Shi [ 6]的结果是一致的。检测
到的病毒是否属于不同的株系分化, 还有待于进一
步的考证。
国外对 GVB的研究已经相当深入,但目前该病
毒在国内的研究尚属空白,鲜见利用此技术对 GVB
进行检测的公开报道, 本试验成功地对葡萄 ( Vitis
vinif era L. )上的 GVB进行了 RT
PCR检测, 并对扩
增出的目的片段进行回收,克隆, 测序。下一步对此
病毒研究的重点应是利用电镜观察、生物学测定和
免疫学鉴定对该病毒进行全面研究, 并完成该病毒
的全基因组序列分析,在此基础上明确该病毒在国
内的株系分化情况以及分布情况。
参 考 文 献
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(下转第 106页 )
100
生物技术通报 B iotechnology
Bulletin 2010年第 5期
研磨提取的甘蔗基因组 DNA产量和质量与加液氮
研磨没有差别。表明,在加液氮研磨是没有必要的,
这不仅简化了操作步骤,节约成本,还对难以购买到
液氮地区或提取样品数量很少的研究很有意义。
不过在试验过程中发现,对于叶龄长的成熟叶
片,加液氮更易磨碎叶片。所以,当研磨大批量叶龄
长的成熟叶片时, 加液氮可以提高效率。但对少量
样品, 多花点力气研磨,同样可以达到很好的提取效
果;而对于幼嫩叶片, 没必要加液氮研磨。
参 考 文 献
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