全 文 ：生物杖术通推
旅 述 与 专 论 刀了口2百C 召四p 乙口 6 Y B U L L E TJ W 2 (X 为 年 增 刊
植物原生质体的制备与活力检测研究进展
王莉 妇匕占军
(河北农业大学 农学院,保定 07 10 1)
摘 共: 原生质体是进行枝物遗传改良和细胞各种生理生化特性研究的平台本文对近些年制备原生质体的材料选择
预处理 游离 纯化和活力检浏等方面的研究进展进行了综述 ,分析了影响原生质体的分离和纯化的有关因素 ,并根据相关文
故讨论了今后原生质体重点研究方向
关. 词 : 原生质体 游离 纯化 活力检浏
A dvances on the P re Parati on and V ita lity T esti ng fo r
Pl a址 P ro t0 P las t
W an g 1 Y ao Z ha nj un
(A ic政 耐 口九加ers 姆 of He be i Co lle邵 of A乎ono my , 刀仪以咭 07 10 1)
月拍t心 : pro to p last P ro vi ded : p h tfo rm fo r ph nt 子netie im pro vem en ts an d cllaracteri s石e res ear ch on cel ph iofo 盯 胡d
bio ch ~ try . In d 云 5 PaP er. w e suna ze d an d revi ew ed th e advan ces fo r seleetio n of Plan t ma te ri al , Pre 一diS Po 泪 tZe atIn en匕, 叻 lati on ,
Puri fi 叻 on an d vit ali ty tes tin g . 阮 to rs fo r 15 0肠tio n and Pu ri fic涵o n we re 翻目ys ed . o n bo is o f re een t re searc hes , 二 n di re etio n fo r th e
aP 帅 ca don of护lan tPro to Plast w as d七eus ed Th e u liza rion ofPro tOP last ha d a brigh tprosP eeton 子netie Im Pro veme no .
K e y wo ld s : Proto p场r Iso la ti on Pu 汕 二 o n v ital ity to tin g
原生质体是裸露的 具有生命活性的细胞 ,体 草 l7]和甜瓜与西瓜I8]等多种植物的体细胞杂种 原
内包裹着细胞核 细胞器 细胞质等 ,因此原生质体 生质体对于改良品种 建立新的杂交种和进一步探
具有再生细胞壁 进行连续分裂并生成完整植株的 索生命机理有重要意义 下面就原生质体的材料选
能力 , 即具有细胞全能性 原生质体能摄人如 择 预处理 游离 纯化和活力检测等方面进行了一
DN A 质粒 病毒 细菌 细胞器等外源物质 ,是植物 些论述 ,以供参考
细胞工程进行遗传操作 基因转移的良好材料还 1 材料的选择与预处理
可以进行原生质体融合 ,改变遗传物质 ,建立杂交 1.1 材料的选择
品种 ,同时可以用于研究染色体行为 基因定位等 植物体的幼嫩部分是制备原生质体的理想材
迄今为止已在小麦1 大豆lz 玉米13 水稻Il 棉花 料 双子叶植物的幼叶 子叶 根和下胚轴的切段通
阎马铃薯16 番茄17 草落阁苹果I9j 桑树 l0j 柑橘I川 常被用来制备原生质体 19 王红霞侧选择芦荟的幼
和荔枝 12 等多种植物中获得原生质体再生植株 ,并 叶作为原生质体分离的材料 范春丽等在游离甘蓝
得到了小麦与长穗燕麦草 l3] ,普通小麦与无芒雀麦 型黄籽油菜原生质体时采用无菌苗的子叶和下胚
洲,小麦与谷子115 ,小麦与玉米[l6 ,水稻与非洲狼尾 轴 牛英Izl 采用红麻的下胚轴作为原生质体分离的
收稿 日期 二2以为一03一10
基金项目:河北省 自然科学基金 (2(X) 7砚刀叫70 ),河北省教育厅博士基金项 目(BZ口少协9() ),中巴国际合作项 目(16 一40 8 )
作者简介 :王莉(198 6一),女 ,河北安国人 ,硕士生 ,研究方向为小麦遗传育种及生物技术;E一画 l:11一w朗解3@ 163 .co m
通讯作者 :姚占军(l % 5一) ,男 ,河北平泉人 ,教授 ,博士;E一画 l;yzh201 @y 曲o .com .cn
2 O( 为 年增 刊 王莉等:植物原生质体的制备与活力检测研究进展
材料 有时也用成熟叶片制备原生质体 ,需要将叶
片的下表皮撕去 , 以便酶液可以与叶肉组织作用
单子叶植物 ,特别是禾谷类植物的表面通常含有硅
质 ,不易被酶液降解 , 因而不适于作为原生质体制
备的起始材料 对于禾谷类植物而言 ,疏松易碎的
愈伤组织或悬浮细胞是制备原生质的理想材料 ,但
也有用大麦幼叶分离出原生质体的例子l叫无论利
用哪一种材料 ,保持材料的培养条件的相对稳定是
十分重要的
1.2 材料的预处理
在酶解前有时需要通过对材料的预处理 ,改变
细胞和细胞壁的生理状态 , 增加细胞膜的强度 ,达
到提高细胞壁酶解的效率和减少原生质体损伤的
目的 丁爱萍l9]在提取苹果原生质体时 ,将组培苗
在超净工作台上吹风约 20 m in ,使叶片萎蔫 ,撕去
下表皮分离原生质体 景艳春圈把无菌新疆杨树苗
的幼叶切成 0. 5 ~ 的细条 ,置于附加 0. 7 m ol lL 甘
露醇 pH 5. 7 的 CPW 盐溶液 中预质壁分离 1一1.5
h 马占强l叫在分离紫罗兰下胚轴原生质体时 ,将纵
切后的下胚轴置于 CpW 一13 M (C pW +l 3% 甘露醇)
中质壁分离 l h 柳玉晶问对百合叶片进行预处理 ,
证明在原生质体产量方面 13 % 甘露醇预处理和黑
暗处理极显著于愈伤组织培养基预培养和低温处
理 ;原生质体活力方面愈伤组织培养基预培养极显
著于 13 % 甘露醇预处理 黑暗处理 低温处理 , 13
% 甘露醇预处理 黑暗处理极显著于低温处理 据
在豌豆阴上的试验 ,在分离原生质体前 ,将在室温
内生长 5一 7 w k 的豌豆枝条取下后 , 移到黑暗中至
少放置 3O h , 这样从叶片获得的原生质体活力高 ,
并能继续分裂 在正常培养基中生长的草毒试管苗
幼叶 ,酶解仅能产生少量原生质体 ,如果在分离前
将其转人降低了蔗糖浓度的培养基中预培养 2一3
wk ,则原生质体的产量和活力均大大提高圈 据在
羽衣甘蓝上的试验 ,去掉下表皮的叶片 ,将其放在
诱导愈伤组织的培养基上预培养 7 d , 然后用酶液
脱壁 ,原生质体的分离频率比未处理的高得多 荔
枝固的胚性细胞悬浮培养物经高渗透压预处理后 ,
离心分离时原生质体的破裂大大减少 ,可保持原生
质体的完整性 ,还减轻了原生质体分离时的聚集和
自发融合现象发生 ,提高了原生质体的产率和存活
率
2 原生质体的游离
2.1 机械法
机械法是在高渗溶液中 , 细胞进行质壁分离 ,
细胞内的物质渗出 ,接着植物组织被分割并发生质
壁分离复原从而释放出原生质体 当酶解法有副作
用时 ,机械法是很有用的一种方法 29] 此方法只
限定于特定组织 ,只有储藏组织中较大的 高度液
泡化的细胞才能用此方法分离原生质体 ,如洋葱球
茎鳞片 胡萝 卜甜菜根组织等 但是破碎细胞释放
的物质的存在使原生质体活力很低
2. 2 酶解法
英国诺丁汉大学的 Co ki ng 在 1960 年证实 了
用酶从高等植物中分离出原生质体的可能性 该方
法具有条件温和 原生质体完整性好 活力高 产率
高等优点 ,从而被广泛使用 常用的酶有纤维素酶
和果胶酶 ,混合使用可同时完成细胞的解离与细胞
壁的分解 如果分离根尖原生质体则加上崩溃酶 ,
Ge o飞 e Kom is脚l在分离小麦 (Tri tieum turgl dum )根尖
原生质体时使用了崩溃酶 (d ris el as e) 分离愈伤组织
原生质体时常加上半纤维素酶 从花粉中分离原生
质体时常常加上蜗牛酶 ,对抱粉素和木质素均有一
定的分解能力
为了保持释放出的原生质体的活力和膜稳定
性 ,酶液的渗透压必须与处理的细胞的渗透压相近
似 通常加人葡萄糖 甘露醉或山梨醇等渗透压调
节剂来调节酶液的渗透压13 ,使用的浓度范围随植
物材料的不同而异 ,一般为 0.35~0.8 m ol 几 对同一
植物而言 ,子叶和下胚轴游离原生质体时需要的渗
透压最高 ,愈伤组织次之 ,胚性悬浮细胞要求渗透
压最低 酶溶液 pH 值对原生质体的产量和活力有
重要的影响 ,最适 pH 值为 5.4一5. 8 ,如 pH 值降至
4.8 ,则原生质体破裂 此外 ,酶中还须加人 M ES( 吗
琳乙基磺酸 )作为 pH 缓冲调节剂对于保持酶解物
的酸碱环境起缓冲作用 ,可以增加原生质体的释放
量和原生质体的稳定性I32] 也可加人 CaCl 2( 浓度范
围为 0.1一 10 m m ol/L ) K H ZP04 (0.75 m m ol/L ) 聚乙
烯毗咯烷酮(PV p )或葡聚糖硫酸钾 (pD s 卯tassium
de xt ra n su lphat e) ,它们可以提高原生质体膜的稳定
性圈 向凤宁囚从小麦胚性愈伤组织中提取原生质
健物杖术通很 B勿te Chno 匆g梦 2 X 旧年 增 刊
体时的酶液配制为 :1.5 % (w八)纤维素酶(Celulaes
o nouzka RS), 0.3 % (w/v) 果胶酶 (Pe eto lyas e Y -
23) , snu ol/L M ES , 0.6 m ol/L 甘露醉 , snu ol/L Ca-
C12 , pH 5.8 W ang 5 C Il在从拟南芥叶片中分离原
生质体时的酶液配制为 :1% (w八)纤维素酶(ce nu-
lase R 一10 ) , 0.25% (w/v) 果胶酶 (m aeero zym e R -
10 ) , 0.4 m ol/L 甘 露醇 , 80 m m ol/L CaC12 , 和 20
nu ollL M ES , pH 5.7 孙玉强l肠l从棉花下胚轴和胚
根中提取原生质体时的酶液配制为 :3 % (w /v) 纤维
素酶 (o nozuka R , 10 ) , 1.5 % (w八)果胶酶和 0.5 %
(w/v)半纤维素酶溶于 C PW g 溶液中配制成基本酶
液 , 添加 M Es 15.369 卜m ollL , 9% 甘 露醇 , pH 为
5.8 Fan L.M .网分离拟南芥花粉原生质体时的酶液
配制为 l % (w lv)纤维素酶(eelul as e R 一10), 0.5%
(w/v)果胶酶(m aeero 叮me R 一10), 0.2 % (w /v)葡聚糖
硫酸钾 (PD S)和 0.2 % (w八)的 BSA 还有人加人少
量 A gN 03 减少酶解时产生的乙烯国, 以及加人过
氧化物歧化酶减轻 0 2一自由基对细胞膜的损伤 在
配制酶液时可加人少量牛血清白蛋白(BSA ) ,以保
持原生质体的稳定 , 促进原生质体再生 Je ns B.
H afk el 划在分离蚕豆叶片原生质体的酶液配制为 :
0.5% (w lv) 纤维素酶 (eellulas e onuzuka R S) ,
0.03% (w lv)果胶酶(Pe etolyas e Y 一23), 0.4 m ul /L 甘
露 醇 , 0.1 mo l/L KCI, 5 nu ollL M 邪12 , 1 nuo llL
D竹 , 0.2% (w lv) PV P , 0.5% (wlv) BSA , 25 nu ol/L
M E S ,pH S.7 酶溶液配制完成后可用孔径为 0. 45
卜m 或 0. 2 林m 的微孔滤膜过滤灭菌备用
当供体材料是叶片 下胚轴或根时 ,可将其切
成 0. 5~ 宽的细条 ;当供体材料是愈伤组织时 ,可
将其直接放人到酶液中进行酶解 ;当供体材料是悬
浮细胞系时 ,可以离心浓缩 ,收集细胞进行酶解 一
般将材料放到 3.5 m m 的培养皿中进行酶解 材料
和酶液的体积比大约为 1:10 酶解时间因材料而
异 ,叶片 下胚轴或跟等需要 3一6h 即可 ,而愈伤组
织和悬浮细胞系则需过夜 酶解温度控制在 25 一
30 的范围 光照可能引起质膜的损伤 ,使原生质
体活力下降 ,故酶解物应放在黑暗或弱光下进行酶
解 酶解在静置条件下进行时应间隔一段时间轻轻
摇动几下 ,也可将培养皿放到 4D rl而n 的摇床上进
行游离原生质体
3 原生质体的纯化与活力检测
原生质体的纯化供体材料经酶解处理消化后 ,
得到的是一种混合物 ,除了含有完整的未受损的原
生质体外 ,还有未被消化的细胞 破裂的原生质体
细胞器等成分等 ,因而必须去除杂质 去除大块碎
屑的方法是将酶解后的混合物通过 40 一10 林m 的
网筛进行过滤 ,通过离心进一步纯化 目前 ,进行原
生质体纯化的方法有沉降法 漂浮法 界面法 吕长
平等刚在刺葡萄原生质体分离研究试验中用沉降
法得到T 纯化的原生质体 P ,D丽eu 和 S.J.oe瘫tl4,]
在纯化豌豆 (R sum sa tivum L.) 和山燕豆 (巨th yus
sat iv us L.)时 ,使原生质体漂浮在含有 21 % 的 CPW
溶液上而纯化 张颖l2] 在唐营蒲原生质体纯化中采
用界面法纯化原生质体获得了较好的结果
检测原生质体活力的最常用的染色方法有荧
光素二乙酸(FD A )染色法 酚藏花红染色法 , 台盼
兰染色法和荧光增白剂(CFW )染色法 贺辉在检测
草木择原生质体活力时用工作浓度为 0.0 1 % 的
FDA 进行染色 ,在紫外激发下 ,发黄绿色的为有活
力的 ,不发荧光的为死的原生质体 王红霞侧在检
测芦荟原生质体时使用工作浓度为 0. 01 % 的酚藏
花红进行染色 , 无生命力的原生质体被染成红色 ,
活的原生质体无色 黄静143 在对烟草原生质体活力
检测时发现 FDA 染色效果较好 , 比台盼兰染色清
晰 ,并且更适用于不同来源的原生质体 ,不会受到
叶绿体等内含物的干扰 此外活力检测方法还有完
整细胞膜的排斥 Evans 蓝染料法 ,观察胞质环流法
检测有活力的代谢 ,随渗透改变的原生质体体积变
化 , 用氧电极测放氧从而检测代表活力的呼吸代
谢 ,光合作用研究等
4 原生质体的应用前. 与存在的问题
4 .1 原生质体的应用前景
没有细胞壁的原生质体可以像动物细胞和徽
生物一样进行操作 ,使研究 微型化 ,它为细胞生
物学 发育生物学 细胞生理学 ,甚至病毒学建立了
试验体系 El is abe ta one il I41 利用烟草原生质体来
研究囊泡运输的机制 Raj iv D ut ta 和 Ke~ th R.
R比inso n ll利用康香百合 (u lium longi noru m )花粉
原生质体来描述和鉴定花粉管伸长时 CaZ +和 K +
离子通道的作用 V ad im V of ko v等阅利用大麦的原
2 X 旧 年 增 刊 王莉等 :植物原生质体的制备与活力检测研究进展
生质体来研究生长的和不生长叶中水的通透性的
不同 以原生质体植株再生技术为基础 ,利用体细
胞杂交技术转移胞质雄性不育基因 多基因和基因
组以及某些野生抗性性状等方面 ,将是未来研究的
主流 单雷网利用小麦与高冰草体细胞杂种耐盐新
品种山融 3 号来研究小麦的耐盐机理及耐盐性的
遗传基础 刘广华圈通过原生质体融合获得了小麦
与鹅观草的体细胞杂种 ,为进一步小麦育种实践提
高基础材料 陶龙兴下l; 把非洲狼尾草作为基因供体
与水稻原生质体进行细胞融合 ,有可能实现高光效
特性在水稻中的表现 ,促进水稻生产潜力更大的发
挥 胡琼刚利用甘蓝型油菜品种双 4 号与新孤野生
油菜野油 18 进行对称性体细胞融合 , 获得了甘蓝
型油菜细胞质雄性不育系 徐小勇1 ]将温州蜜柑控
制雄性不育的胞质因子转人有籽品种中 ,获得了新
的柑橘无核种质 蔡兴奎倒以马铃薯栽培品种 中
薯二号 经授粉诱导产生的无性系 3# 8# (2n 二4x 二
45)和野生种 (s.ehaeoe nse Zn二4x 二48)的原生质体进
行融合 ,获得了抗青枯病的马铃薯新种质 原生质
体培养和体细胞杂交拉术与遗传转化技术相辅相
成 ,与常规育种技术结合起来 ,将为植物基因组之
间的结合和相互作用以及新品种的培育提供了无
限的可能性
4. 2 利用原生质体时存在的问题
近 20 年来 , 植物原生质体培养技术得到了迅
速的发展 ,并取得 了可喜的成绩 ,主要表现在通过
原生质体获得再生植株的植物种类不断增加 ,包括
林木观赏植物 药用植物 果树和作物等 ,但仍然存
在原生质体分离困难 活力不高 植板率低 培养周
期长 畸形率高 ,不能控制杂交数 目,体细胞杂种再
生困难 ,再生植株遗传不稳定或寿命短等问题 在
原生质体培养成功的报道中 ,大多数采用愈伤组织
悬浮细胞系或胚性悬浮系作为分离原生质体的起
始材料 ,较其他器官而言 ,可得到较高产量和活力
的原生质体 ,且分离的原生质体较易培养 但要培
养悬浮细胞系需较长时间 因此 ,应着重改善培养
条件 ,主要包括 :选用合适的培养基(包括培养基种
类 添加物 激素种类及水平等 )及培养方式 ;根据
培养物状态适时改换适宜培养基 ;选择合适的外植
体及诱导时期 通过不断摸索研究 .进一步完善和
建立适宜不同基因型的高效培养体系 ,以缩短悬浮
细胞系培养的周期 随着分子生物学 细胞生物学
技术的不断完善 ,原生质体在一系列基础研究中的
应用具有更重要的意义
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(上接第 35 页)
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