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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010 年第 6 期
产河豚毒素菌株的分离鉴定
王少蓉 郁昂
(厦门大学 近海海洋环境科学国家重点实验室 环境科学研究中心，厦门 361005)
摘 要: 从厦门同安海域的黄鳍东方豚(Fugu xanthopterus)卵巢组织中分离纯化出 59 株菌株，通过小鼠试验筛选出 11
株产毒菌株，并对其中产毒能力较强的 EL10 菌株的发酵产物进行高效液相色谱分析，初步认定发酵产物中含有河豚毒素。
同时对 EL10 菌株进行 16S rDNA鉴定，结果表明该菌属于希瓦氏菌属(Shewanella)。
关键词: 河豚毒素 高效液相色谱法 16S rDNA 希瓦氏菌
Isolation and Identificaition of an Efficient TTX-producing Bacterium
Wang Shaorong Yu Ang
(State Key Laboratory of Marine Environmental Science，
Environmental Science Research Center，Xiamen University，Xiamen 361005)
Abstract: The study showed that 59 strains of bacteria were isolated from the ovaries of Fugu xanthopterus，among which，
11strains of poisonous bacteria were found by mouse test. Result indicated that that strain EL10 could produce tetrodotoxin through
HPLC，which was identified as Shewanella based on its physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA sequence.
Key words: Tetrodotoxin HPLC 16S rDNA Shewanella
收稿日期:2010-01-04
作者简介:王少蓉，女，硕士研究生，研究方向:环境毒理学;E-mail:wangsr. 0829@ 163. com
通讯作者:郁昂，助理教授，E-mail:yuang@ xmu. edu. cn
河豚毒素(Tetrodotoxin，TTX)是一种剧毒的非
蛋白天然毒素，它能选择性的与细胞膜表面 Na +通
道上的蛋白质受体结合，阻断 Na +内流，从而抑制
神经冲动的传导［1］，其毒性是氰化钠的 1 250 倍［2］。
TTX对小鼠的半致死剂量 LD50约为 8 μg /kg，对人
的最小致死剂量只有 0 5 － 1 0 mg［3］。但 TTX作为
一种重要的工具药，广泛应用于生理学和药理学研
究。TTX可用来镇痛、镇静、抗心律失常、预防肾功
能衰竭及降血压等，还可作为广谱抗生素的代替药
物。同时，TTX 的麻醉作用比一般麻醉药强 1 000
倍以上，而且具有不成瘾的优点，可取代化学药物和
中草药戒毒，且无副作用。
TTX存在于河豚鱼、卷贝、虾虎鱼、蓝斑章鱼、以
及海星等众多的海洋生物中，20 世纪 90 年代，许多
科学家陆续从多种含 TTX 的动物体内分离到一些
可发酵产生 TTX类似物的细菌及放线菌［4 － 6］，初步
证实了 TTX 的微生物起源假说。本试验采集了厦
门同安海域的黄鳍东方豚，对其卵巢组织中的细菌
进行分离纯化，并对其发酵产物中的毒性作了初步
检测。同时对产毒能力较强的 EL10 菌株进行了生
物学特性研究及 16S rDNA序列分析。
1 材料与方法
1 1 材料
1 1 1 试验动物 黄鳍东方豚 捕自厦门同安海
域;昆明小鼠(19 － 21 g)由厦门大学医学院抗癌中
心提供。
1 1 2 试剂 TTX 标准品购于大连瑞芳生化物品
有限公司。
1 1 3 培养基 改良 ZoBell 2216E 培养基:蛋白胨
6 g，酵母膏 10 g，蔗糖 20 g，NaCl 10 g，KH2PO4 2 5
g，水 1 000 mL。改良 Emerson 培养基:蛋白胨 4 g，
酵母膏 10 g，牛肉膏 4 g，葡萄糖 10 g，水 250 mL，海
水 750 mL。
1 2 方法
1 2 1 菌株分离纯化 将采集到的黄鳍东方豚样
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2010 年第 6 期
品在无菌条件下分离出卵巢，将其剪碎，并用无菌海
水进行系列稀释，得到系列浓度梯度菌悬液。取
200 μL不同浓度菌悬液涂布于培养基中，放置于
28℃恒温培养箱中培养，并分离纯化培养出的细菌。
1 2 2 发酵液前处理 将分离纯化的菌株接种于
液体培养基中，28℃ 200 r /min，发酵 48 h。离心收
集菌体，用 0 1%乙酸悬浮，超声破碎，并 100℃煮沸
10 min，离心得毒素粗提液。
1 2 3 小鼠试验处理 取 1 mL 粗提液对 20 g 左
右的昆明雄性小鼠腹腔注射，并观察其症状。
1 2 4 EL10 细菌产毒物质(TTX)的确定 将
EL10 细菌粗提液过 C18固相萃取柱，用 0 1%乙酸
溶液洗脱，过柱清液经冷冻干燥器冻干后，用高效液
相色谱流动相溶解。溶解液用 3 000 分子量的超滤
离心管(Millipore)离心过滤，收集的过滤液直接用
于 HPLC分析。
HPLC分析条件:流动相:含 2 mmol /L 庚烷磺酸
钠离子对的 0 05 mol /L 磷酸氢二钠、磷酸二氢钠的
缓冲溶液，pH6 8;TTX标液:0 25 μg /mL;加标样品:
含 0 25 μg /mL的 TTX标准品;检测波长:205 nm;流
速:0 4 mL /min;柱温:常温;进样体积:20 μL。
1 2 5 EL10 的形态特征及生理生化特征检测 参
照《常见细菌系统鉴定手册》［7］中的方法进行，生长
曲线中的菌体密度用 OD600表示。
1 2 6 EL10 菌株的分子生物学鉴定 提取 EL10
菌株 DNA，采用通用引物扩增菌株 16S rDNA 基因
序列。正向引物序列为 27f:5′-GAGAGTTTGATCCT-
GGCTCAG-3′;反向引物序列为 1495r:5′-CTACGGC-
TACCTTGTTGTTACGA-3′。反应条件:95℃ 5 min，
94℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 45 s，30 个循环。将
PCR产物送上海美季生物技术有限公司测序，将
16S rDNA提交到 GenBank的 BLAST数据库进行序
列对比。
2 结果
2 1 菌株筛选
从黄鳍东方豚卵巢中共筛选出 59 株菌株。其
中有 11 株菌的发酵粗提液可使小鼠出现中毒症状，
对其中毒性较强的 EL10 菌株发酵提取液进行
HPLC分析，结果(图 1)表明，EL10 菌株样品、加标
样品在 205 nm处与标准品出一致的波峰，其保留时
间分别为 5 363、5 354 及 5 353 min，初步证实
EL10 菌株提取物得到的毒性成分为 TTX。
图 1 EL10 菌株样品、加标样品及 TTX标准品色谱图
2 2 EL10 菌株的形态特征及生理生化特征
EL10 菌株的菌落呈棕褐色，不透明，直径 5 －
8 mm，表面湿润光滑，边缘整齐，老龄菌落为透明
状，为革兰氏阴性菌;菌体细胞为短杆状，无芽孢。
EL10 菌株的生长曲线如图 2 所示，生理生化特征结
果如表 1 所示。
图 2 EL10 生长曲线
2 3 EL10 菌株的分子生物学鉴定
16S rDNA是属种鉴定的分子基础，是细菌系统
分析研究中常用分子指标。本研究通过测定 EL10
菌株的 16S rDNA 基因测序，并将所得序列输入
GenBank中的 BLAST 程序进行比较分析，发现它同
Shewanella alga的同源性为 100%，因此可以确定该
菌为希瓦氏菌属。
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2010 年第 6 期 王少蓉等:产河豚毒素菌株的分离鉴定
表 1 EL10 菌株的生理生化特征
项目 结果
生长试验 2%NaCl +
5%NaCl +
7%NaCl +
10%NaCl +
pH5 +
pH6 +
pH7 +
pH8 +
pH9 +
pH10 －
生化特征 淀粉水解 －
明胶液化 －
硝酸盐还原 +
氧化酶 +
甲基红 －
过氧化氢酶 +
硫化氢 +
+生长;－不生长
3 讨论
目前，河豚毒素主要是从河豚鱼内脏中提取纯
化。该方法步骤繁琐、得率低、产品纯度不高，同时
因人工养殖的河豚鱼含毒极低甚至无毒，因此需消
耗及其大量的野生河豚鱼资源，破坏生态环境。目
前，国内外的研究者把目光转向了利用微生物发酵
技术来生产 TTX，其中找到能够实现持续、高效、稳
定的产 TTX微生物菌株是关键。
本研究从黄鳍东方豚卵巢中分离到一株产毒能
力较强的 EL10 菌株，通过 HPLC 分析，可初步认定
EL10 菌株的的发酵产物中含有 TTX，为河豚毒素的
微生物起源学说及其今后微生物源 TTX 的研究提
供了科学依据。对该菌进行了形态特征及生理生化
特征检测，并通过 16S rDNA 序列对其进行了分子
鉴定。16S rDNA序列是细菌分子鉴定的重要指标，
也是细菌快速鉴定的有效手段。通过 16S rDNA 序
列对比，该菌与 Shewanella alga 的同源性为 100%，
可认定为希瓦氏菌属。EL10 菌株的种属鉴定为今
后的发酵研究奠定了基础。
参 考 文 献
［1］Kao C. Tetrodotoxin，saxitoxin and their significance in the study of
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［3］李爱峰，于仁成，周名江，等.河豚毒素及其衍生物在织纹螺体内
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［4］Noguchi T，Hwang D，Arakawa O，et al. Vibrio alginolyticus，a tet-
rodotoxin-producing bacterium，in the intestines of the fish Fugu ver-
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