全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告·
收稿日期:2007-07-08
作者简介:张敬武(1982-),男,在读硕士,研究方向:RNAi抗乙肝病毒的研究
栾慎顺(1981-),男,在读硕士,研究方向:乙肝病毒感染相关受体的筛选
通讯作者:刘长梅、张景海,grssyphu@163.com
前言
乙型肝炎是由乙肝病毒(HapatitisBvirus,HBV)引起的、以肝脏炎性病变为主并可引起多器官损害的
一种传染病[1]。HBV进入细胞后,L(-)链被转录成 3.5Kb前基因组 RNA,这是 RNAi的最佳靶位点。
RNA干扰[2](RNAinterfering.RNAi)是近年来生命科学的重大发现。它指外源和内源性双链 RNA(double-
strandedRNA.dsRNA)在细胞内诱导同源序列基因表达受抑制的现象。RNAi技术现已被广泛的用于基因治
疗的研究,通过特异敲除致病基因,从而达到治疗的目的。利用 RNAi技术进行抗乙肝病毒的研究,试图找
到一种有效的抗乙肝病毒的方法。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 材料 干扰序列由奥科公司合成,HepG2.2.15细胞、E.coliJM109由本实验室保存。
pSUPER介导的RNAi抗乙肝病毒S基因的研究
张敬武 1 栾慎顺 2 杨倬 3 刘长梅 3 张景海 1
(1沈阳药科大学,沈阳 110016;2沈阳农业大学,沈阳 110161;3中国科学院微生物研究所,北京 100101)
摘 要: 目的 研究RNAi抗乙肝病毒的作用。方法 设计并合成一段针对HBVS基因的干扰序列及一段无关
的序列,克隆进 pSUPER载体中,分别构建 pSUPER-HBS、pSUPER-nonsense载体,然后将 pSUPER、pSUPER-HBS、
pSUPER-nonsense转染进HepG2.2.15细胞中,用ELISA方法对细胞上清中HBsAg、HBeAg进行检测。尾静脉注射 HBV
转基因小鼠,取血清检测。结果 pSUPER-HBS所表达的siRNA成功的抑制了HepG2.2.15上清及HBV转基因鼠血清
中的HBsAg、HBeAg,抑制率分别达到70%、51%以及60%、42%。结论 针对HBVS区的siRNA能明显抑制HBV的复制。
关键词: 乙肝 乙肝病毒 RNA干扰 S抗原
InhibitionofHepatitisBVirusbypSUPERsiRNAsTargetedto
HepatitisBvirusSgene
ZhangJingwu1 LuanShenshun2 YangZhuo3 LiuChangmei3 ZhangJinghai1
(1ShenyangPharmaceuticalUniversity,Shenyang110016;2ShenyangAgriculturalUniversity,Shenyang110161;
3InstituteofMicrobiology,ChineseAcademyofSciences,Beijing100101)
Abstract: objectiveStudytheefectofsiRNAwhichcanintibitreplicationofHapatitisBvirus.MethodsDesign
andsynthesizeasequencewhichtargetHapatitisB virusSgene,andanonsensesequence,clonedintopSUPER.
pSUPER、pSUPER-HBSandpSUPER-nonsenseweretransefectedintoHepG 2.2.15.Theplasmidswereinjectedinto
HBVmouse.ELISAwasusedtodetectedthechangeofHBsAgandHBeAgResultsThelevelsofHBsAgandHBeAg
weredramaticalydecreasedbypSUPER-HBS.HBsAgandHBeAgwerereducedby75% and48% inHepG2.2.15
supernatant,60% and 42% in HBV mousesserum respectively.Conclusion pSUPER-HBS、pSUPER-nonsense can
efectivelyinhibitreplicationofHBVinvitro.
Keywords: TypeBhepatitisHapatitisBvirusRNAinterference Santigen
2008年第1期
2008年第1期
1.1.2 试剂 pSUPER载体购买自 oligoengine公司;HBV转基因小鼠购自解放军第 458医院全军转基因
动物重点实验室;LipofectamineTM2000Reagent购买自 Invitrogen公司;HBsAg、HBeAg试剂盒购买自科华生
物技术公司、其他试剂均为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 靶位的选择和 siRNA的设计 以 HBVS基因作为靶序列,设计出可以表达 shRNA的 cDNA序列,
并在两端加上 BglⅡ、SalⅠ酶切位点,无意义对照序列由各碱基含量相同但碱基顺序不同,并与 HBV基因
组无同源性的序列组成:
SiHBS-S:gATCAAAAACTCAgTTTACTAgTgCCATTTgTTCTTCAAgAgAgAACAAA
TggCACTAgTAAACTgAgTTTTT
SiHBS-AS:TCgAAAAAACTCAgTTTACTAgTgCCATTTgTTCTCTCTTgAAgAACAAA
TggCACTAgTAAACTgAgTTTTT
1.2.2 RNAi载体的构建
1.2.2.1 插入片段的退火 将 2OD的正义、反义链分别用 10μl水溶解,混匀至一个 EP管中,加 2.5μl
annealingbufer煮沸 5min,自然冷却过夜,annealingbufer稀释 1000倍。
1.2.2.2 pSUPER载体的连接、转化 限制性内切酶 BglⅡ、SalⅠ线形化 pSUPER载体,然后使用 TAKALA
连接试剂盒将载体与退火片段连接过夜,连接产物电转化 E.coli感受态细胞 JM109,后铺于 Amp+的 LB平
板,置 37℃恒温箱培养过夜,次日挑选阳性克隆鉴定。
1.2.3 质粒转染 HepG2.2.15细胞 HepG2.2.15细胞[3]用含 10%FBSDMEM培养基培养在六孔板中,转染前
一天换液。pSUPER、pSUPER-HBS、pSUPER-nonsense分别转染 HepG2.2.15细胞。转染按 LipofectamineTM2000
Reagent说明书操作,每孔转染 2μg质粒。
1.2.4 细胞上清中 HBsAg、HBeAg的检测 在转染 48h、72h、96h之后,取 500μl的细胞培养基上清。ELISA
检测,450nm测 OD值。(按科华生物公司诊断试剂盒操作)
1.2.5 HBV转基因鼠血清中 HBsAg、HBeAg的检测 尾静脉注射质粒 4d后,眼眶取血检测。注射剂量为
50μg/只,共 3组,每组 5只[4]。
2 结果
2.1 构建载体鉴定及基因测序鉴定
摇菌提质粒,EcoRI、HindⅢ酶切,由于干扰序列的插入使 HindⅢ酶切位点缺失,没有条带切下的应
为阳性克隆,进一步送 Invitrogen公司测序鉴定,测序结果正确。
2.2 ELISA检测结果
表 1 HepG2.2.15上清中 HBsAg、HBeAg的检测
从表 1数据中可以分析得出,pSUPER-nonsense组与 pSUPER组相比没有明显的变化,说明无意义的
干扰序列及空载体并不能抑制 HBV复制,而 pSUPER-HBS组则具有明显的抑制作用,HBsAg抑制率平均
达到 70%、HBeAg抑制率平均达到 51%,其中转染后 72h抑制效率达到最高。
注:pSUPER为空白对照,pSUPER-nonsense为无意义干扰序列对照,pSUPER-HBS为实验组。表中的每一个数据均为 3次测量后的
平均结果
张敬武等:pSUPER介导的RNAi抗乙肝病毒S基因的研究 175
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第1期
从数值(表 2)分析,pSUPER、pSUPER-nonsense组免疫前后 没有发生有意义的变化,说明其对 HBV复
制无抑制作用,pSUPER-HBS对 HBsAg、HBeAg的抑制率分别为 60%、42%,对 HBeAg抑制率不高可能与小
鼠本身 HBeAg值不高有关。
3 讨论
乙肝是一种常见的疾病,中国大约有 2亿乙肝病毒携带者,现在治疗乙肝主要的药物有干扰素和核苷
类似物,这两类药物都有着明显的缺点。迄今为止,尚没有一种有效的治疗乙肝的特效药物出现。
通过 RNAi技术进行抗乙肝病毒的研究,从实验结果可以看出,在细胞水平和动物模型水平上,经过
siRNA的作用,HBsAg和 HBeAg表达水平均有了明显的下降,而对照组则无明显的变化。因此,RNAi技术
可以成功的抑制乙肝病毒的复制。RNAi作为一种新兴的治疗手段虽然有着巨大的优势,也有自身的缺点,
在大量的报道以及自身的研究实验中可以发现,RNAi对 HBV的复制有明显的抑制作用。但是很少达到百
分之百的抑制,随着时间的推移抑制效果也逐渐减弱,在针对其他基因的实验中,也有着类似的情况;还
有,siRNA作用如何延长以及导入;最重要的是安全性问题,会不会出现脱靶的情况,尤其是在基因治疗方
面,人类的基因组是巨大,如何避免“误伤”,这些都是亟待解决的问题[5]。
对于 RNAi抗 HBV的研究,现在处于起步阶段,未来还有很长的一段路要走,最可能出现的情况是
RNAi和其他治疗手段联合使用,从而达到治疗的目的。
致谢 感谢中国科学院微生物研究所的田波院士、刘长梅副研究员、杨倬博士在实验过程中的帮助。前两位作者对于本文具有相
同的贡献。
参 考 文献
1 潘蕾,黄长形,白雪帆.医学与哲学,2005,26(12):34~35.
2 HannonGJ.Nature,2002,418(6894):244~251.
3 WuHL.JVirol,1991,65:1680.
4 AntonPmccafey,HiroyukiNakai,KusumPandey.Naturebiotechnology,2003,21(6):639~643.
5 FangJia,Yi-ZhengZhang,Chang-MeiLiu.JournalofBiotechnology,2007,128:32~40.
注:小鼠为眼眶取血,离心取上清,稀释 10倍后检测,每个数据均为 5只小鼠的平均值,其中 pSUPER组一只实验中死亡,为 4
只平均值。
表 2 HBV转基因小鼠血清中 HBsAg、HBeAg的检测
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·信息交流·
法国经批准进行转基因作物田间种植试验
AgBiotechReporter2005年22卷3期16页报道:欧洲联合研究中心已批准法国进行转基因作物大田种植试
验的6项新的申请。这些作物包括了有利于杂草防治的抗除草剂转基因玉米品种。目前 MeristemTherapeutics
Pluriannulas公司正在对一个转基因玉米进行大田试验,藉以评价利用其生产保健品的性能。
已知法国过去一直是反对引进转基因作物的。但最近,法国欧洲事务部长诺埃尔·勒努瓦已建议法国政府对
转基因技术进行必要的投资,藉以配合迅速增长的工业需求。法国科学院也提倡在法国发展转基因作物,因为转
基因作物即不会影响人类健康,也不会污染环境。 汪开治
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