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研究报告

生物技术通报
BIOTECHNOLOGY
BULLETIN 2011年第 5期
便潜血单克隆一步法胶体金检测试卡的研制
姜燕
(沈阳大学生物与环境工程学院,沈阳 110044 )


摘
要:
采用鼠抗人血红蛋白 ( H b)单克隆抗体 1和胶体金标记鼠抗人血红蛋白 ( Hb)单克隆抗体 2及对照抗体羊抗鼠
IgG,利用双抗体免疫夹心反应原理特异性地结合人血红蛋白抗原, 在 5 m in内可得到胶体金显色结果的原理研制便潜血单克
隆一步法胶体金检测试卡,用于诊断因各种原因引起的消化道出血疾病。应用杂交瘤技术制备两株鼠抗人血红蛋白 (H b)抗
体 ( M cAb); EL ISA方法检测 M cAb效价; 免疫胶体金技术制备胶体金检测试卡。ELISA法检测 M cAb效价的结果显示, 鼠抗人
血红蛋白 ( H b)单克隆抗体 1效价为 1
3
2
103; 鼠抗人血红蛋白 ( H b)单克隆抗体 2效价为 1
1
6
103。试卡的灵敏度检测
结果显示, 检测粪便中血红蛋白的最低浓度为 0
1
g /mL; 试卡的特异性检测结果显示,特异性地结合人血红蛋白抗原, 而不
结合其他物种的血红蛋白 (如动物血红蛋白 ), 本法测便潜血不受维生素 C、含过氧化物酶的绿叶蔬菜及铁剂等干扰。大便潜
血一步检测法是一种快速、灵敏、简便的免疫层析检测法, 由于具有高度敏感性和特异性, 以及快速直观等优势, 对于诊断各
种原因引起的上下消化道出血疾病具有重要的定性判别意义。
关键词:
单克隆抗体 便潜血 胶体金 特异性 灵敏度
Preparation of Colloid Gold K it by One
Step Chromatography
Immunoassay for FecalOccult B lood Detection
J iang Yan
(College of B io logical and Environmental Engineer ing, Shenyang University, Shenyang 110044)


Abstrac:t
It was to prepare a co llo id go ld kit by one
step chrom atography immunoassay for the qualitative de tection o f fecal o ccult
b lood based on the princ iple of the high ly spec ific imm unochem ica l reac tions of antigens and antibod ies w hich are used for the ana lysis
o f specific hum an hem og lobin in human stoo l at idea l cut
o ff concentra tions. T o obta in m onoc lona l antibod ies(M cAb) o fm ouse aga inst
Hb from hybr idom a through lim iting dilution, then construct the kit. The titers ofM cAb w ere tested by enzym e linked immunoso rbent as

say. Resu lts showed tha t the titers of the firstM cAb ofm ouse anti
hum an hemog lob in w ere 1
3
2
103, the secondM cAb o fmouse an

ti
hum an hemog lob in were 1
1
6
103; the collo id go ld kit w ith the fo llow ing cu t
off concentra tions of 0
1
g /mL; the co llo id go ld kit
show ed good spec ific ityw ithout cross reaction w ith V itam in C, HRP, Fe. It proved that the co llo id go ld k it is a rapid, specific, sensitiv e
immunoassay su itab le for the de tection o f possible human hem og lobin in the stoo,l and it
s important to diagnose alim enta ry tract bleed

ing caused by any reasons.
Key words:
M onoclona l antibody( M cAb) Fecal occult blood Collo id go ld Spec ific ity Sensitiv ity
收稿日期: 2010
11
12
作者简介:姜燕,女,博士,副教授,研究方向:单克隆抗体的制备和鉴定以及口服 DNA疫苗的构建与表达; E
m ai:l yan66880394@ sin a. com
隐血试验是临床上诊断消化道出血的一项重要
项目, 也是普查筛选消化道肿瘤的有效手段。自
1861年采用化学法测定大便隐血试验以来, 国内一
直沿用着以血红蛋白触媒为特性与色原性底物 (联
苯胺、邻联甲苯胺和愈创木酯等 )反应的化学法。
化学法种类繁多,鉴于联苯胺具有强烈的致癌性,国
内现推荐使用邻联甲苯胺法、还原酚酞法、匹拉米酮
法、无色孔雀绿法和愈创木脂法等。其试验设计原
理基本相同,由于血红蛋白里的含铁血红素部分有
催化过氧化物分解的作用, 能催化试剂中的过氧化
氢, 分解释放新生态氧, 氧化上述色原物质显色。显
色的深浅反映了血红蛋白的多少,即出血量的大小。
然而,在实际应用中存在着以下两方面的问题:一是
此类方法检查便隐血存在许多干扰, 由于粪便成分
2011年第 5期 姜燕:便潜血单克隆一步法胶体金检测试卡的研制
差别很大,外源性的动物食品如含有动物血红蛋白、
肌红蛋白,其血红素的作用均可试验呈阳性;大量生
食蔬菜中含有活性的植物过氧化物酶也可催化过氧
化物分解,出现假阳性反应;口服铁剂及一些药物也
可出现假阳性反应, 另外病人大量服用维生素 C或
其他具有还原作用的药物,在试验中可使过氧化氢还
原,不能再氧化色原物质,也可使便潜血试验成假阴
性。二是实验室操作细节有差异, 如粪便的取材、试
剂配方、化学试剂稳定、观察时间、检验员对颜色判断
等,而使结果存在较大的差异。检测前有许多限制因
素,如检测前 3 d病人不可食用动物肉类、含过氧化
物酶的新鲜蔬菜、铁剂、维生素 C和某些药物等。而
且此法的灵敏度低,当粪便中血红蛋白含量达到 0
5

g /mL时, 才可检测出。故其仅可检验出 50% -
60%的直肠癌病人和 25% - 35%家族性息肉病人,不
能达到早期预报胃肠道出血性疾病的目的。总之,化
学法便潜血试验缺乏特异性和准确性,敏感度低。
单抗法是近年来为解决潜血试验特异性问题所
建立的一种免疫学方法, 所用抗体有抗人血红蛋白
抗体和抗人红细胞基质抗体两种, 前者可检出消化
道任何部位的出血, 而后者只能检出下消化道的出
血。我们研制的便潜血一步法检测试纸采用特异抗
人血红蛋白抗体, 利用双抗体免疫夹心反应原
理 [ 1, 2] ,可以特异性地结合人血红蛋白抗原, 而不结
合其他种类的血红蛋白 (如动物血红蛋白 ), 故用单
抗 [ 3, 4]便潜血试验法测粪便潜血时, 只有粪便中含
有人血红蛋白时试验才呈阳性,本法测便潜血不受
维生素 C、含过氧化物酶的绿叶蔬菜及铁剂等干扰,
在 5 m in内可得到明确的结果。大便潜血一步检测
法是一种特异、快速、灵敏、简便的免疫层析 [ 5, 6 ]检
测法, 用于检测人体粪便中可能出现的人血红蛋白,
这对诊断因各种原因引起的上下消化道出血疾病有
重要的临床意义。
1 材料与方法
1
1
材料
1
1
1
试剂 氯金酸 ( S igma公司 ) ;羊抗鼠 IgG抗
体 ( B iotech inc) , 血红蛋白标准品 ( S igm a公司 ) ,
RPM I 1640培养液, 胎牛血清 ( FBS, Hyc lone公司 )。
1
1
2
试验动物、细胞 BALB /C雌性小鼠, 6- 8
周龄, 购自北京军事医学科学院; SP2 /0细胞由本实
验室保存。
1
2
方法
1
2
1 小鼠免疫 以血红蛋白标准品免疫 8周龄
BALB /C小鼠 15只,免疫剂量 50
g /只, 皮下分点
注射。共免疫 3次,每次免疫间隔 3周。
1
2
2
脾细胞的制备 最后 1次免疫 10 d后, 摘
眼球取血分离血清,用间接 EL ISA法检测血清抗体
效价。若效价 > 10- 4即可用于细胞融合。浸泡碘
酒 5m in,无菌解剖取脾, 用 RPM I 1640培养液洗 2
次后,研磨通过 100目不锈钢网, 获得游离细胞, 再
用氯化铵法溶解祛除红细胞, 然后计数脾细胞并用
10% FBS
RPM I 1640培养液配制成 2
108个 /mL浓
度用于细胞融合。
1
2
3
SP2 /0细胞的培养与细胞融合 复苏 SP2 /0
细胞,于 10% FBS
RPM I 1640培养液中培养至对数
生长期后配成 4
107个 /mL细胞浓度;分别取配制
的上述浓度的脾细胞和 SP2 /0细胞各 1mL混合,使
其比例为 5
1; 然后加入 50% PEG 1 mL, 于 37
,
5% CO2孵箱内培养进行细胞融合。
1
2
4
融合细胞的培养及阳性杂交瘤的筛选与克隆
融合后的细胞置 37
, 5% CO2培养箱中以 HAT、
HT培养基选择培养。用间接 ELISA法以血红蛋白标
准品 5
g /mL 包被酶标板进行阳性筛选。对强阳
性、细胞生长旺盛的孔进行 3次有限稀释克隆化。
1
2
5 抗血红蛋白 M cAb测定与制备 给腹腔注
射液体石蜡 10 d后的小鼠腹腔注射克隆化细胞株
10
7个细胞, 7 d后抽取腹水,以硫酸胺盐析法提纯抗
体球蛋白,测其 EL ISA效价。以检测样品于 492 nm
波长测得吸光值与阴性对照的比值
2
1定为阳
性, 出现阳性结果的最大稀释倍数为 M cAb的效价。
1
2
6 胶体金试卡的制备
1
2
6
1
胶体金制备
将容积为 1 L三角烧瓶置
于加热磁力搅拌器上, 加入 500 mL蒸馏水, 加热搅
拌至 90
时,加入 0
5mL 10% 氯金酸溶液。将此
溶液煮沸 5 m in, 加入 1
00 mL 12% 柠檬酸三钠溶
液, 保持此溶液沸腾 10 m in, 把此溶液从加热磁力搅
拌器上取下。待温度将至 25
时, 装到洁净容器
内, 4
避光保存。
1
2
6
2
胶体金标记鼠抗人血红蛋白单克隆抗体 2
取 250 mL胶体金溶液,倒入 1个洁净烧杯内。逐
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Bulletin 2011年第 5期
滴加入 0
1mo l/L磷酸缓冲液 (共加入 25 mL) , 迅
速把 5 mL浓度为 1mg /mL的 鼠抗人血红蛋白抗体
2加入到胶体金溶液内, 晃动烧杯混匀, 室温中放置
15m in,迅速加入 5 mL 10%牛血清白蛋白溶液于胶
体金标记的抗体溶液中,同时摇动烧杯。将上述溶液
于室温中放置 15m in。把标记好的抗体溶液移入离
心管内, 12 000 r /m in离心 20m in,小心吸出上清液。
加入 200mL 0
01mol /L磷酸缓冲液将沉淀悬浮, 小
心吸出上清液。将沉淀溶于 25 mL 0
01mo l/L磷酸
缓冲液内,即为金标记的抗体溶液, 4
避光保存。
1
2
6
3
印膜 检测线抗体:鼠抗人血红蛋白抗体
1稀释至 2 mg /mL;对照线抗体: 印膜抗体溶液将羊
抗鼠 IgG抗体稀释至 2mg /mL。取一卷硝酸纤维膜
( 2 cm
50 m )置于印膜机的被动轮上,将膜及垫织
通过印膜槽固定到另一端的主动轮上。用两个干净
的塑料注射器 ( 10 mL)分别取 5 mL对照抗体和检
测线抗体,并置于自动推进器上。将两个塑料喷线
管的一端分别连到两个塑料注射器和两个印膜笔
上。印膜笔固定于印膜槽的上方, 两笔之间的距离
及抗体线在膜上的位置依据试纸条的距离确定;打
开主机开关,开始印膜。待整卷膜印完后,停机;将
喷涂好的膜取下,放入真空干燥箱内,抽干 6 h;将膜
置于密封塑料袋内,干燥保存待用。
1
2
6
4
试卡组装
胶体金标记鼠抗人血红蛋白
单克隆抗体 2用于包被玻璃纤维素膜上, 在真空下
干燥。喷膜是将鼠抗人血红蛋白单克隆抗体 1和羊
抗鼠 IgG多克隆抗体包被在硝酸纤维素膜上,也在
真空下干燥。将膜、吸水纸、上下不干胶纸依一定顺
序贴于磁白板上。最后切条、分装、封口, 置 4
保
存备用。
1
2
7
测试方法 大便样品采集应遵循临床标准
采样方法。采集的样品应立即进行处理。如不能及
时处理应 4
保存, 最长可保存 3 d。采集 100 mg
人体粪便样本,放入 1mL蒸馏水试管中, 然后将稀
释的样品滴加在试纸上。当样本向检测区及质控区
移动时,如果大便样本中含有血红蛋白,它就会和试
剂中的胶体金标记鼠抗人血红蛋白单抗 2组成抗
原 -抗体复合物, 再和检测区中的鼠抗人血红蛋白
单抗 1形成紫红色的色带。如果大便样本中无血红
蛋白,检测区中就不会有色带出现。在任何情况下,
质控区色带都应出现紫色条带, 质控区色带的出现
表明反应系统有效,否则为无效反应。
检测前应将未开封的检测试纸置于室温中, 使
试纸的温度达到平衡;试管标好记号后放在试管架
上, 取蒸馏水 1 mL放入试管中, 多点采集 (至少 6
个点 )大便标本 100 mg, 与试管中蒸馏水混匀。撕
开铝箔袋,将试纸条带有 MAX标记的一端插入制
备好的大便样本中, 尽量插入试管中的液体部分。
5m in判读结果。
1
2
8 灵敏度和特异性检测 灵敏度检测:用蒸馏
水将血红蛋白配制成不同浓度,检测试卡可检测出血
红蛋白成分的最低量。特异性检测: 经与鸡、猪、牛、
羊、马和兔不同种系来源的血红蛋白的样品及与辣根
过氧化酶 2 000
g /mL,维生素 C( 500
g /mL), 氯化
铁 ( 500
g /mL)交叉试验, 验证是否存在假阳性
反应。
1
2
9 稳定性检测 将试卡分别保存于室温 6、
12、18和 24个月, 并同时以 40
存放 2周 (相当于
4
保存 24个月 )进行稳定性检测。
2
结果
2
1
单克隆抗体的效价检测结果
经筛选获得了两株稳定分泌单克隆抗体的杂交
瘤细胞株, 3D4细胞株分泌的鼠抗人血红蛋白单抗
1, 9D5细胞株分泌的鼠抗人血红蛋白单抗 2。
ELISA方法检测小鼠腹水中抗血红蛋白单抗 1的效
价为 3
2
103,小鼠腹水中抗血红蛋白单抗 2的效
价为 1
6
103 (表 1)。
表 1
小鼠腹水中两株抗血红蛋白单抗效价的检测结果
M cAb
对照 样品稀释倍数 (
102 )
空白对照 阴性对照 2 4 8 16 32 64 128
1 0
018 0
010 0
528 0
496 0
445 0
360 0
242 0
101 0
055
2 0
001 0
022 0
493 0
470 0
365 0
171 0
132 0
072 0
035
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2
2 试卡检测结果判读
结果判读见图 1。阳性结果显示, 出现双条红
线表明大便潜血阳性。阴性结果显示, 只在上端出
现单条红线,表明大便潜血阴性。在无线或只有下
端线时,说明试验无效。
C.对照,羊抗鼠 IgG抗体包被; T.鼠抗人血红蛋白 ( H b)
单克隆抗体 M cAb包被
图 1 便潜血一步法胶体金试卡检测结果示意图
2
3
试卡灵敏度检测结果
本试验中试卡检测样品中血红蛋白最低浓度为
0
1
g /mL(表 2)。
表 2 便潜血一步法胶体金试卡灵敏度检测结果
H b浓度 (
g /mL) 结果
200 +
100 +
20 +
10 +
1 +
0
5 +
0
2 +
0
1 +
0
05 -
2
4
试卡特异性检测结果
经与不同种系来源的血红蛋白的样品交叉试验
证实,试纸条试验结果均为阴性 (表 3,表 4)。
表 3 便潜血一步法胶体金试卡特异性检测结果

来源不同物种的 Hb ( 500
g/mL) 结果
鸡
-
猪
-
牛
-
绵羊 -
马
-
兔
-
表 4 便潜血一步法胶体金试卡特异性检测结果

试剂 结果



HRP( 2 000
g /mL) -



维生素 C ( 500
g/mL) -



FeC l3 ( 500
g /mL) -
2
5
稳定性试验
经稳定性试验验证,该检测试卡在室温条件下
至少保存期为 18个月,抗体活性未受影响 (表 5)。
3 讨论
尽管单克隆抗体法能检测出微量血红蛋白, 但
对结、直肠癌阳性率并非 100% ,只有溃疡性癌肿才
会出血。另外,所有结、直肠癌中也不是每天出血,
所以单次送检粪便样本也影响了粪便隐血的阳性
率, 如能连续取样 3次粪便样本,追踪做隐血试验,
结果会更加真实可靠。本法可作为消化道恶性肿瘤
普查的初筛选。月经期内、肛裂或痔疮患者,其标本
可能造成假阳性结果。
表 5 便潜血一步法胶体金试卡的稳定性检测结果
H b浓度 ( ng/mL) 保存温度及时间
40
, 2周 RT, 6个月 RT, 12个月 RT, 18个月 RT, 24个月
ddH
2
O - - - - -
100 + + + + + /-
200 + + + + + /-
500 + + + + + /-


RT.室温; + /- .颜色模糊,结果不确定
着色标记物主要用于定性检测, 结果只有阴性
和阳性的差别,无法从量的角度给出更多的信息,也
容易引起误解。人体内一些物质的含量常变动于一
定的范围,仅给出阳性或阴性结果,远远不能满足临
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床需求,今后在提高灵敏度和特异性的同时,我们将
致力于胶体金着色标记物向定量、半定量检测及多
元检测方向发展的研究。本检测试卡合理引入阴性
对照, 由羊抗鼠 IgG抗体与标记的抗原复合物结合
而形成红色指示带,用于检测卡质量控制,无论阴性
阳性标本,该质控带均应显色, 这是检测卡质量合格
的标志;对照区如无红线出现, 该检测卡的检测结果
无效。我们研制的单克隆抗体便潜血一步法检测试
纸,利用胶体金标记作为目测颜色,定性或半定量检
测样品微量血红蛋白。具有操作简便、特异性强、快
速及敏感性高的特点,结果判断一目了然,对人体无
害,可在室温保存, 可广泛用于基层医院甚至家庭,
从而提高胃肠道出血患者的检出率, 为临床早期诊
断及时治疗争取时间, 值得广大临床实验室推广
使用。
参 考 文 献
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(责任编辑 李楠 )
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