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生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 7期
β2甘露聚糖酶产生菌的分离、鉴定及产β2甘露
聚糖酶最适条件的研究
黄俊丽　包凌霞　王贵学
(重庆大学生物工程学院 ,重庆 400030)
　　摘 　要 : 　以采集的土壤样品为试验材料 ,经过富集培养及分离纯化 ,筛选出 2株产β2甘露聚糖酶的菌株。采用摇瓶培
养分别测定其酶活力 ,其中 1株菌株酶活力较高 ,酶活力达 50. 36 U /m l。生理生化性质鉴定及 16S rDNA序列相似性结果表
明该菌为假单孢菌 ( Pseudom onas sp. )。产酶的最适条件研究发现 , 1 g/100 m l玉米粉 , 2 g/100 m l魔芋粉 , pH6. 0, 32℃为最优
产酶条件 ,酶活力达 185. 37 U /m l,是优化前的 3. 68倍。该菌产酶迅速 ,培养 12 h后已达产酶高峰。粗酶的性质研究发现 ,该
酶是一种酸性的甘露聚糖酶 ,作用的最适 pH为 4. 0,最适反应温度为 55℃;该酶的稳定性较好 ,在 pH4. 0～6. 0、温度为 40～
55℃保持较好的稳定性。
关键词 : 　β2甘露聚糖酶 　假单孢菌 　分离 　鉴定 　酶活性
Studies of the Isolation and Identif ication of Stra in withβ2mannanase
and Its Enzymology Properties
Huang Junli　Bao L ingxia　W ang Guixue
( College of B iological Engineering, Chongqing University, Chongqing 400030)
　　Abs trac t: 　Two strains which p roducedβ2mannanase were isolated from soil by enriching and isolating. A strain with the higher
enzyme activity of 50. 37 U /m l was obtained after the enzyme activity assay. The strain was identified as Pseudom onas sp. by morpho2
logical and physiological characteristics analysis and 16S rDNA BLAST. The op timal conditions for p roducingβ2mannanase by the
strain were determ ined 1 g/ l00 m l maizena, 2 g/100 m l konjak powder, pH6. 0 and the op timal temperature was 32 ℃, under which
the activity ofβ2mannanase was up to 185. 37 U /m l, 3. 68 times as before. The strain which rap idly p roducedβ2mannanase showed the
highestβ2mannanase activity after culturing for 12 h. The study of the enzymatic character of theβ2mannanase revealed that it was the
acidicβ2mannanase, and the op timal condition of the enzyme was pH4. 0 and 60℃, respectively. The activity ofβ2mannanase was sta2
ble at pH4. 0～6. 0 and 40～55℃1
Key wo rds: 　β2mannanase　Pseudom onas sp. 　 Isolation　 Identification　Activity
收稿日期 : 2008212226
基金项目 :重庆市科技计划项目 (2007AC1060) ,重庆大学重点实验室对本科生开放创新基金
作者简介 :黄俊丽 (19742) ,女 ,副教授 ,主要从事微生物分子学研究 ; E2mail: huang_junli@126. com, Tel: 023265120497　　β21, 42D2甘露聚糖酶 (β21, 42D2mannanase, EC3. 2. 1. 78) ,简称β2甘露聚糖酶 ,是一类能水解含有β21, 42D2甘露糖苷键的甘露聚糖 ,均一甘露聚糖、葡甘露聚糖和半乳甘露聚糖等的半纤维素酶类。β2甘露聚糖酶广泛存在于自然界中 ,在动物、植物和微生物中均发现该酶的存在。但目前商业化生产或接近商业化生产的β2甘露聚搪酶来源于微生物 ,尤其是细菌和真菌。微生物来源的 β2甘露聚糖酶有着成 本低、活性好、来源稳定、作用温度和 pH范围广及容易提取等优点 ,因此微生物来源的β2甘露聚糖酶已成为国内外研究的重要方向。该酶用途广泛 ,能分解魔芋葡甘露聚糖 ,生产能促进双歧杆菌生长、改善肠道菌群结构的魔芋低聚糖 ;可作为工具酶用于天然多糖类结构的分析 ;在造纸工业中 ,与β2木聚糖酶等半纤维素降解酶类协同使用 ,能除去纸浆中的半纤维素 ,改善纸质 ;在纺织工业中用于纤维中半
2009年第 7期 　　　黄俊丽等 :β2甘露聚糖酶产生菌的分离、鉴定及产β2甘露聚糖酶最适条件的研究
纤维素的降解 ,能有效去除纺织品所粘附的多余染
料 ;在饲料工业中用作酶添加剂 ,起到消除抗营养因
子的作用 [ 1～3 ]。但目前低产和高成本限制了其应用
范围和规模 ,能改变这种状况的最重要的途径之一
是筛选和培育高活力β2甘露聚糖酶的高产菌株。
本研究从土壤中分离出产β2甘露聚糖酶的优
良菌株 ,并进行了鉴定 ,同时通过优化产酶条件提高
β2甘露聚糖酶的产量 ,为生产应用和后续研究提供
理论依据。
1　材料与方法
111　样品来源
土壤样品从四川、重庆等地采集。
112　主要试剂
NTP溶液、PCR缓冲液和 MgCl2 溶液 (天为时
代科技有限公司 ) ,琼脂糖 (北京鼑国生物技术有限
责任公司 ) , 1. 5 kb DNA Ladder(北京博大泰克生物
基因技术有限公司 ) , DNA 凝胶回收试剂盒、
pMD182T Vector克隆试剂盒及 Taq DNA聚合酶及
其缓冲液 (大连宝生物工程有限公司 TaKaRa)。
魔芋粉 (重庆农产品市场 ) ,甘露糖 (北京鼑国
生物技术有限责任公司 ) ,胰蛋白胨、酵母膏 (北京
奥博星生物技术责任有限公司 ) ,琼脂粉 (青岛水产
品加工厂 ) , 3, 52二硝基水杨酸 (DNS) (上海化学试
剂公司 ) ,其他试剂均为国产分析纯。
113　主要仪器
Apectrum lab 752S紫外可见光分光光度计 (上
海市棱光技术有限公司 ) , J220XP高速冷冻离心机
(美国 BECKMAN公司 ) ,恒温摇床 (上海福玛实验
设备有限公司 ) , PCR热循环仪 ( Thermo Hybaid) ,
Versa Doc 1000凝胶成像系统 (B io2Rad laboratories
Co. LTD) , 70型离子交换纯水器 (上海南华医疗器
械厂 ) , A IR TECH 超净工作台 (苏净集团安泰公
司 )。
114　培养基
富集培养基 :魔芋粉 2 g,酵母膏 0. 5 g,蛋白胨
0. 3 g, NaCl 0. 5 g,蒸馏水 100 m l。
选择性分离培养基 :蛋白胨 1 g,牛肉膏 3 g,
Nacl 5 g,魔芋粉 10 g,琼脂 20 g,蒸馏水 1 000 m l,
pH7. 0～7. 2。
发酵产酶培养基 :魔芋粉 2 g,蛋白胨 1 g,酵母
粉 1 g, pH7. 0～7. 2,加水至 100 m l, 32℃, 150 r/m in
振荡培养 12 h。如无特殊说明 ,甘露聚糖酶的制备
均采用此培养基。
基本培养基 : Na2 HPO4·12H2 O 0. 4 g, KH2 PO4
0. 03 g,MgCl2·6H2 O 0. 06 g, CaCl2·2H2 O 0. 3 g, Fe2
SO4·7H2 O 0. 001 g, Na2 CO3 0. 25 g,加水至 100 m l。
115　方法
11511　富集培养 　称取 10 g土壤样品于 250 m l锥
形瓶中 ,加入 100 m l蒸馏水 ,振荡混匀 ,取 1 m l土壤
悬液接种到富集培养基中 , 32℃, 150 r/m in振荡培
养 24 h。
11512　菌株的分离纯化与保藏 　取 1 m l富集培养
液 ,进行梯度稀释后均匀地涂布在 LB培养基平板
上 , 32 ℃倒置培养过夜 ,根据菌落的颜色和形态挑
取单菌落进行纯化培养。斜面 4 ℃保存备用。
11513　菌株的初筛 　将筛选得到的单菌落点接于
选择性分离培养基上 ,倒置培养 24 h后 ,用 1. 0 g/L
刚果红溶液染色 30 m in,产β2甘露聚糖酶的菌落周
围形成透明的空斑 ,背景是红色 ,空斑的大小可以初
步检测酶活的高低。
11514　菌株的复筛 　挑取平板上透明圈明显的单
菌落 ,连续划线分离。挑取纯化的单菌落接入 LB
液体培养基中 , 32℃、220 r/m in摇床培养 12 h后用
DNS法测定酶活 ,作为进一步筛选的依据。
11515　培养方法和粗酶液的制备 　将斜面保藏的
菌种活化 ,接入到 LB 液体培养基中 , 32℃、150 r/
m in培养 12 h,按 1∶100的比例接种到发酵培养基
中 , 32℃、220 r/m in培养过夜收集发酵液 , 4℃下
5 000 r/m in离心 10 m in,收集上清液为粗酶液。
11516　甘露聚糖酶活力测定 　 ( 1)甘露糖标准曲
线的绘制 :分别取 0. 1, 0. 2, 0. 3, 0. 4, 0. 5, 0. 6, 0. 7,
0. 8, 0. 9, 1. 0 m l甘露糖标准溶液于试管中 ,加水补
足至 1. 0 m l。加入 3. 0 m l DNS试剂 ,沸水中显色 5
m in,冷却至室温后 ,加水定容至 25 m l,充分混匀。
于 550 nm 处测定吸光值 (OD550 ) ,以甘露糖质量
(mg)为横坐标 X,吸光值 (OD550 )为纵坐标 Y,绘制标
准曲线。 (2)甘露聚糖酶活力测定 :将发酵液于 5 000
r/m in离心 10 m in,去除菌体和杂质 ,上清夜为粗酶
液。取 0. 1 m l适当稀释的粗酶液 ,加入 0. 9 m l 0. 5%
(w / v)甘露聚糖溶液 (用 pH值 4. 0 Na2 HPO4 2柠檬酸
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 7期
缓冲液配制 ) , 55℃下保温 30 m in。加入 3 m l DNS试
剂 ,在沸水中煮沸 5 m in,冷却后加水定容至 25 m l,混
匀后在波长 550 nm下测定还原糖含量 (mg/m l,以甘
露糖计 )。以有底物无粗酶液为空白试验。甘露聚
糖酶活力计算公式 :
β2甘露聚糖酶活力 (U /m l) =
生成甘露聚糖的量 (μg)
30 m in ×0118 mg/μmol ×所用的酶量 (m l)
在上述条件下 ,一个酶活力单位定义为每分钟
产生相当于 1μmol D2甘露糖的酶量。
11517　菌株的鉴定 　采用 LB 液体培养基培养 8
～12 h,离心收集菌体 ,采用 CTAB法提取细菌总基
因组 DNA [ 4 ]。采用细菌 16S rDNA通用引物 : 27F:
5′2AGAGTTTGATCCTGGCTCAG23′, 1492R: 5′2TAC2
CTTGTTACGAC2TT23′扩增目标菌的 16S rDNA 序
列。PCR扩增反应条件 : 94℃预变性 5 m in, 94℃变
性 1 m in, 52℃退火 1 m in, 72℃延伸 1. 5 m in, 35个
循环 , 72℃延伸 10 m in。PCR 产物经琼脂糖凝胶电
泳回收纯化后与载体 pMD182T连接 ,转化大肠杆菌
JM109,并测序。采用 BLAST软件对序列进行同源
性比较 ,并结合其生理生化特征进行鉴定。
2　结果
211　产酶菌株的筛选
从土壤样品中分离得到 9株供试菌株 ,根据刚
果红染色后生成透明圈的大小筛选出 2株β2甘露
聚糖酶高产菌株 ,如图 1所示。将初筛得到的菌株
图 1　β2甘露聚糖酶水解圈
进行发酵产酶试验 ,按常规方法测其酶活力 ,其中 1
号菌株的酶活力达 50. 36 U /m l,明显高于 2号菌株
的产酶活力 ,为本研究的供试菌株。
212　酶活力标准曲线的绘制
按照 1. 5. 6所述方法绘制标准曲线 (图 2)。
图 2　甘露糖标准曲线
213　产酶菌株的鉴定
以 1号菌株的 DNA为模板 ,细菌的通用引物
扩增 16S rDNA序列 , BLAST比对发现 ,该序列与
Pseudom onas sp. 的 16S rDNA 序列同源性高达
99%。该菌为直或微弯的杆菌 ,不呈螺旋状 ,不产芽
孢 ,革兰氏阴性 ,以单极毛或数根极毛运动 ,需氧 ,不
产黄单胞色素。上述结果表明该菌为假单胞菌。
214　菌株产酶条件的优化
为了提高该菌株的产酶能力 ,就不同碳源和氮
源对酶活性的影响进行了研究。以无机盐溶液为基
础配方 , 1 g /100 m l蛋白胨为氮源 ,进行产酶试验 ,
其中 1 g /100 m l魔芋粉诱导的β2甘露聚糖酶产量
最高 (图 3)。
1. 葡萄糖 ; 2. 淀粉 ; 3. 纤维素 ; 4. 魔芋粉
图 3　不同碳源对产酶活力的影响
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仍以无机盐溶液为基础配方 , 2 g /100 m l魔芋粉为碳
源 ,对不同氮源对产酶的影响进行了研究 ,其中 1 g/
l00 m l玉米粉最有利于产酶 ,产酶量高达 83. 38 U /
m l, 1 g/ l00 m l蛋白胨为氮源的产酶量次之 (图 4)。
1. 酵母粉 ; 2. 蛋白胨 ; 3. 豆饼粉 ; 4. 玉米粉 ; 5. NH4SO4; 6. NaNO3
图 4　氮源对产酶活力的影响
不同温度条件下的酶活力测定结果表明 , 32 ℃
培养时产酶量最高 ,达到 80. 65 U /m l, 37℃时酶活
力最低 (图 5)。培养基的起始 pH对β2甘露聚糖酶
的产生影响较大 ,将 pH分别调至 5. 0、6. 0、7. 0、8. 0
和 9. 0进行培养 ,表明产酶最适 pH为 6. 0,随着 pH
值的增加 ,酶活力呈降低趋势 (图 6)。
图 5　温度对β2甘露聚糖酶活力的影响
图 6　pH值对β2甘露聚糖酶活力的影响
215　产酶的时间过程
采用优化后的发酵培养基配方培养目标菌株 ,
进行产酶时间过程研究。接菌后 3 h开始定期取
样 ,按常规方法测定酶活力。在培养初期菌体浓度
小 ,培养基粘度很大 ,魔芋粉中的多聚糖不能得到充
分利用 ,酶活力极低。随着培养时间增加 ,该菌产酶
迅速 ,魔芋粉中的多聚糖逐渐生成易溶的低聚糖和
单糖 ,培养基粘度降低 , 9 h后产酶量迅速增加 ,到
12 h酶活力已达到最高峰 ,继续培养酶活力开始逐
步下降 (图 7)。这一结果比国内外文献报道的产酶
时间短 [ 5 ]。
图 7　产酶的时间过程
216　粗酶的性质
21611　pH对酶活力及稳定性的影响 　不同 pH对
酶活力的测定结果显示 ,酶作用的最适 pH为 4. 0,
酶活力为 61. 50 U /m l,表明该酶是一种酸性甘露聚
糖酶。pH5. 0时 ,酶活力急剧下降 ,在 pH8. 0～9. 0
时酶活力趋于零。将酶液与上述不同 pH缓冲液混
和 , 40℃保温 4 h后 ,测定残余酶活力 ,在 pH4. 0～
6. 0较稳定 ,随着 pH值的增加酶稳定性逐渐降低
(图 8)。
图 8　pH对β2甘露聚糖酶活力及稳定性的影响
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21612　温度对酶活力及稳定性的影响 　不同温度对
酶活力的测定结果表明 ,酶的最适反应温度为 55℃,
酶活力达 73. 00 U /m l。将粗酶液在不同温度下保温
15 m in后 ,测定 50℃条件下的酶活力。在 40～55℃
酶活力保持稳定 ,酶活力维持在 62. 70 U /m l左右 ,表
明该酶的稳定性较好 ,稳定范围较宽 (图 9)。
图 9　温度对β2甘露聚糖酶活力及稳定性的影响
3　讨论
近年来 ,随着对自然界半纤维素资源的开发和
甘露寡糖生理功能的发现 ,β2甘露聚糖酶的研究和
开发已进入一个新阶段 ,在食品、医药、饲料、造纸、
纺织、洗涤、石油开采等领域得到了广泛运
用 [ 1, 6～8 ]。目前已报道的产β2甘露聚糖酶的微生物
有很多 ,但主要集中在地衣芽孢杆菌 ,枯草芽孢杆
菌 ,欧文氏杆菌等常见菌株 ,对假单胞菌产β2甘露
聚糖酶报道相对较少。
本研究采用土壤样品 ,经富集培养后采用刚果
红染色初筛和液体培养验证酶活的方法筛选到酶活
较高的菌株 ,经生理生化特征鉴定及 16S rDNA序列
相似性比较确定该菌为假单孢菌 ,丰富了产β2甘露
聚糖酶的菌株体系和酶系组分。经过简单的产酶条
件的优化 ,结果表明以 1 g/ l00 m l玉米粉 , 2 g/100 m l
魔芋粉 , pH6. 0, 32℃为最优产酶条件 ,酶活力达
185. 37 U /m l。该菌产酶迅速 ,培养 12 h已达产酶
高峰 ,与其他研究报道相比 ,达到产酶高峰的时间较
短 [ 5 ]。该酶是一种酸性的β2甘露聚糖酶 ,目前国内
外对不同菌株来源的β2甘露聚糖酶的研究主要集
中在碱性 [ 1 , 9 ]和中性酶 [ 10 , 11 ] ,而有关酸性 β2甘露
聚糖酶的报道较少。该酶的 pH 稳定性较好 ,在
pH4. 0～6. 0较稳定。作用温度范围较宽 ,在 40～
55℃酶活力保持稳定 ,有很好的研究和应用价值。
但目前来看 ,该酶的制备成本还太高 ,离实际应用的
要求还有相当长的一段距离。今后除了需要进一步
筛选活力更高、稳定性更好的菌种之外 ,还应结合基
因工程的方法利用具有高效表达启动子的载体构建
新型高效表达基因的工程菌 ,并选择合适的宿主菌
进行表达以提高β2甘露聚糖酶的产量以达到实际
应用的目的。
参 考 文 献
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